本发明涉及含有对pH变化敏感的键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶。该指示剂分子是通过将丙烯酰胺和所述指示剂分子进行聚合而键合的。本发明还涉及制备含有对pH变化敏感的键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶的方法，该方法包括将丙烯酰胺和所述指示剂分子聚合的步骤。 US-A4，194，877（J.I.Petersen）中公开了含有对pH变化敏感的键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶，染料指示剂用于pH测定。这种染料表现为一种弱酸，以酸和碱的形式存在，各具有不同的光吸收光谱。随着溶液pH的变化，它们各自的光吸收峰相对大小按照酸式染料和碱式染料的相对浓度的改变成正比地变化。因此，在这些吸收峰波长中相对于任一处的染料溶液的光吸收量都可用于测定该处溶液的pH值。
诸如酚红、氯酚红、甲酚红等指示剂染料在含水介质中都是可溶的。
为利用静止探头进行pH测定，可使染料指示剂分子与诸如丙烯酰胺之类的单体聚合，使之键合在所形成的聚合物基质上。
J.I.Petersen等在分析化学杂志（Analytical Chemistry）Vol.52，856-869（1980）上介绍了一种用于生理目的的纤维光学pH探头。该探头被设计成，例如可插入人体静脉的细管。管内放置了含有键合染料指示剂分子地聚丙烯酰胺凝胶体。光学纤维与凝胶体接触。在探头的末端装有反射镜，用以反射从光学纤维射出、并通过凝胶体的光。探头的管套设计成半渗透的壁或装有开孔，使待测分子（例如O2、CO2或氢气）扩散进入凝胶体。所以，凝胶体与待测介质相联系，开式亲水性凝胶结构使得离子能扩散到共价键合在聚合物基质上的染料分子中。
pH可表示为以下变量的函数。这些变量是;指示剂的pK值、染料总浓度（T）和碱式指示剂的浓度（A-），其函数关系见式（1）：
pH = pK - log [ ((T))/((A-)) - 1 ] (1)
（Henderson-Hasselbalch方程）
碱式染料的吸收峰波长处的透光度与pH的关系可由Henderson-Hasselbalch方程与式（2）所示的朗伯比尔（Lambert-Beer）方程联立来求得：
log( (IO)/(I) ) = (A-).L.ε (2)
I和I0为吸收波长处的透光度，I0表示在不存在任何碱式染料情况下的透光度。L为通过染料的有效光径长度，ε为碱式互变异构体的吸收系数。
因此，用Labert-Beer方程替换Henderson-Hasselbalch方程中的（A-），就可得到方程（3）：
p H = p K - l o g ［( T ) · ε · Ll o g (IOI)- 1 ］ ( 3 )]]>
式中，pH与I有关，即与有待经过光导纤维探头测定的值有关。常数（T）、ε、L和I0可合并为一个常数。
另外，pK值是一常数，因此，测定I便直接得到pH值。
健康人血的pH值约为7.38。偏离了正常的pH值（7.38），表明人处于病态。人血具有pH缓冲液的性质，所以，在0.2至0.5的范围内偏离正常值表明人正处于严重病态。因此，有必要灵敏而精确地测定pH的偏离范围。
现已公认，在具有恒定pH值的水溶液中用纤维光学pH探头测定若干天后，显示出高达0.4单位的pH值移位。所述pH探头装有含键合染料指示剂分子的聚丙烯０纺骸Ｒ虼耍饫嗵酵凡荒苡美床舛ㄈ颂宓膒H，例如，不可用于测定手术期间和若干天后的pH。
因此，本发明的目的在于提供含有键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶，所述凝胶可用于精确地测定pH，尤其是在若干天内测定。
本发明的一个方面是提供了一种制备含有对pH变化敏感的键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶的方法，该方法包括使丙烯酰胺和所述指示剂分子进行聚合的步骤，其特征在于：所述凝胶用水溶液处理一段时间，直至因这种处理而引起的凝胶pK值移位结束为止。
本发明的另一方面是提供一种含有对pH变化敏感的键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶，所述指示剂分子是通过将丙烯酰胺和所述指示剂分子聚合而键合的。所述聚丙烯酰胺凝胶的特征在于：聚丙烯酰胺凝胶中可被具有预选pH值的水溶液水解的特殊酰胺基都完全水解了。
已经发现，在显示pH值移位时所产生的误差是由于聚丙烯酰胺凝胶的pK值的移位而引起的。可以设想，用羟基取代氨基时会使聚丙烯酰胺基质的若干氨基水解。所形成的羧酸基可能与指示剂中OH基团的氢原子形成分子内氢键。这种取代导致键合指示剂分子的pK值的变化。例如，在用磷酸盐缓冲水溶液进行处理的三周中，键合在聚丙烯酰胺上的染料指示剂酚红的pK值从7.8升至8.3。在三个星期后，pK值就不再发生变化了。因此，根据本发明对通常制备的含键合染料指示剂分子的聚丙烯酰胺凝胶进行“预调节”，可使凝胶保持恒定的pK值。
按本发明用水溶液处理聚丙烯酰胺凝胶的方法，其中所述水溶液还包含α-氨基羧酸，尤其是组氨酸，最好是L-组氨酸，和/或赖氨酸，最好是L-赖氨酸。现已公认，采用α-氨基羧酸，例如L-组氨酸和/或L-赖氨酸，pK值仅在0.1的范围内移动。已经发现，在按照本发明方法进行处理的过程中，α-氨基羧酸被键合到聚合物基质上。可以设想，氨基，优其是位于指示剂分子中OH基团邻位的氨基未被羟基取代，而是参与同α-氨基羧酸的化学键合。因此，指示剂分子中在羟基邻位的羧酸基团（COOH）不可能形成分子内氢键。例如，用含L-赖氨酸的水介质处理含键合酚红的聚丙烯酰胺，三周后，导致pK值由7.8升至7.9。在进行了所述时间的处理后，这种经“预调节”的凝胶具有恒定的pK值。若用其它水溶液进一步处理，会得到同样的结果。这类经过“预调节”的凝胶尤其可用于生物样品的pH测定，因为pK值（7.9）在这类样品的pH值范围内。因此，可以得到含有这类“预调节”凝胶的高灵敏度的纤维光学pH探头。
另外，含键合L-赖氨酸分子的凝胶对诸如镁离子之类的二价阳离子不敏感。二价离子与通过水解酰胺基获得的羧酸基（COO-）构成复合物（P.Mallo等人：“Extent and effects of hydrolysis in polyacryla-mide gel”，Polymer Communications，Vol.36，August 1985）。
若羧酸基（COO-）与二价阳离子的复合物比羧酸基（COO-）和指示剂分子中羟基的氢之间的分子内氢键更为稳定，则这种分子内的氢键就断开。结果，pK值就发生变化。
因此，经组氨酸和赖氨酸处理的聚丙烯酰胺凝胶（羧酸基不邻位于指示剂分子的OH基）对二价阳离子不敏感。
现根据附图说明本发明的若干实施方案，其中：图1和图2表示按本发明方法处理的聚丙烯酰胺凝胶的pK移位范围。
实施例1
将4.265克（60.0mM）丙烯酰胺、0.0962克（0.6mM）双丙烯酰胺和0.05克（0.1412mM）酚红溶解于10ml 50℃的水中。冷却至0℃后，加入0.0483克（0.2118mM）固态过硫酸铵。将混合物于40℃下保持7小时。这段时间之后，得到呈反应容器形状的凝胶。
实施例2
在pH为7.1的水溶液中，加入由例1制得的凝胶片。将凝胶片于45℃下保温若干天;所述凝胶片的起始pK值为7.78。
表1：在不同水溶液中，于45℃下保温后所得的含键合酚红的聚丙烯酰胺凝胶的pK值
溶液 保温时间 pK
（天）
氯化钠，150mM 6 8.02
NaCl，125mM;碳酸氢盐25mM 21 8.20
磷酸盐缓冲液，67mM 6 8.10
维生素，75mM 6 7.98
乳酸钙，75mM 6 8.07
柠檬酸钠，150mM 6 8.19
L-组氨酸，150mM 6 7.84
L-赖氨酸，150mM 6 7.79
通过将二氧化碳（O2）和氮气（N2）的气体混合物通入碳酸氢盐溶液，将该溶液的pH调节至pH7.1。用NaOH或HCl将其它溶液的pH值也调节至7.1。
借助于Hewlett-Packard 8451A二极管阵列分光光度计测定pK值。
从表1可见，经过用含α-氨基羧酸、L-赖氨酸或L-组氨酸的溶液处理的凝胶片，其pK值的移动范围比其它试样的移动范围小。
图1显示了保温时间和凝胶试样pK移动范围的关系。所述凝胶试样是经磷酸盐缓冲溶液和含L-赖氨酸溶液处理的。
如表1所示，赖氨酸处理试样的移动没有磷酸盐缓冲液处理试样的移动显著。
在这两批试样内，在3周后，pK值的移动结束，并达到其最终pK值。
用高达55℃的高温进行处理，可使达到最终pK值的时间缩短。此外，在pH为7至12的溶液中进行处理，也可使达到最终pK值的时间缩短。用缓冲溶液处理可以保证凝胶试样在贮藏时保持恒定的pH值。
实施例3
按例2所述，将凝胶片先在45℃的磷酸盐缓冲液中（pH为7.1）保温8周，然后将凝胶片于45℃在碳酸氢盐缓冲液（pH9）中保温。该碳酸氢盐缓冲液含25mM碳酸氢盐和125mM NaCl。
如上所述，将第二批凝胶试样先在45℃下于L-赖氨酸溶液（pH7.1）中保温8周后再在碳酸氢盐缓冲液（pH9）中保温。
图2是所述凝胶片的pK值与保温时间的曲线图。
用磷酸盐缓冲液预调节过的、最终pK值约为8.4的凝胶片在最初3天的处理时时内，其pK值在最小的范围内移动。3天后，pH值就不再移动。
就最初经过L-赖氨酸溶液保温处理的凝胶片而言，其pK值不再产生移动。该凝胶片的pK值对水介质种类的变化及所述介质pH值的变化均不敏感。
因此，最初经过保温，即“预调节”的凝胶片可用于光导纤维pH探针，以精确测定pH。
实施例4
将装有聚丙烯酰胺凝胶的光导纤维pH探针插入含有碳酸氢盐的pH为7.32的缓冲溶液中（25mM碳酸氢盐，125mM NaCl）。所述凝胶含有键合酚红，并如例2所述，经过8周的“预调节”。将3mM氯化镁（MgCl2）加到该溶液后，产生了大约0.01的最小pH移动。该移动在测量装置的允许误差范围内。
因此，含有经赖氨酸“预调节”的凝胶的光学纤维pH探针对二价阳离子也是不敏感的。
实施例5
按例2所述，将聚丙烯酰胺凝胶于含有L-赖氨酸的溶液中保温，然后用水洗涤，并离心。重复进行这种处理六次，直至凝胶中不含非键合赖氨酸为止。用6N HCl处理由此制得的凝胶，并用气相色谱法分析。测得无水凝胶中L-赖氨酸的含量为1%（重量）。所以赖氨酸是经化学键键合在聚丙烯酰胺凝胶基质上的。