在疏水性溶剂中增溶亲水性物质(如蛋白质)的方法 本发明涉及一种将亲水性物质，例如蛋白质溶解在它通常不可溶的疏水性溶剂中的新型方法。
将亲水性分子例如蛋白质与疏水性物质例如类脂相结合起来在许多方面是有利的。亲水性分子在类脂环境中时能够具有优点例如稳定性增强。此外，这种亲水性物质穿过类脂性障碍物，例如皮肤的运送将变得更为容易。
早期的将疏水性载体用于蛋白质运送的建议包括脂质体的应用。后来的系统是非脂质体的，但仍然依赖于携带蛋白质或其它亲水性分子的亲水相前提，此亲水相与疏水相形成一种乳化液。这些系统的实例揭示在EP-A-0366277和EP-A-0521994。
WO-A-95/13795揭示了一种系统，靠它获得一种真正的单相制剂是可能的，此处亲水性物质真正“溶解”在疏水相中。在其中揭示的方法中，亲水性物质首先与一种两亲物在液体介质中相结合，在这种液体介质中，两亲物和亲水物之间没有化学相互作用。液体介质然后被去除，留下两亲物分子和亲水性物质的一个系统。最后，向系统中加入一种疏水性溶剂会产生一种单相制剂，此处亲水性物质溶解在疏水性溶剂中。
现在令人惊奇地发现通过一种改进后的通常更快速的方法生成一种亲水性物质在疏水性溶剂中的单相制剂是可能的。
因此，一方面，本发明提供了一种在疏水性溶剂中含有亲水性物质的单相疏水制剂的制备方法，该方法包括：
(ⅰ)在疏水相存在的情况下，将亲水性物质与一种两亲物相结合；及
(ⅱ)去除存在的所有亲水性溶剂；
其中亲水性溶剂去除步骤在保持疏水相为固态的条件下进行。
在一个优选的实施例中，亲水性物质和两亲物首先溶解在一种亲水性溶剂中，例如含水溶剂，通常只有水，然后将此溶液与疏水性溶剂相结合。亲水性溶剂的去除步骤通过冻干法便利地实现，这种方法在确保疏水性溶剂一直保持在固态直至所有水都被去除的温度下进行。在某些情况下，油在冻干期间可能变成液态，这是由于固体块的某些部分(通常在表面和边缘)局部温度升高的结果，在这些地方亲水性溶剂已经被去除。这儿由亲水性溶剂的升华产生的冷却效应不再存在，在这些区域油将熔化。这种状态将导致一种令人满意的终产物的生成，只要油一出现就将其从固体块的剩余部分中排去(否则，积聚的油将形成层而阻止亲水性溶剂的进一步去除)。
或者，维持冻干期间的温度以致即使在亲水性溶剂已被去除后油仍保持固态。在这种情况下，冻干之后，接着将制剂的温度升高以生成单相制剂。通过将冻干后的制剂升高到室温，这通常能够得以简单地实现，它也将导致疏水相回到液态。也可以应用去除亲水性溶剂的其它方法，例如喷雾干燥。
在本发明的上下文中，术语“亲水性物质”涉及任何通常在亲水性溶剂，例如含水溶剂中可溶，而在疏水性溶剂中不可溶的物质。在本发明中应用的亲水性物质是各种各样的，但亲水性高分子代表了可以应用的物质的一种实例。
本发明的方法提供了一种便利的和比较快速的生成所述的单相制剂的方法。当涉及油、亲水性物质或两者的稳定性时，尤其当两亲物的浓度高时，方法的快速是一个特别的优点。此外，即使当应用例如甘油三酯作为疏水相时，也能获得两亲物与亲水性物质之间的低比率，例如低至7∶1，这允许制剂有较高的装载容量。
正如上面提及的，在一个优选的实施方案中，两亲物“出现”在亲水相中。但是，如果适当的话，两亲物可以首先溶解或分散在油中。当应用在水中分散不好的两亲物时，这尤其适合。本发明的方法的另一个优点是它允许不能很好地冻干的两亲物的应用，例如那些在实施冻干法通常采取的温度下为液态的两亲物。
各种各样的高分子适合于应用在本发明中。总地来说，高分子化合物将是亲水性的或至少具有亲水区域，因为将疏水性高分子溶解在油性溶液中通常很少有困难。合适的高分子的实例包括蛋白质和糖蛋白，低核酸和聚核酸，例如DNA和RNA，聚糖和任何这些物质的超分子组合，包括在某些情况下为整个细胞或小器官。也可以很便利地共溶解一个小分子例如维他命与一个高分子例如聚糖如环糊精结合而成的复合物。小分子例如维他命B12也可以与高分子化学共轭，并且可以因此包含在组合物中。
可以成功地用本发明的方法溶解的具体的蛋白质的实例包括胰岛素、降钙素、血红蛋白、细胞色素C、辣根过氧化物酶、抑肽酶、蕈状酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)、红细胞生成素、生长激素(somatotropin)、生长激素(growth hormone)、生长激素释放因子、galanin、尿激酶、因子Ⅸ、组织血纤维蛋白溶酶原活化剂、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶、铁蛋白、干扰素、因子Ⅷ、微生物毒素、肽和蛋白抗原及它们的片段(所有上述蛋白质能来自任何合适的来源)。其它可以应用的高分子是FITC标记的葡聚糖和从串酵母(Torulla yeast)中提取出来的RNA。
看来高分子化合物的分子量没有上限，因为分子量为约1,000,000的葡聚糖能够用本发明的方法轻易地溶解。
除高分子外，本发明的方法也可用于溶解更小的有机分子。小有机分子的实例包括葡萄糖、羧基荧光素和许多药物制剂，例如抗癌制剂，但是，当然本方法同样能够应用于其它的小有机分子，例如维他命或者药物上或生物上的活性试剂。此外，化合物例如氯化钙和磷酸钠也能用此方法溶解。实际上，本发明对药物上和生物上的活性试剂尤其有利，因为无水溶液的应用可以使分子进入体内的方法得以改变，例如用以提高生物利用率。
另一种可以包含在本发明的疏水性组合物中的物质是无机物例如小无机分子或胶体物质例如胶态金属。本发明的方法使胶态金属例如胶态金、钯、铂或铑的一些性质，即使在疏水性溶剂中也能够被保持，而通常情况下微粒在其中会聚集。这对于在有机溶剂中进行的反应的催化作用尤其有用。
有许多两亲物可以应用于本发明，两性离子两亲物例如磷脂就属于那些已经被发现是尤其适合的两亲物。带卵磷脂首基的磷脂已经被特别成功地应用，这些磷脂的实例包括卵磷脂(PC)本身、溶血卵磷脂(lyso-PC)、神经鞘磷脂、任何这些物质的衍生物，例如十六烷基胆碱磷酸或含有磷酸胆碱的两亲聚合物。在本申请中，术语卵磷脂(PC)和卵磷脂(lecithin)可互换应用。合适的天然卵磷脂可以来源于任何便利的来源，例如蛋和尤其是大豆。在大多数情况下，优选选择一种化学上类似于被选择的疏水性溶剂的两亲物，这在下面更详细地讨论。
疏水性溶剂的选择取决于组合物预定的目的、被溶解的物质类型和两亲物。合适的溶剂包括带不饱和脂肪酸的长链脂肪酸例如优选油酸和亚油酸，醇，尤其是中链醇例如辛醇和带支链的长链醇例如叶绿醇、单酸甘油酯例如甘油单油酸酯(GMO)、甘油二酯和甘油三酯，尤其是中链甘油三酯和它们的混合物。
当疏水性溶剂和两亲物恰当地匹配时，通常获得最佳的结果。例如，对一种溶剂例如油酸，溶血卵磷脂相对卵磷脂是两亲物的一种更合适的选择，而当疏水性溶剂是甘油三酯时则相反。
或者，在疏水性溶剂具有两亲性质的情况下(例如游离脂肪酸，如油酸，它们在有碱存在的情况下能够离子化而生成油酸钠)，包含一种额外的两亲物就不必要，如果溶剂分子的一部分在混合过程进行之前或期间转化成两亲物的形式。尤其，所应用的碱是一种挥发性的碱例如三乙胺。当溶解降钙素或胰岛素时，这种方法尤其成功。
因此，第二方面，本发明提供了一种在疏水性溶剂中含有亲水性物质的单相疏水制剂的制备方法，该方法包括：
(ⅰ)在疏水相存在的情况下，将亲水性物质与碱相结合；及
(ⅱ)去除存在的所有亲水性溶剂；
其中疏水相是具有疏水性质的相，其中亲水性溶剂的去除步骤在保持疏水相为固态的条件下进行。正如上面所讨论的，优选碱是挥发性的碱例如三乙胺。合适的疏水性溶剂包括中链和长链脂肪酸，它们的实例包括油酸和亚油酸。这种方法对于溶解降钙素或胰岛素尤其有用。
本发明的制剂的一个优点是它们基本上无水，因此对水解作用是稳定的。它们对冻熔作用也是稳定的，并且在高温下具有更强的稳定性，这可能是因为为了蛋白质展开并变性，必须有水出现。这意味着它们可以被期望比亲水性物质的含水制剂具有一个更长的贮存期限。
用本发明的方法提供的溶液是极其多用途的，有许多应用。它们可以或者单独应用，或者与含水相相结合而形成一种乳化液或类似的两相组合物，这也形成了本发明的另一方面。
可以应用用本发明的方法生成的组合物的一个方面是用于哺乳动物，包括人，在通常情况下在亲油溶剂中不可溶的物质的口服给药。这可以用于饮食补充物例如维他命的给药，或者用于生物活性物质，尤其是蛋白质或糖蛋白，包括胰岛素和生长激素的给药。
在另一个应用中，有可能例如通过上面描述的方法，将营养素例如维他命包胶或微囊包胶，然后它们不仅能够用作人类的食品补充物，而且能够用于农业和水产养殖业，后者的一个实例是用于幼虾养殖中饲料的生产。
此外，该组合物在非肠道使用的药物或其它制剂，以及局部或眼用制剂的制备中找到了应用。对于这种应用，通常优选应用如上面所述的油溶液和含水相的乳化液。
许多治疗性和预防性的治疗意欲持续的或延迟的释放或者包含一个两组分系统，例如包括一种用于立即释放的组分和一种用于延迟的或持续释放的组分。因为它们的高稳定性，本发明的制剂对意欲持续的或延迟的释放的高分子制剂尤其有用。
通过此处揭示的方法产生的组合物有更长的贮存期限，这在医药领域中是一个特别的优点。
亲水物溶在油中生成的制剂可以在制药或类似工业中找到应用，用于气味的掩蔽。在制药工业中这是一个特别的问题，因为许多药物有令人不快的气味，因此对病人，尤其是儿童不受欢迎。
另一个应用是在化妆品工业中，亲水性化合物的疏水制剂又能非常容易地溶合到化妆品制剂中。可以以这种方式应用的高分子的实例包括那些有某种增湿或酶催作用的物质。本发明也可用于将蛋白质例如胶原蛋白溶合在皮肤药膏和洗液中。
因此，第三方面，本发明提供了本发明的方法在药物、化妆品、营养品、饲料或食物补充组合物制备中的应用。尤其，当本发明的方法应用于药物组合物的制备时，它将用于局部、口用或眼用制剂的制备。
最后，本发明在化学和生物合成领域有许多应用，例如，无水酶催化合成。
本发明的各个方面优选的特征是就各个其它方面作必要的改进后而言的。
本发明现在将参见以下的实施例进一步地描述，这不应理解成作任何限制。
实施例1
(ⅰ)将20毫克抑肽酶溶解在1毫升蒸馏水中。
(ⅱ)将1克大豆卵磷脂溶解在9毫升Miglyol 818中，以给出卵磷脂在M818中的浓度接近100毫克/毫升。
(ⅲ)将三个B10带螺纹盖的小玻璃瓶准备好，装有以下数量的上面描述的两种溶液。内容物很好地混合。
A B C
蒸馏水600微升600微升600微升
抑肽酶(20毫克/毫升)125微升63微升0微升
M818/卵磷脂(9∶1) 1毫升 1毫升 1毫升
卵磷脂(重量，毫克) 100 100 100
抑肽酶(重量，毫克) 2.5 1.25 0
(ⅳ)然后将小瓶在液氮中冷冻，并且在-45℃的温度下冻干二天。
(ⅴ)冻干后，将小瓶中的内容物升高至室温，由此获得透明的或略带乳白色的油。
(ⅵ)测定200微升样品在600纳米处的光密度，用样品C(不含抑肽酶)作为空白样。
A B C
抑肽酶在油中的浓度(毫克/毫升) 2.5 1.25 0
光密度600 0.330 0.096 0.00
在平行实验中，仅仅向油中加入2.5毫克抑肽酶，给出一个大于1.0的光密度，表明在这个实施例中，由于所采用的方法的结果，在两个样品A和B中发生了溶解。
实施例2
(ⅰ)将80毫克抑肽酶溶解在4毫升蒸馏水中。
(ⅱ)将100毫克水杨酸溶解在10毫升Miglyol 818中。
(ⅲ)用探测器超声破碎法将大豆卵磷脂分散在蒸馏水中，浓度为250毫克/毫升。
(ⅳ)将上述准备好的溶液按下表分散在B10带螺纹盖的小玻璃瓶中。
A B C D E A′B′C′D′E′
抑肽酶(20毫克/毫升)0 250 375 500 750 0 250 350 500 750
蒸馏水600 350 - - - 600 350 - - -
卵磷脂(250毫克/毫升)400 400 400 400 400 400 400 400 400 400
M8181 1 1 1 1 - - - - -
M818+水杨酸 - - - - - 1 1 1 1 1
抑肽酶(毫克)0 5 7.5 10 15 0 5 7.5 10 15
(ⅴ)将混合物都进行涡旋运动10秒钟，在液氮中冷冻，并且在-45℃下冻干二天。
(ⅵ)冻干后，将瓶在37℃下加热15分钟。
(ⅶ)溶液的透明度或其它性质通过测定油在600纳米处的光密度来评价。
结果在下表中给出。
A B C D E
抑肽酶(毫克/毫升) 0 5 7.5 10 15
仅有M818 0.009 0.191 0.566 0.390 1.576
M818+水杨酸 0.000 0.006 0.000 0.012 0.021
结果表明，用此处描述的方法，能够获得蛋白质在油中有效的溶解，尤其在有促进剂例如水杨酸存在的情况下(描述在国际专利申请PCT/GB95/02891中)。
实施例3
(1)在三个7毫升玻璃小瓶中，将1毫升鲑鱼(salmon)降钙素溶液分散在蒸馏水中，浓度为1毫克/毫升。
(2)向来自(1)的一个小瓶，标记为“A”，一滴滴地加入0.4毫升油酸，同时进行涡旋运动。立即在液氮中冷冻分散液。
(3)向来自(1)的一个小瓶，标记为“B”，加入5微升冰醋酸，然后一滴滴地加入0.4毫升油酸，同时进行涡旋运动。立即在液氮中冷冻分散液。
(4)向来自(1)的一个小瓶，标记为“C”，加入5微升三乙胺，然后一滴滴地加入0.4毫升油酸，同时进行涡旋运动。立即在液氮中冷冻分散液。
(5)在一个冻干器中，将所有小瓶在贮存温度为+4℃下冻干一整夜。
(6)第二天，加热小瓶以获得所有处于液态的油，测定每种油在600纳米处的光密度。
结果
A B C
光密度600纳米 0.096 0.096 0.005
获得了一透明的溶液。
实施例4
(1)在一个7毫升的玻璃小瓶中，配入1毫克牛胰岛素，并加入1毫升蒸馏水。
(2)向来自(1)的小瓶中加入5微升三乙胺，然后，一滴滴地加入0.4毫升油酸，同时进行涡旋运动。立即在液氮中冷冻分散液。
(3)在一个冻干器中，将小瓶在贮存温度为+4℃下冻干一整夜。
(4)第二天，加热小瓶以获得处于液态的油，其中，以与上面的实施例3中描述的有关降钙素的同样的方式，胰岛素溶解成一透明溶液。