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1、(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201410710710.3 (22)申请日 2014.12.01 C07D 217/24(2006.01) A61K 31/472(2006.01) A61P 35/00(2006.01) A61P 9/10(2006.01) A61P 7/06(2006.01) A61P 25/00(2006.01) A61P 31/14(2006.01) A61K 31/355(2006.01) (71)申请人 李飞燕 地址 408400 重庆市南川区河滨南路16号2 单元 6-2 (72)发明人 李飞燕 (54) 发明名称 一种治疗肿瘤的化合物 。
2、(57) 摘要 本 发 明 提 供 了 一 种 用 作 治 疗 肿 瘤 的 化 合 物，其 以 下 述 结 构 式 所 示。 I。 (51)Int.Cl. (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书6页 (10)申请公布号 CN 104447549 A (43)申请公布日 2015.03.25 CN 104447549 A 1/1 页 2 1. 一种用于治疗肿瘤的化合物， 其特征在于其以下述结构式所示 ： I。 2. 权利要求 1 所述化合物的制备方法， 其特征在于包括下述步骤 ： (1) 取当归粉碎成粗粉 1000g， 加体积比为 5 30 倍的 45。
3、 95 体积 % 的甲醇 8000ml 提取 0.5 10 小时， 收集提取液， 过滤 ； (2) 取滤液回收甲醇至无醇味， 加水制成每 1ml 含 0.5g 生药的溶液 ； (3) 溶液通过 D 型大孔树脂柱吸附， 用乙醇水的混合液进行梯度洗脱， 流速按每小时 树脂体积的倍数计为 4.5BV/h， 洗脱液中乙醇浓度逐步由 5 体积 % 调整至 95 体积 %， 收集含 乙醇浓度在 30 体积 % 以上至 70 体积 % 以下的洗脱液， 弃去含乙醇浓度在 30 体积 % 至 70 体积 % 以外的洗脱液， 85以下减压回收溶剂并浓缩至在 60下相对密度为 1.60 1.85 的清膏， 用甲醇重。
4、结晶得式 I 化合物。 3. 权利要求 1 所述化合物在制备治疗肿瘤药物方面的用途。 权 利 要 求 书 CN 104447549 A 2 1/6 页 3 一种治疗肿瘤的化合物 技术领域 0001 本发明涉及食品和医药化学领域。更尤其涉及一种可作为作为蛋白激酶特别是 Raf-1的抑制剂的化合物。 本发明化合物可用于治疗各种紊乱和疾病， 特别是与蛋白激酶相 关的疾病， 如癌症、 心肌梗塞、 脑血栓、 贫血和丙型肝炎 （HCV） 等。 背景技术 0002 肿瘤的产生、 生长和代谢的许多过程是由激活的酪氨酸激酶引发的细胞信号通路 所调节。RAS（一种原癌基因， 因首先发现于大鼠肉瘤病毒而得名） 能对。
5、下游的几个受体酪 氨酸激酶 （RTKs） 进行调节。RAS 细胞信号通路的激活是人类癌细胞生长的关键步骤。RAS 通道的激活过程是通过 RAS 致癌基因的变异的激活导致的， 或者下游的 RAS 的影响因素造 成的。RAS 的激活也可以由不同的酪氨酸激酶的过度表达来实现。这些酪氨酸激酶的受体 包括上皮生长因子受体 （EGFR） 、 血小板源生长因子受体 （PDGFR） 和血管内皮细胞生长因子 受体 （VEGFR） 。 0003 大多数人类的肿瘤不仅由RAS变异产生， 还由于RAS信息传播通路被激活， 使得癌 细胞得以繁殖和存活而产生。 RAS可以调控某些能让细胞变异的RAF/MEK/ERK通路。。
6、 RAF激 酶是丝氨酸、 苏氨酸蛋白激酶， 这些激酶能在 RAS 的下游通路中起作用。RAS 将 RAF 配置在 细胞膜上， 在此， RAF引起激酶有丝分裂， 最终通过转录因子的磷酸化来实现基因表达。 这些 对肿瘤细胞的繁殖和产生起到重要的作用。 RAF激酶由A-RAF, B-RAF和Raf-1 (c-Raf)组 成。这些激酶在从 RAS 到下游激酶的信号传导过程中起到关键作用。下游激酶包括 MAPK、 ERK、 (MEK)-1/2 和ERK-1/2。 据报道， 70%的恶性黑素瘤， 33%的甲状腺乳头状癌是由B-RAF 激酶诱导生成， 但它对其它癌症的诱导几率较低。 B-RAF的V599E的。
7、变异形式可以激活体外 的人的黑素瘤细胞的 RAF/MEK/ERK 通路， 阻止黑素瘤细胞软琼脂生长， 但是对 V599E B-RAF 的RNA无作用。 此外， 在V599E BRAF的诱导下黑素细胞的传递激活了MAPK通路。 最近的研 究证明， Raf-1 和 B-RAF 参与内皮细胞凋亡， 因此血管新生对肿瘤的生长和代谢非常重要。 选择性地输送变异的 Raf-1 激酶到血管里能够诱导内皮细胞死亡， 从而阻止血管新生， 导 致肿瘤细胞死亡。老鼠在缺乏 B-RAF 和 Raf-1 的情况下， 在胚胎形成过程中死亡， 其部分 原因是大量缺失新生血管， 使得内皮细胞凋亡。在人体肿瘤细胞的异体移植模型。
8、中， Raf-1 的抑制剂可以抑制细胞繁殖和肿瘤生长。 0004 当归， 拉丁文名 ： Radix Angelicae Sinensis， 别名干归、 马尾当归、 秦哪、 马尾 归、 云归、 西当归、 岷当归、 金当归、 当归身、 涵归尾、 土当归多年生草本植物， 在中国分布 于甘肃、 云南、 四川、 青海、 陕西、 湖南、 湖北、 贵州等地， 各地均有栽培。当归的根可入药， 是最常用的中药之一。当归根含挥发油和非挥发性成分挥发油中的中性油成分有 ： 亚 丁基苯酞 （Butylidene phthalide） 、 - 蒎烯 （-Pinene） 、 - 蒎烯、 莰烯 （Camphene） 、 对。
9、 聚 伞 花 素 （p-Cymene） 、 - 水 芹 烯 （-Phellandrene） 、 月 桂 烯 （Myrcene） 、 别 罗 勒 烯 （Allo-ocimene） 、 6- 正 丁 基 - 环 庚 二 烯 -1,4（6-n-butyl-cycloheptadiene-1,4） 、 2- 甲基 - 十二烷 -5- 酮 （2-Methyl-dod ecane-5-one） 、 苯乙酮 （Acetophenone） 、 - 甜 说 明 书 CN 104447549 A 3 2/6 页 4 没药烯 （-Bisabolene） 、 异菖蒲烯 （Isoacroraene） 、 菖蒲二烯 （A。
10、coradiene） 、 花侧柏烯 （Chamigrene） 、 - 雪松烯 （-Cedrene） 、 藁本内酯 （Ligustilide） 、 正丁基四氢化酜内 酯 （n-Butyl-tetrahydrophthalide） 、 正丁基酜内酯 （n-Butyl-phthalide） 、 正丁烯酜内酯 （n-Buty- lidene phthalide） 、 正十二 烷 醇 （Dodecanol） 、佛 手 柑 内 酯 （Bergapten）等。 尚 含 其 他 成 分， 如 ： 豆 甾 醇 （Stigmasterol） 、谷 甾 醇 （Sitosterol） 、豆 甾 醇 -D- 葡 萄 糖。
11、 甙 （Stigma- sterol-D-glucoside） 、 十四醇 -1（Tetradecanol-1） 、 钩吻萤光素 （Scopletin） 等。此外， 还含有蔗糖 （Sucrose） 、 果糖 （Fructose） 、 葡萄糖 （Glucose） ； 维生素 A、 维生素 B12、 维生素 E ； 17 种氨基酸以及钠、 钾、 钙、 镁等 20 余种无机元素。 0005 本发明人惊奇地发现， 由当归提取的式 I 化合物， 用于治疗各种紊乱和疾病， 特别 是与蛋白激酶相关的疾病， 如癌症、 心肌梗塞、 脑血栓、 贫血和丙型肝炎 （HCV） 等。 发明内容 0006 一方面， 本发明。
12、提供了一种式 I 化合物， 其以下述结构式表示 ： I。 0007 优选式 I 化合物用于治疗各种紊乱和疾病， 特别是与蛋白激酶相关的疾病， 如癌 症、 心肌梗塞、 脑血栓、 贫血和丙型肝炎 （HCV） 等。 0008 本发明的第二个方面是式 I 化合物在用于治疗各种紊乱和疾病， 特别是与蛋白激 酶相关的疾病， 如癌症、 心肌梗塞、 脑血栓、 贫血和丙型肝炎 （HCV） 中的用途。 0009 本发明的第三个方面是式 I 化合物在用于治疗各种紊乱和疾病， 特别是与蛋白激 酶相关的疾病， 如癌症、 心肌梗塞、 脑血栓、 贫血和丙型肝炎 （HCV） 中的用途。 0010 本发明的第四个方面包括一种药。
13、物组合物， 其中既可以仅含有式 I 化合物， 也可 以同时含有一种或多种载体或赋形剂。 0011 本发明的第五个方面涉及一种治疗组合物， 其中含有式 I 化合物和一种或多种药 用载体和 / 或赋形剂。组合物优选含有式 I 化合物。 0012 本发明的第六个方面涉及一种饮料或食品， 其中含有式 I 化合物。优选食品中含 有式 I 化合物。 0013 在本发明中， 式 I 的化合物进行治疗所需的剂量与许多因素有关， 包括具体应用、 所用化合物的性质、 进行治疗的疾病的状态、 给药方式和病人的状况。通常， 每个病人给药 的日剂量是 0.1mg-2g ； 典型的日剂量是 0.5mg-1g ； 优选 5。
14、0mg-200mg。 0014 式 I 的化合物可以以常规方式和剂量使用。例如， 见 Goodman andGilman， 治疗的 药理学基础 (The Pharmacological Basis of Therapeutics， 1299)( 第 7 版， 1985)。所用 的具体剂量与进行治疗的疾病的状态、 受治疗者的状况、 给药途径以及其它如上所述的已 知因素有关。 0015 制备用于治疗所说的适应症的药物组合物， 是将式I的化合物(为方便起见， 下文 说 明 书 CN 104447549 A 4 3/6 页 5 称为 “活性化合物” ) 与一种或多种本领域所熟知的可药用或可兽药用载体和。
15、 / 或赋形剂混 合。 0016 当然， 载体必须是药物可接受的， 也就是与制剂中的其它任何成份都相配伍， 并且 必须对受治疗者无害。载体或赋形剂可以是固体或液体， 或两者都是， 并且优选制成化合 物为一个单位剂量的制剂， 例如， 一种片剂， 其中可以含有 0.5 -59重量比的活性化合 物， 或高达 100重量比的活性化合物。本发明中的制剂可以含有一种或多种活性化合物， 可以使用任何熟知的药学技术来制备， 基本上包括将组分混合， 可选择地包括一种或多种 辅助成分。 0017 本发明中的制剂包括适于口服、 直肠、 眼内、 口腔(例如舌下)、 肠胃外(例如皮下、 肌内、 真皮内、 静脉内 ) 和。
16、透皮给药的制剂， 虽然在任何具体的病例中， 最适合的给药途径 与所治疗的疾病的特性和严重程度以及所用特定活性化合物的性质有关。 0018 适于口服给药的制剂可以制成单个的单位， 例如胶囊、 扁囊剂、 锭剂、 或片剂， 其 中每一单位中含有预定剂量的活性化合物 ； 粉剂或粒剂 ； 在水或非水液体中的溶液或悬浮 液 ； 水包油乳液或油包水乳液。 这些制剂可以用合适的药物学方法制备， 其中包括将活性化 合物与合适的载体 ( 可能含有一种或多种如上所述的辅助成分 ) 混合这一步骤。通常， 本 发明中的制剂是这样制备的， 将活性化合物与液体或分散的很细的固体载体或既与液体又 与固体载体均匀而紧密地混合，。
17、 然后， 如果需要的话， 将得到的混合物定形， 例如制成一个 单位剂量形式的制剂。例如， 片剂可以通过将含有活性化合物的粉末或颗粒压片或铸模制 备到， 其中所述的粉末或颗粒中可选择地含有一种或多种辅助成分。压片可以通过将自由 流动的化合物例如粉末或颗粒在合适的机器中压制而成， 其中所述的粉末或颗粒中可选择 地混有粘合剂、 润滑剂、 惰性稀释剂和 / 或表面活性剂 / 分散剂。模制片可以通过将用惰性 液体粘合剂润湿的粉末状化合物在合适的机器中铸模来制备。 0019 适于口腔 ( 舌下 ) 给药的制剂包括活性化合物存在于调味基质中的锭剂， 调味基 质通常是蔗糖和阿拉伯胶或西黄蓍胶 ； 活性化合物存。
18、在于惰性基质例如明胶和甘油或蔗糖 和阿拉伯胶中的软锭剂。 0020 本发明中适于肠胃外给药的组合物通常包含活性化合物的无菌含水制剂， 制剂优 选与打算接受给药者的血液等渗。 虽然也可以通过皮下、 肌内、 或真皮内注射来达到给药效 果， 但是这些制剂优选静脉给药。 通 常， 可以通过将活性化合物与水或甘氨酸缓冲液混合， 然后将得到的溶液灭菌并且调到与血液等渗来制备这些制剂。 根据本发明的注射制剂通常 含有 0.1 -60 w/w 的活性化合物， 并且以 0.1ml/min/kg 的速度给药。 0021 适于直肠给药的制剂优选制成含有单位剂量的栓剂。 这些栓剂可以通过将活性化 合物与一种或几种常规。
19、固体载体， 例如椰子油混合， 然后将得到的混合物定形来制备。 0022 适于对皮肤局部给药的制剂或组合物优选制成软膏、 乳膏、 洗剂、 糊剂、 凝胶、 喷雾 剂、 气溶胶、 或油剂。 可使用的载体包括凡士林、 羊毛脂、 聚乙二醇、 乙醇、 和其两种或多种的 组合物。活性化合物的浓度通常是 0.1 -0.5 w/w， 例如 0.5 -2 w/w。这些组合物的 实例包括皮肤用化妆品乳膏。 0023 适于透皮给药的制剂可以制成单个的贴剂， 其适于与受药者的表皮长时间紧密地 接触。 这种贴剂可适当地含有作为缓冲水溶液的活性化合物， 例如， 所说的活性化合物在这 种缓冲水溶液中的浓度是 0.1M-0.2。
20、M。 说 明 书 CN 104447549 A 5 4/6 页 6 0024 适于透皮给药的制剂也可以通过离子电渗疗法释放活性化合物 ( 见， 例如， 药理 学研究 (Pharmaceutical Research)3(6)， 318(1986)， 并且典型的使用形式是活性化合物 任选的缓冲水溶液。合适的制剂中包含柠檬酸盐或 bis/tris 缓冲液 (PH6) 或乙醇 / 水， 并 且含有 0.1M-0.2M 的活性成份。 0025 活性化合物可以以食品的形式提供， 例如以加入、 混合、 包衣、 结合或其它途径加 到食品中去。术语食品是指从最广义上讲， 包括液体食品， 例如包括乳制品在内的饮。
21、料， 和 其它食品， 例如健康条状食品、 甜点等。 含有本发明化合物的食品能依据标准方法容易地制 备。 0026 本发明的化合物具有有效的抗氧化剂活性， 因此能广泛地应用于药学和兽药学、 化妆品例如能防止皮肤衰老的护肤乳膏、 防晒剂、 食品、 健康饮料、 洗发剂以及类似物中。 0027 我们惊奇地发现， 式I的化合物与维生素E能互相协同作用以保护脂质、 蛋白质和 其它生物分子不被氧化。 相应地， 本发明进一步提供了一种组合物， 其中含有一种或多种通 式 I 的化合物、 维生素 E、 和可选择地含有药物、 兽药或化妆品可接受载体和 / 或赋形剂。 0028 治疗方法、 用途和组合物可以是对人或动。
22、物进行给药， 所说的动物是， 例如宠物和 家养动物 ( 例如狗和猫 )、 鸟 ( 例如小鸡、 火鸡、 鸭子 )、 家畜 ( 例如牛、 绵羊、 猪和山羊 ) 等。 具体实施方式 0029 下面通过实施例对本发明作进一步说明。应该理解的是， 本发明实施例所述方 法仅仅是用于说明本发明， 而不是对本发明的限制， 在本发明的构思前提下对本发明制备 方法的简单改进都属于本发明要求保护的范围。实施例中用到的所有原料和溶剂均购自 Sigma Biochemical and Organic Compounds for Research and Diagnostic Clinical Reagents 公司 ；。
23、 当归为普通商购产品。 0030 实施例 1 ： 式 I 化合物的制备 ： (1) 取当归粉碎成粗粉 1000g， 加体积比为 10 倍的 90 体积 % 的甲醇 8000ml 提取 10 小时， 收集提取液， 过滤 ； (2) 取滤液回收甲醇至无醇味， 加水制成每 1ml 含 0.5g 生药的溶液 ； (3) 溶液通过 D 型大孔树脂柱吸附， 用乙醇水的混合液进行梯度洗脱， 流速按每小时 树脂体积的倍数计为 4.5BV/h， 洗脱液中乙醇浓度逐步由 5 体积 % 调整至 95 体积 %， 收集含 乙醇浓度在 30 体积 % 以上至 70 体积 % 以下的洗脱液， 弃去含乙醇浓度在 30 体积。
24、 % 至 70 体积 % 以外的洗脱液， 85以下减压回收溶剂并浓缩至在 60下相对密度为 1.60 1.85 的清膏， 用甲醇重结晶得式 I 化合物。 0031 1H NMR (500 MHz, CDCl 3, ppm) : 7.487.37 (m, 8H), 7.25 (s, 1H), 7.20 (t, J=16.5 Hz, 1H), 7.086.87 (m, 5H), 6.766.73 (m, 1H), 5.09 (s, 2H), 4.71 (s, 2H), 3.82 (s, 3H)。 0032 实施例 2 ： 药效试验 ： 激酶抑制活性测试 ： 选出实施例中的一些化合物进行 Raf-1。
25、 激酶的抑制活性测试。ADP Glo 模式被用来测 试 Raf-1 的抑制活性。测试过程如下所示。缓冲液的成分是 25 mM HEPES, 10 mM MgCl2, 0.01% Triton X-100, 100 g/mL BSA, 2.5 mM DTT, pH = 7.4。 将缓冲液、 酶、 底物、 ATP 和待测物混合在 384- 孔的细胞板上， 总体积是 10 L。然后， 细胞板在 30 C 下孵育 1 小 说 明 书 CN 104447549 A 6 5/6 页 7 时， 再以 10 L/ 孔的剂量向反应混合物中加入 ADP Glo 试剂， 再在 27 C 孵育 40 分钟。 接着， 。
26、再向检测板中加入检测试剂 (20 l/ 孔 )， 并在 27 C 孵育 30 分钟， 最后读数。此 外， Hotspot 激酶试验也用来测试化合物的抑制活性 （IC50） ， 用合适的激酶浓度对化合物进 行滴定。式 I 化合物对 Raf-1 激酶的抑制活性的 IC50为 0.25M。 0033 肿瘤细胞抑制活性测试 ： 细胞毒性是由细胞或者化学物质引起的单纯的细胞杀伤事件， 不依赖于凋亡或坏死的 细胞死亡机理。 利用该原理可以对特定物质在某种细胞， 比如肿瘤细胞上的毒性进行检测， 是生物医药研发过程中的重要研究手段。 药物非临床研究的最终目的是预测受试物的临床 有效性和安全性， 判断其能否进入。
27、临床试验， 并为临床试验的设计和临床合理用药提供参 考。因此， 细胞毒性试验从以下几方面为新药研发提供了充分的科学依据 ： 1. 估算临床试 验的起始剂量 ； 2. 预测受试物的临床适应症或者靶点组织 ； 3. 预测受试物毒性反应的性 质、 程度和可逆性 ； 4. 为临床试验方案的制订提供参考。 0034 试剂和耗材 ： 1. 肿瘤细胞由辉源生物科技 （上海）有限公司， 均通过了支原体 检测 ； 2. RPMI 1640 培养液， 美国 Invitrogen， 货号 ： 31800-022 ； 3. F12K 培养液， 美国 Invitrogen， 货号 ： 21127-022 ； 4. DM。
28、EM 培养液， 美国 Invitrogen， 货号 ： 12100-046 ； 5. 胎 牛血清， 美国 Hyclone， 货号 ： CH30160.03 ； 6. 青霉素 - 链霉素液体， 美国 Invitrogen， 货 号 ： 15140-122 ； 7. Gemcitabine， 英国 Tocris， 货号 ： 3259 ； 8. DMSO， 美国 Sigma， 货号 ： D4540 ； 9. 96 孔细胞培养板， 美国 Corning， 货号 ： 3610 ； 10. CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay， 美国 Promega。
29、， 货号 ： G7571 ； 11. 读板仪， 美国 Perkin Elmer， EnVision Multilabel Plate Reader。 0035 细胞培养液 ： 1. RPMI 1640完全细胞培养液 ： 含有10%胎牛血清和100U青霉素和 100 g/mL 链霉素的 RPMI 1640 培养液。2. F12K 完全细胞培养液 ： 含有 10% 胎牛血清和 100U 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 F12K 培养液。3. DMEM 完全细胞培养液 ： 含有 10% 胎 牛血清和 100U 青霉素和 100 g/mL 链霉素的 DMEM 培养液。 0036 化合物制备 ： 。
30、1. 用 DMSO 将式 I 化合物配制成 10mM 的母液， -80oC 冰箱分装保存。 2. 用 DMSO 将 30 mM 待测化合物母液稀释至一系列的梯度浓度溶液， 这些浓度包括 25 mM， 5 mM， 1 mM， 200 M， 40 M， 8 M， 1.6 M， 0.32 M。然后将配好的梯度浓度溶液用完 全细胞培养液稀释5倍， 此时， 待测化合物的梯度浓度包括5 mM, 1 mM, 200 M, 40 M, 8 M, 1.6 M, 0.32 M, 0.064 M， 溶解在 20% 的 DMSO 中。3. 仅在实验开始前， 在 无菌条件下将配制好的化合物 HSCA-010 梯度浓度溶。
31、液用完全细胞培养液稀释 100 倍， 此 时， 化合物HSCA-010的梯度浓度包括50 M， 10 M， 2 M， 0.4 M， 0.08 M， 16 nM， 3.2 nM， 0. 64 nM， 此为 2 化合物溶液， 即可用来处理细胞。4. Gemcitabine 溶液是由配制好 的 50 mM 母液分装而来， 实验开始前， 先用去离子水配制一系列的梯度浓度溶液， 再在无菌 条件下用完全细胞培养液配制成 2 溶液， 即可用来处理细胞。 0037 操作步骤 ： 1. 化合物处理前一天将肿瘤细胞接种在 96 孔细胞培养板中。接种密 度为 ： 2000 细胞 /50 L/ 孔或者 4000 细胞。
32、 /50 L/ 孔。2. 第二天， 将配制好的 2 化 合物溶液加入到细胞培养板中， 每孔加入 50 L。3. 轻轻震荡细胞板， 将其放置在 37 C 培养箱中继续培养 72 小时。4. 孵育结束后按照 CellTiter Glo 试剂说明书要求在细胞板 中加入配制好的试剂， 充分混匀后室温避光孵育 10 分钟。5. 将细胞板放入读板仪进行分 说 明 书 CN 104447549 A 7 6/6 页 8 析， 设定读取化学发光并记录数据。 0038 数据处理 ： 每孔中的读数需要被转换成细胞存活率。细胞存活率可以使用公式计 算得出。处理后的数据将被用来做非线性回归分析， 得到剂量效应曲线， 并计算出待测化 合物对每种细胞的半数杀伤浓度 （CC50） 。式 I 化合物对肝炎肿瘤细胞毒性试验， EC50 1.68 M。 说 明 书 CN 104447549 A 8 。