一种用于他汀类药物的手性中间体的制备方法.pdf

本发明涉及一种用于他汀类药物的手性中间体的制备方法，以氯乙酸和苄醇为起始原料，经过醚化、缩合、取代、不对称还原等一系列反应得到。本发明提供的制备方法合成路线更加新颖，中间体化合物可以方便地通过酶还原引入二醇手性中心，不仅价格低廉，而且质量可靠。本发明提供的合成路线所用原料成本低廉，工艺易于操作，终产物纯度好且收率高。

权利要求书
1.  一种如式(Ι)所示的用于他汀类药物的手性中间体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)以氯乙酸(1)和苄醇(2)为起始原料，通过醚化反应生成苄氧乙酸(3)；
2)苄氧乙酸(3)与吗啡啉进行缩合反应生成2-苄氧基吗啡啉乙酰胺(4)；
3)2-苄氧基吗啡啉乙酰胺(4)与式(5)所示的乙酰乙酸酯进行取代反应生成式(6)所示的二酮中间体；
4)式(6)所示的二酮中间体通过不对称还原反应生成式(7)所示的手性二醇中间体；
5)式(7)所示的手性二醇中间体与2,2-二甲氧基丙烷反应生成式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
6)式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯脱除苄基得到式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
7)式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯通过氧化反应得到式(Ι)所示的手性中间体；
反应式如下：

其中，R表示C4～C10的烷基。

2.  根据权利要求1所述的制备方法，其中，R表示叔丁基、叔戊基、环戊基或环己基。

3.  根据权利要求1或2所述的制备方法，其中，所述式(5)所示的乙酰乙酸酯由双烯酮与式(10)所示的醇通过开环加成反应制得；
反应式如下：


4.  根据权利要求1或2的所述制备方法，其中，所述步骤4)中的不对称还原反应过程如下：将式(6)所示的二酮中间体均匀分散至溶剂中，加入还原酶、甲酸或甲酸盐、NAD+，调节pH值为6.2～6.4，然后将体系升温至27～33℃，保温17～24h即得。

5.  根据权利要求4的所述制备方法，其中，所述还原酶的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量质量比为0.00005～0.004:1。

6.  根据权利要求5的所述制备方法，其中，所述还原酶为含有选自如下所示的氨基酸序列之一的双羰基还原酶突变体：
a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；
b)与a)中所示序列具有至少70％同一性且具有改进的双羰基还原酶活性的序列；或
c)a)中的序列经删除、添加和/或替换一个或多个氨基酸残基而得到且具有改进的双羰基还原酶活性的序列，
其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO：7所示的序列。

7.  根据权利要求6的所述制备方法，其中，所述双羰基还原酶突变体含有如SEQID NO：1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。

8.  根据权利要求4的所述制备方法，其中，所述溶剂选自纯化水、聚乙二醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇、正庚烷、甲苯、丙酮、二甲基甲酰胺、甲醇中的一种或多种。

9.  根据权利要求4的所述制备方法，其中，所述甲酸盐选自甲酸铵、甲酸钠或甲酸钾，所述甲酸或甲酸盐的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量摩尔比为2～10:1。

10.  根据权利要求4的所述制备方法，其中，所述NAD+的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量质量比为0.001～0.1:1。

说明书一种用于他汀类药物的手性中间体的制备方法
技术领域
本发明涉及药物中间体合成领域，具体涉及一种用于他汀类药物的手性中间体的制备方法。
背景技术
他汀类药物(Statins)是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，此类药物通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。此外，他汀类药物在急性冠状动脉综合征患者中早期应用能够抑制血管内皮的炎症反应，稳定粥样斑块，改善血管内皮功能；延缓动脉粥样硬化(AS)程度、抗炎、保护神经和抗血栓等作用，具有非常广阔的应用前景。
目前已经上市的他汀类药物如阿托伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、瑞舒伐他汀等，其合成均需要使用如结构式A的手性二醇侧链作为起始原料。

专利WO03006656A中以2，4-双脱氧己糖或2，4，6-三脱氧己糖为重要中间体，经过氧化、缩醛化、水解得到醇侧链中间体。

反应式1
专利WO0206266A报道了由6-氯甲基-4-羟基四氢化-2氢-吡喃-2-酮合成(4R-cis)-6- 氯-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-乙酸叔丁酯系列化合物的合成路线。其中Y代表Na、Ca或是一个四烷基季铵盐化合物。

反应式2
专利US2006004200A和WO2008059519A报道了将(4R-Cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧六环-4-乙酸叔丁酯氧化成醛基侧链中间体的合成工艺。

反应式3
以上路线中，原料的合成、路线的选择、中间体的分离纯化等方面还存在一些问题，导致合成成本高昂、总收率较低。因此。开发一条成本低廉、工艺绿色环保、成本低且产品品质高的合成工艺具有很高的经济价值和社会价值。
发明内容
为克服现有合成路线存在的成本高、收率低等缺陷，开发一条全新的合成路线，本发明的目的是提供一种如式(Ι)所示的用于他汀类药物的手性中间体的制备方法。
本发明提供的制备方法包括以下步骤：
1)以氯乙酸和苄醇为起始原料，通过醚化反应生成苄氧乙酸；
2)苄氧乙酸与吗啡啉进行缩合反应生成2-苄氧基吗啡啉乙酰胺；
3)2-苄氧基吗啡啉乙酰胺与式(5)所示的乙酰乙酸酯进行取代反应生成式(6)所示的二酮中间体；
4)式(6)所示的二酮中间体通过不对称还原反应生成式(7)所示的手性二醇中间体；
5)式(7)所示的手性二醇中间体与2,2-二甲氧基丙烷反应生成式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
6)式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯脱除苄基得到式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
7)式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯通过氧化反应得到式(Ι)所示的手性中间体；
反应式如下：

其中，R表示C4～C10的烷基。
优选地，R表示叔丁基、叔戊基、环戊基或环己基。
其中，所述式(5)所示的乙酰乙酸酯由双烯酮与式(10)所示的醇通过开环加成反应制得；
反应式如下：

其中，所述步骤4)中的不对称还原反应过程如下：将式(6)所示的二酮中间体均匀分散至溶剂中，加入还原酶、甲酸或甲酸盐、NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)，调节pH值为6.2～6.4，然后将体系升温至27～33℃，保温17～24h即得。
所述步骤4)中，所述还原酶的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量质量比为0.00005～0.004:1。
其中，所述还原酶为含有选自如下所示的氨基酸序列之一的双羰基还原酶突变 体：
a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；
b)与a)中所示序列具有至少70％同一性且具有改进的双羰基还原酶活性的序列；或
c)a)中的序列经删除、添加和/或替换一个或多个氨基酸残基而得到且具有改进的双羰基还原酶活性的序列，
其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO：7所示的序列。
优选地，所述双羰基还原酶突变体含有如SEQ ID NO：1、2、3、4、5或6所示的氨基酸序列。
所述步骤4)中，所述溶剂选自纯化水、聚乙二醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇、正庚烷、甲苯、丙酮、DMF、甲醇中的一种或多种。
所述步骤4)中，所述甲酸盐选自甲酸铵、甲酸钠或甲酸钾，所述甲酸或甲酸盐的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量摩尔比为2～10:1。
所述步骤4)中，所述NAD+的用量与所述式(6)所示二酮中间体的用量质量比为0.001～0.1:1。
本发明提供的制备方法具有以下优点：
(1)相对于现有合成路线，该合成路线更加新颖，拓宽了他汀类药物的研制领域。
(2)中间体化合物6可以方便地通过酶还原引入二醇手性中心，尤其是本发明提供的双羰基还原酶突变体，不仅价格低廉，而且质量可靠，所得二醇收率高、纯度好，光学选择性高。
(3)该合成路线以氯乙酸和苄醇为起始原料，中间步骤所用原料成本低廉，工艺易于操作，终产物纯度好且收率高，总收率可达到90.0％甚至以上，能够有效降低制造成本。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将进一步描述本发明的示例性实施例的技术方案。
本发明提供了一种如式(Ι)所示的用于他汀类药物的手性中间体的制备方法，包括以下步骤：
1)以氯乙酸1和苄醇2为起始原料，通过醚化反应生成苄氧乙酸3；
2)苄氧乙酸3与吗啡啉进行缩合反应生成2-苄氧基吗啡啉乙酰胺4；
3)2-苄氧基吗啡啉乙酰胺4与式(5)所示的乙酰乙酸酯进行取代反应生成式(6)所示的二酮中间体；
4)式(6)所示的二酮中间体通过不对称还原反应生成式(7)所示的手性二醇中间体；
5)式(7)所示的手性二醇中间体与2,2-二甲氧基丙烷反应生成式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
6)式(8)所示的(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯脱除苄基得到式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯；
7)式(9)所示的(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸酯通过氧化反应得到式(Ι)所示的手性中间体；
反应式如下：

其中，R表示C4～C10的烷基。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，R优选表示叔丁基、叔戊基、环戊基或环己基。
在根据本发明的制备方法的一个实施方式中，式(5)所示的乙酰乙酸酯由双烯酮与式(10)所示的醇通过开环加成反应制得；
反应式如下：

具体而言，所述步骤1)的具体过程可以为：向反应瓶中加入有机溶剂和甲苯，控制体系温度下分批加入碱，加完碱再分批加入苯甲醇。将氯乙酸溶于有机溶剂，控制温度滴加到前述的反应体系中，体系反应至氯乙酸消耗完全。将体系冷却后加水并在减压下除去有机溶剂，水相用有机溶剂萃取，控制温度调节水相的pH为酸性，水相用有机溶剂萃取后干燥浓缩得到化合物3。步骤1)所得产物的纯度为97～99％，收率为85～90％。
上述所述步骤1)中：反应所用的有机溶剂可选自1,4-二氧六环、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、乙腈、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为四氢呋喃。所加的碱可选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、叔丁醇钾，乙醇钠、氢氧化钠、金属钠、氢化钠的一种或多种任意比混合的碱，优选氢氧化钾；所加碱和氯乙酸的摩尔比可选自1:1～100:1，优选为3:1；所加苯甲醇和氯乙酸的摩尔比可选自1:1～100:1，优选为3:1；加碱和苯甲醇的温度可选自10～100℃，优选为15～25℃；滴加氯乙酸的温度可以为30～120℃，优选为70～80℃；滴加氯乙酸溶液的速度可以选自1g/min到100g/min，优选为10g/min；冷却后加的水和氯乙酸的质量比可选自1:1～100:1,优选为8:1；水相的pH值可以为1～6，优选为2～3；酸性水相的萃取溶剂可选自2-甲基、乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为甲基叔丁基醚；萃取溶剂的用量相对于氯乙酸可以为3～30倍体积，优选为8倍体积。
所述步骤2)的具体过程可以为：向反应瓶中加入有机溶剂和苄氧基乙酸(化合物3)，控制体系温度滴加酰氯，滴毕体系搅拌至化合物3消耗完毕后减压除去低沸点物质，备用。向反应瓶中加入有机溶剂、吗啡啉和碱，控制体系温度滴加上述备用的浓缩液，滴毕保温搅拌至吗啡啉消耗完全，加入稀盐酸淬灭反应，分液有机相依次用水、饱和碳酸氢钠和水洗涤，浓缩得苄氧基乙基吗啉酰胺(化合物4)。步骤2)所得产物的纯度为97～99％，收率为85～90％。
上述所述步骤2)中：有机溶剂可选自1,4-二氧六环、四氢呋喃、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、2-甲基四氢呋喃、乙腈、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为二氯甲烷；所加酰氯可选自草酰氯、二氯亚砜、乙酰氯的一种或多种任意比混合物，优选为草酰氯；滴加酰氯的温度可以为-10～50℃，优选为10～20℃；所加酰氯和化合物3的摩尔比可选自1:1～10:1，优选为1.5:1，滴加酰氯液的速度可选自1g/min到100g/min，优选为6g/min；所加的碱可选自氢氧化钠、三乙胺、碳 酸钠、碳酸钾、氢氧化钾、叔丁醇钾，乙醇钠、二异丙基乙胺、吡啶的一种或多种任意比混合的碱，优选为三乙胺；所加碱和化合物3的摩尔比可以为1:1～10:1，优选为1.5:1；滴加浓缩液的温度可选自-10～50℃，优选为10～20℃。
所述步骤3)的具体过程可以为：向反应瓶中加入有机溶剂和碱，控制体系温度滴加化合物5，滴毕，体系降温，控制体系温度滴加有机碱溶液，滴毕，滴加化合物4搅拌至化合物4消耗完毕。反应体系用酸性水溶液淬灭，分液后水相用有机溶剂萃取两次，合并有机相用饱和食盐水洗涤一次浓缩得到化合物6粗品，加有机溶剂析晶得到固体化合物6。步骤3)所得产物的纯度为96.0～97.0％，收率为65～70％。
上述所述步骤3)中：有机溶剂可选自1,4-二氧六环、四氢呋喃、甲苯、二2-甲基四氢呋喃、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为四氢呋喃；所用碱可选自碳酸钾、碳酸钠、氢氧化钾、叔丁醇钾，乙醇钠、氢氧化钠、金属钠、氢化钠的一种或多种任意比混合的碱，优选氢化钠；化合物5的滴加温度可选自-10～50℃，优选为0～20℃；化合物5的滴加速度可选自1g/min到100g/min，优选为10g/min；所用有机碱可选自二异丙基乙胺基锂、正丁基锂、叔丁基锂、乙醇钠、甲醇钠和叔丁醇钠的一种或多种任意比混合物，优选为正丁基锂；淬灭的酸性水溶液可选自盐酸、硫酸氢钠、氯化铵和磷酸氢钠的一种或多种任意比混合物，优选为质量百分数为3％的稀盐酸溶液；萃取的有机溶剂可选自甲苯、2-甲基四氢呋喃、二氯甲烷、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为甲基叔丁基醚。
所述步骤4)的具体过程可以为：将6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸叔戊酯(化合物6)均匀分散到溶剂中，搅拌均匀后加入还原酶、甲酸或甲酸盐、NAD+，使用甲酸等水溶液调节pH＝6.2～6.4，将体系升温至27～33℃，保温17～24h。反应结束后将体系升温至65～70℃破坏酶蛋白，加入有机溶剂，过硅藻土垫，分液，水相用有机溶剂反萃，合并有机相，浓缩，所得产物直接用于下一步反应。步骤4)所得产物的纯度为92～95％，收率70～85％，ee值大于99.5％，de值90～99.5％。
上述所述步骤4)中：分散化合物6所用溶剂可选自纯化水、聚乙二醇、异丙醇、乙腈、四氢呋喃、乙醇、正庚烷、甲苯、丙酮、DMF、甲醇，优选为纯化水，分散溶剂的用量可为化合物6的1～10倍体积，优选4倍体积；还原酶的用量相对于化合物6的用量可为0.05～4mg/g，优选为0.1mg/g，反应总体积相对化合物6可以为10～60倍，优选30倍；甲酸或甲酸盐和化合物6的摩尔比可选自2:1到10:1，优选为2:1，甲酸盐可选自甲酸铵、甲酸钠、甲酸钾，优选甲酸铵；NAD+和化合物6 的质量比可选自0.001:1到0.1:1，优选为0.03:1；体系pH范围可以为4.0～9.0，优选为6.2+0.2；用于萃取的有机溶剂可选自乙酸乙酯、乙酸异丙酯、四氢呋喃、二氯甲烷、乙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、甲苯、二甲苯的一种或多种任意比混合溶剂，优选为乙酸异丙酯。
所述步骤5)的具体过程可以为：向有机溶剂中依次加入(3R,5S)-6-苄氧基-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7)、2,2-二甲氧基丙烷和催化量的酸，反应至化合物7基本消失，加酸洗涤，加碱中和体系，减压下除去低沸点物质后加水，分液，水相用有机溶剂萃取数次，合并有机相用饱和食盐水洗涤一次，有机相过硅胶垫后浓缩，所得产物直接用于下一步反应。步骤5)所得产物的纯度为92～95％，收率为88～92％。
上述所述步骤5)中：反应的有机溶剂可选自甲醇、丙酮、乙腈、二氯甲烷、甲苯、四氢呋喃、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为丙酮；有机溶剂用量可以为化合物7的3～20倍体积，优选为10倍体积；反应温度可以为-10～60℃，优选为15～25℃；所加的2,2-二甲氧基丙烷和化合物7的摩尔比可选自1:1到10:1，优选为2:1；所加的催化量的酸可选自盐酸、硫酸、吡啶对甲苯磺酸盐、对甲基苯磺酸、乙酸一种或多种任意比混合酸，优选为吡啶对甲苯磺酸盐；所加的催化量的酸和化合物7的质量比可选自0.01:1到0.1:1，优选为0.02:1；洗涤所加酸的酸选自盐酸、硫酸、对甲基苯磺酸、乙酸一种或多种任意比混合酸，优选为质量分数为3％的稀盐酸；洗涤所加的酸和化合物7的质量比可选自0.01:1到1:1，优选为0.05:1；体系中和时所加的碱可选自氢氧化钠、氢氧化钾，碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸钾的一种或多种任意比混合碱，优选为饱和碳酸氢钠水溶液；反应后处理萃取溶剂可选自乙酸乙酯、乙醚、甲基叔丁基醚、正庚烷、甲苯、二甲苯的一种或多种任意比混合溶剂，优选为乙酸乙酯。
所述步骤6)的具体过程可以为：向有机溶剂中加入(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8)和金属催化剂，体系密封好后用氮气置换五次，再用氢气置换三次，反应至化合物8基本消失，排压后开釜取出体系，抽滤，滤饼用有机溶剂洗涤两次，浓缩所得产物直接用于下一步氧化反应，产品纯度为95-98％，收率为92-95％。
上述所述步骤6)中：反应的有机溶剂可选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选为乙酸乙酯；反应溶剂乙酸乙酯的用量可以为化合物8的3～20倍体积，优选为10倍体 积；所加金属催化剂选自氢氧化钯、钯碳、铂碳、二氧化铂、Raney-Ni的一种或多种任意比混合的催化剂，优选为氢氧化钯；所加金属催化剂和化合物8的质量比可选自0.01:1到1:1，优选为0.05:1；滤饼洗涤溶剂可选自甲醇、丙酮、乙醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲基叔丁基醚的一种或多种任意比混合溶剂，优选乙酸乙酯。
所述步骤7)的具体过程可以为：向有机溶剂中加入2-((4R,6S)-6-甲氧基-2,2-二甲基-[1,3]二环氧-4-基)-乙酸酯(化合物9)，降温后，加入二甲基亚砜和一定量的碱，然后分批加入氧化剂，待化合物9反应完全，加水淬灭，分液，水相用有机溶剂反萃，合并有机相，并用纯化水洗涤，浓缩即得到目标化合物(式Ι化合物)。目标产品纯度为92-96％，收率为80-85％。
上述所述步骤7)中：反应的有机溶剂可选自丙酮、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、四氢呋喃、甲基叔丁基醚、甲苯、N,N-二甲基甲酰胺、N,N-二甲基乙酰胺的一种或多种任意比混合溶剂，优选为二氯甲烷；反应的有机溶剂用量可以为化合物9的3～20倍体积，优选为10倍体积；所加二甲基亚砜和化合物9的摩尔比可选自0.01:1到20:1，优选为10:1；所加碱可选自三乙胺、吡啶、乙二胺、N，N-二异丙基乙胺的一种或多种任意比混合碱，优选为N，N-二异丙基乙胺；所加碱和化合物9的摩尔比可选自1:1到50:1，优选3.5:1；所加的氧化剂可选自次氯酸钠-TEMPO、三氧化硫吡啶-二甲基亚砜、活性二氧化锰、PCC氧化剂、PDC氧化剂、DMP，优选三氧化硫吡啶；所加氧化剂和化合物9的摩尔比可选自0.01:1到20:1，优选为10:1；氧化剂的加料速度可选自0.01Kg/h到1Kg/h，优选为0.4Kg/h；淬灭反应时水的用量可以为化合物9的3～20倍体积，优选为5倍体积；后处理萃取溶剂可选自乙酸乙酯、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、甲苯、正庚烷的一种或多种任意比混合溶剂，优选为二氯甲烷。
式(5)所示的乙酰乙酸酯的具体制备过程可以为：向反应瓶中加入醇(化合物10)、反应溶剂和催化剂，控制体系温度，滴加双烯酮后保温反应至原料反应完全。蒸馏除去反应溶剂和过量的双烯酮后减压精馏得到乙酰乙酸酯(化合物5)。
上述过程中：所用催化剂可选自乙酸钠、哌啶、异丙胺、4-二甲胺基吡啶或其他可以催化此类反应的化合物；所述催化剂与醇(化合物10)的摩尔比可以为0.01～0.5：1，优选为0.05～0.10：1；所用反应溶剂可以为四氢呋喃、甲苯或乙腈，也可不使用溶剂；反应温度可选自-10～110℃，优选为10～70℃；双烯酮与醇的摩尔比可以为 0.5～3：1，优选选用1～1.2：1；所得化合物可以采用减压蒸馏纯化，或采用其他已知的化学纯化方法。
上述制备方法中，所使用的还原酶可以为现有任意的双羰基还原酶、或其突变体。在根据本发明制备方法的一个优选实施方案中，还原酶为含有选自如下所示的氨基酸序列之一的双羰基还原酶突变体：
a)SEQ ID NO：1至SEQ ID NO：6；
b)与a)中所示序列具有至少70％同一性且具有改进的双羰基还原酶活性的序列；或
c)a)中的序列经删除、添加和/或替换一个或多个氨基酸残基而得到且具有改进的双羰基还原酶活性的序列，
其中b)中所示的序列不是SEQ ID NO：7所示的序列。
上述双羰基还原酶突变体以红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)基因(如SEQ ID NO：7所示)为出发基因，进行基因突变，通过定向筛选的方法获得双羰基还原酶突变体。其氨基酸序列含有如下序列：
(1)SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列：突变位点为F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(2)SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWVNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(3)SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+V151Q+F231W：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAA YKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPWGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；
(4)SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列：突变位点为V239I+R257K：
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(5)SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列：突变位点为V151Q+R257K：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAIPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQKEFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG；或
(6)SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列：突变位点为I94V+V151Q：
MTELKQITVLGTGVLGSQIAYQTACHGFDVVAYDINAEVIEKAKARFDSLAAAYKAENVEGAKEGKADEALQRITYSYDLGEAVAKADLVIEAVPEDIAIKRDTYEKLATVAPEHTVFATNSSTLLPSDLKEFTGRPEKFLALHFANHVWQNNTAEVMGTESTDPAVYREVVEFAKNIGMVPIELKKEKAGYVLNSLLVPLLNAASDLLIDGIADPDMVDKTWRIGTGAPFGPFQIMDVVGLTTVYNISSQGGEKQREFADYIKKNYIDEGKLGVAVGDGFYNYKG。
上述双羰基还原酶突变体的编码DNA序列包含以下DNA序列：
(1)SEQ ID NO：9，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG；
(2)SEQ ID NO：10，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第 691-693bp的TTC突变为TGG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG；
(3)SEQ ID NO：11，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第691-693bp的TTC突变为TGG，第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG，且第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG；
(4)SEQ ID NO：12，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第715-717bp的GTC突变为ATT、ATC或ATA，且第769-771bp的CGC突变为AAA或AAG；
(5)SEQ ID NO：13，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG，且第769-771bp的CGC突变为AAA或AAG；或
(6)SEQ ID NO：14，其为SEQ ID NO：8所示的双羰基还原酶基因序列中第451-453bp的GTC突变为CAA或CAG，且第280-282bp的ATT突变为GTT、GTC、GTA或GTG。
本发明使用的术语“同一性”具有本领域通常已知的含义，本领域技术人员也熟知测定不同序列间同一性的规则、标准。本发明用不同程度同一性限定的序列还必须要同时具有改进的双羰基还原酶活性的活性。本领域技术人员公知如何测定双羰基还原酶的活性筛选变体序列的方法和手段。本领域技术人员可以在本申请公开内容的教导下容易地获得这样的变体序列。在某些实施方案中，所述双羰基还原酶变体的序列为与SEQ ID No：7或8所示的序列具有至少约75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％同一性并具有或编码具有改进的双羰基还原酶活性的氨基酸序列。例如，所述氨基酸序列中的一个或多个氨基酸残基可以进行保守氨基酸的替换，如一个或几个氨基酸残基，如1、2、3、4、5、6、8、9、10、15、20、30、40、50个氨基酸残基。氨基酸的保守氨基酸是本领域公知的。
本文使用的术语“改进的双羰基还原酶活性”是指利用定点饱和突变技术获得的双羰基还原酶的生物活性与起始的双羰基还原酶相比有改进，例如催化活性增加、底物谱变广、热稳定增加、pH稳定性增加或表达量增加，例如与起始的双羰基还原酶相比增加至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、100％、150％、200％、500％或更多。
为了充分说明本发明，在下述实施例中验证本发明所述的制备方法，这些实施例仅供举例说明和特例代表，不应被解释或理解为对本发明保护范围的限制。
实施例所有实验用材料如无特殊说明均为市售购买产品。尽管本发明实施例的描述是以起始化合物开始，但是本领域技术人员可以理解在某一中间产物可以获得的情况下，本发明实施例的工艺过程可以从任何一个中间体和步骤开始。
实施例1双羰基还原酶突变体的制备和筛选
1、来源于红串红球菌(Rhodococcus erythropolis)SK121菌株的双羰基还原酶(DKR)(SEQ ID NO：7)的定点饱和突变
将双羰基还原酶(DKR)的氨基酸序列在Swiss-model网站模拟蛋白质的三维结构，然后通过Docking进行底物与蛋白质的结合模拟，最后通过Pymol分析，选择有可能与底物和NAD结合相关、与NAD质子传递相关的氨基酸作为突变氨基酸。
根据突变氨基酸及其两侧的碱基序列(突变氨基酸请见表1.中的突变位点)，用Primmer5.0设计相应的突变引物(表1)。以含双羰基还原酶基因的pET22b(+)表达载体(购买于Novagen，产品编号69744)为模版，通过全质粒PCR获得完整的线性片段，将上述PCR产物经DPnⅠ消化除去母本模版后，转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养皿中，37℃培养过夜。
表1.点饱和突变引物序列


2、双羰基还原酶突变体的初筛
根据步骤1所述内容，挑取上述培养皿上的单菌落接种到96深孔板中，每孔预先加入0.5ml含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养3h后，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在18℃下进行诱导表达16h，6000g离心10min收集菌体，菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用酶标仪进行活性初筛。向96孔板中加入30μLDMSO，1.5μL主原料6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯(30mg/mL溶于DMSO)，2.5μL NADH(20mg/mL)，216μL磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，于340nm进行本底检测，然后分别向各孔中加入已经制备好的突变体酶液50μL，并立即于30℃检测340nm处吸光光度值的变化。
酶活计算公式：酶活(u/mL)＝(ΔA×60×V1)/(6.22×t×V2)
ΔA:反应过程中的吸光光度值变化；
V1：反应体系的总体积；
6.22：消光系数；
t：ΔA的检测时间；
V1：加入的酶液体积。
3、双羰基还原酶突变体的复筛
将步骤2中酶活高于母本的突变体接种于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.6时，加入IPTG至终浓度为0.2mM，在18 ℃下进行诱导表达。诱导16h后，6000g离心10min收集菌体。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液，用于活性检测。向10ml反应瓶中加入0.05g主原料(6-苄氧基-3,5-二氧代-己酸叔丁酯)，0.5ml聚乙二醇PEG-400，原料溶解后，加入4.0ml磷酸盐缓冲液(100mM，pH＝6.0)，主原料均匀分散于缓冲液中；加入1.5mgNAD+，20.6mg甲酸铵，10mg辅酶甲酸脱氢酶和0.5ml双羰基还原酶，体系pH＝6.0，并于30±3℃保温16h后，薄层色谱(TLC)跟踪，选取转化产品点明显、主原料点不明显的体系进行乙酸乙酯萃取，静置分液，取有机相进行HPLC分析。
选取催化活性优于母本的突变体进行测序，分析突变位点，并进行放大培养，复测催化活性确定突变体F231W(SEQ ID NO：1)、I94V+F231W(SEQ ID NO：2)、I94V+V151Q+F231W(SEQ ID NO：3)、V239I+R257K(SEQ ID NO：4)、V151Q+R257K(SEQ ID NO：5)和I94V+V151Q(SEQ ID NO：6)的催化活性比母本显著提高，复筛结果如表2所示。采用软件对双羰基还原酶的三维结构进行计算机模拟分析，其中I94位于NAD结合区域，V151、F231、V239和R257四个氨基酸均处于底物结合位点附近，这些氨基酸的改变可能提高了底物结合的特异性，从而使酶的活性得到提高。
表2.双羰基还原酶母本与突变体制备3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸叔丁酯活性比较
SEQ ID NO位点酶量a转化DE％EE％1F231W3wt82.7087.66100.002I94V+F231W2wt72.9189.89100.003I94V+V151Q+F231W2wt78.3189.44100.004V239I+R257K2wt68.2685.24100.005V151Q+R257K2wt62.2788.69100.006I94V+V151Q3wt68.4688.14100.007母本6wt62.2687.45100.00
注：a指转化1g底物所需各双羰基还原酶突变体重组细胞的湿重；1wt指转化1g主原料需要1g双羰基还原酶突变体重组湿细胞。
4、双羰基还原酶突变体的克隆与表达
为了便于双羰基还原酶突变体的表达以及鉴定，在其基因的5’和3’末端设计了兼容的限制性酶切位点。可以采用NdeⅠ和XhoⅠ分别将目的基因和pET-22b(+)(其他可在大肠杆菌中表达蛋白质的表达质粒也可使用)分别同时进行酶切，酶切后的目的基因和质粒的较大片段用T4DNA连接酶进行连接反应，将连接产物转化到大肠杆菌DH5α菌株的感受态细胞中，然后将转化后的感受态细胞涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。
挑取上述培养皿上长出的单菌落接种于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，收集菌体进行质粒提取、PCR鉴定和双酶切鉴定后，将正确的克隆载体命名为pET22b(+)-R-M并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，将转化的大肠杆菌BL21(DE3)涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养平板上，37℃培养过夜。挑取上述培养平板上长出的单菌落并接种于5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，利用菌落PCR进行鉴定，将含有正确的表达载体的大肠杆菌进行后续的诱导表达。将上述菌液转接于500ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至OD600＝0.5～0.6时，加入IPTG至终浓度分别为0.2～1.0mM，在18～25℃下进行诱导表达10～16h后，取出菌液，6000g离心10min收集菌体，于-20℃冻存备用。菌体用超声破碎仪(JY92-2D，宁波新芝生物科技股份有限公司)破碎细胞，4℃，10000g离心20min获得上清液和沉淀，上清液用垂直电泳仪进行SDS-PAGE检测。表达的双羰基还原酶突变体在SDS-PAGE上呈现的分子量约为30KD。
实施例2用于他汀类药物的手性中间体的制备
(1)苄氧乙酸(化合物3)的合成
向反应瓶中加入960g四氢呋喃和41g甲苯，控制体系温度为10-20℃，分四批加入534.0g氢氧化钾，加完氢氧化钾后体系再分三批加入1371.1g苯甲醇。将300.1g氯乙酸溶于480.5g四氢呋喃后，控制滴加温度为70-80℃之间，将氯乙酸的四氢呋喃溶液滴加到前述体系中，体系反应至氯乙酸消耗完全。体系冷却后加3.12Kg纯化水然后在减压下除去四氢呋喃，水相用甲苯萃取四次，10-20℃下用盐酸调节水相的pH为3，水相用甲基叔丁基醚萃取两次后浓缩得到421.3g苄氧基乙酸(化合物3)，收率：88.3％，GC纯度≥99.2％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.28(br,1H),7.34-7.30(m,5H),4.59(s,2H),4.12(s,2H)。
(2)2-苄氧-吗啉乙酰胺(化合物4)的合成
向反应瓶中加入700.5g二氯甲烷和110.1g化合物3，控制体系温度为10-20℃之间滴加575.3g草酰氯，加完草酰氯后体系搅拌1h后浓缩除去低沸点物质，备用。将48.0g吗啉、75.5g三乙胺和480.1g甲苯加入反应瓶，控制温度为10℃左右，将上述浓缩备用液滴加到反应瓶体系中。滴毕，体系搅拌1h后加稀盐酸淬灭反应，分液有机相依次用水、饱和碳酸氢钠、水洗涤一次，浓缩得到116.0g2-苄氧-吗啉基乙酰胺(化合物4)，收率：90.3％，HPLC纯度≥97.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.33-7.28(m,5H),4.56(s,2H),4.14(s,2H),3.63-3.57(m,6H),3.45-3.44(br,2H)。
(3)乙酰乙酸叔戊酯(化合物5a)的合成
将500g叔戊醇和34.6g4-二甲胺基吡啶溶解于2.5L无水四氢呋喃中，降至5℃左右，然后缓慢滴加新鲜蒸馏的524.3g双烯酮。滴毕，恢复到20℃左右反应，TLC监测反应完全。蒸馏除去溶剂和过量的双烯酮，然后减压蒸馏(5～8mmHg，80～90℃)纯化得到732.5g乙酰乙酸叔戊酯(化合物5a)，收率：75.2％，GC纯度≥98.5％。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.11(s,2H),3.39(s,2H),2.28(s,3H),1.81(q,J＝7.4Hz,2H),1.47(s,6H),0.92(t,J＝7.5Hz,3H)。
(4)6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸环戊酯(化合物6a)的合成
将72.3g氢化钠悬浮在1600.1g四氢呋喃中，控制温度为10℃左右滴加387.3g乙酰乙酸叔戊酯，降温至-20℃左右，然后缓慢滴加722.5mL正丁基锂，滴毕，再滴加300.3g化合物4，TLC监测反应完全。稀盐酸加到体系中淬灭反应，分液后水相用甲基叔丁基醚萃取，合并有机相浓缩得200.8g的6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸环戊酯(化合物6a)，收率：70.0％，HPLC纯度≥98.2％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.32-7.23(m,5H),6.08(s,2H),5.23(s,2H),3.24(s,2H),3.09(s,2H),1.14-1.02(m,8H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(5)(3R,5S)-6-(苄氧基)-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7a)的合成
向反应瓶中加入纯化水(4.0mL/g化合物6a)和6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸叔戊酯(化合物6a，1.0mol)，搅拌均匀后加入双羰基还原酶突变体I94V+F231W粗酶液，其中还原酶突变体质量相对于化合物6a的质量约为0.1mg/g、甲酸铵(2.0mol)、NAD+(0.03mol)，调节pH＝6.2～6.4，然后将体系升温至30℃左右，保温约20h。反应结束后将体系升温至65～70℃破坏酶蛋白，加入乙酸乙酯，过硅胶垫， 分液，水相用乙酸乙酯反萃，合并有机相，浓缩，得到产品(3R,5S)-6-(苄氧基)-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7a)，纯度为95％，收率73.1％，ee值大于99.3％，de值93.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)：δ:7.37-7.30(m,5H),6.12(s,2H),4.59(d,J＝7.2Hz,2H),4.31(br,1H),4.14(br,1H),3.09(s,2H),1.14-1.02(m,8H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(6)(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a)的合成
向反应瓶中加入丙酮(10.0mL/g化合物7a)、(3R,5S)-6-苄氧基-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7a，1.0mol)、2,2-二甲氧基丙烷(2.0mol)和催化量的对甲苯磺酸吡啶盐(0.02mol)，搅拌，体系于20℃左右反应至原料(化合物7a)基本消失，加入质量分数为3％的稀盐酸(0.05mol)洗涤，再加入饱和碳酸氢钠水溶液中和体系，减压下除去低沸点物质后加水，分液，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，有机相过硅胶垫后浓缩，得到产品(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a)，纯度为93.5％，收率为90.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.35-7.28(m,5H),6.13(s,2H),4.80(d,J＝7.5Hz,2H),4.33-4.28(m,1H),4.12-4.07(m,1H),2.87-2.64(m,2H),1.83-1.79(m,2H),1.37-1.29(m,14H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H)。
(7)(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物9a)的合成
向反应瓶中加入乙酸乙酯(10.0mL/g化合物8a)、(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a，1.0mol)和金属催化剂氢氧化钯(5％)，搅拌，体系密封好后先用氮气置换五次，再用氢气置换三次，体系于20℃左右反应至原料(化合物8a)基本消失。用氮气置换三次，排压后，将体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤两次，合并滤液和淋洗液，浓缩至干，得到产品(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物9a)，产品纯度为96.7％，收率为93.9％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.33-4.26(m,1H),4.01-3.98(m,1H),3.81-3.48(m,2H),2.46-2.30(m,2H),1.79-1.76(m,2H),1.42-1.33(m,14H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(8)(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物Ia)的 合成
向反应瓶中加入二氯甲烷(10.0mL/g化合物9a)和2-((4R,6S)-6-甲氧基-2,2-二甲基-[1,3]二环氧-4-基)-乙酸酯(化合物9a，1.0mol)，搅拌，将体系降温至-10～0℃之间，加入二甲基亚砜(10.0mol)和N，N-二异丙基乙胺(3.5mol)，然后分批加入三氧化硫吡啶(3.25mol)，加毕后，保温反应至化合物9a基本消失。然后向体系中加入纯化水淬灭反应，分液，水相用二氯甲烷反萃一次，合并有机相，并用纯化水洗涤，浓缩至干，得到目标侧链产物(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(式Ia)，产品纯度为93.2％，收率为82.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.58(s,1H),4.34-4.30(m,2H),2.43-2.37(m,2H),2.46-2.30(m,2H),1.57-1.43(m,2H),1.43-1.36(m,12H),0.89(t,J＝7.8Hz,3H)。
实施例3用于他汀类药物的手性中间体的制备
(1)苄氧乙酸(化合物3)的合成
向反应瓶中加入720.3g四氢呋喃和41.1g甲苯，控制体系温度为10-20℃之间，分四批加入382.1g氢氧化钠，加完氢氧化钠后体系再分三批加入1371.1g苯甲醇。将300.2g氯乙酸溶于720.5g四氢呋喃后，控制滴加温度为70-80℃之间，将氯乙酸的四氢呋喃溶液滴加到前述体系中，体系反应至氯乙酸消耗完全。体系冷却后加3.1Kg纯化水然后在减压下除去四氢呋喃，水相用甲苯萃取四次，10-20℃下用盐酸调节水相的pH为3.2，水相用甲基叔丁基醚萃取两次后浓缩得到410.5g苄氧基乙酸(化合物3)，收率：86.2％，GC纯度≥99.1％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:12.28(br,1H),7.34-7.30(m,5H),4.59(s,2H),4.12(s,2H)。
(2)2-苄氧-吗啉乙酰胺(化合物4)的合成
向反应瓶中加入700.0g甲苯和110.1g化合物3，控制体系温度为10-20℃之间滴加557.3g二氯亚砜，加完二氯亚砜后体系搅拌1h后浓缩除去低沸点物质，备用。将48.0g吗啉、75.1g三乙胺和480.0g甲苯加入反应瓶中，控制温度为15℃左右，将上述浓缩备用液滴加到反应瓶体系中。滴毕，体系搅拌1h后加稀盐酸淬灭反应，分液有机相依次用水、饱和碳酸氢钠、水洗涤一次，浓缩得到116.3g2-苄氧-吗啉基乙酰胺(化合物4)，收率：90.2％，HPLC纯度≥97.5％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.33-7.28(m,5H),4.56(s,2H),4.14(s,2H),3.63-3.57(m,6H),3.45-3.44(br,2H)。
(3)乙酰乙酸叔戊酯(化合物5a)的合成
将500.0g叔戊醇和34.6g4-二甲胺基吡啶溶解于2.5L无水四氢呋喃中，降至5℃左右，然后缓慢滴加新鲜蒸馏的524.2g双烯酮。滴毕，恢复到15℃左右反应，TLC监测反应完全。蒸馏除去溶剂和过量的双烯酮，然后减压蒸馏(5～8毫米汞柱，80～90℃)纯化得到732.2g乙酰乙酸叔戊酯(化合物5a)，收率：75.3％，GC纯度≥98.5％。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ6.11(s,2H),3.39(s,2H),2.28(s,3H),1.81(q,J＝7.4Hz,2H),1.47(s,6H),0.92(t,J＝7.5Hz,3H)。
(4)6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸环戊酯(化合物6a)的合成
将144.6g氢氧化钠悬浮在1600.2g四氢呋喃中，控制温度为10℃左右滴加387.5g乙酰乙酸叔戊酯，降温至约-20℃，然后缓慢滴加722mL二异丙基乙基锂，滴毕，再滴加300.2g化合物4，TLC监测反应完全。稀盐酸加到体系中淬灭反应，分液后水相用甲基叔丁基醚萃取，合并有机相浓缩得194.8g的6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸环戊酯(化合物6a)，收率：68.2％，HPLC纯度≥98.3％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.32-7.23(m,5H),6.08(s,2H),5.23(s,2H),3.24(s,2H),3.09(s,2H),1.14-1.02(m,8H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(5)(3R,5S)-6-(苄氧基)-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7a)的合成
向反应瓶中加入纯化水(4.0mL/g化合物6a)和6-(苄氧基)-3,5-二氧代己酸叔戊酯(化合物6a，1.0mol)，搅拌均匀后加入双羰基还原酶突变体I94V+V151Q+F231W粗酶液，其中突变体质量相对于化合物6a的质量约为0.1mg/g、甲酸铵(2.0mol)，NAD+(0.03mol)，调节pH＝6.2～6.4，然后将体系升温至30℃左右，保温20h。反应结束后将体系升温至65～70℃破坏酶蛋白，加入乙酸乙酯，过硅胶垫，分液，水相用乙酸乙酯反萃，合并有机相，浓缩，得到产品(3R,5S)-6-(苄氧基)-3,5-二羟基己酸叔戊酯(化合物7a)，纯度为93.1％，收率73.2％，ee值大于99.3％，de值92.8％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.37-7.30(m,5H),6.12(s,2H),4.59(d,J＝7.2Hz,2H),4.31(br,1H),4.14(br,1H),3.09(s,2H),1.14-1.02(m,8H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(6)(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a)的合成
向反应瓶中加入丙酮(10.0mL/g化合物7a)、(3R,5S)-6-苄氧基-3,5-二羟基己 酸叔戊酯(化合物7a，1.0mol)、2,2-二甲氧基丙烷(2.0mol)和催化量的盐酸(0.02mol)，搅拌，体系于约25℃反应至原料化合物7a基本消失，加入质量分数为3％的稀盐酸(0.05mol)洗涤，再加入饱和碳酸氢钠水溶液中和体系，减压下除去低沸点物质后加水，分液，水相用乙酸乙酯萃取2次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤一次，有机相过硅胶垫后浓缩，得到产品(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a)，纯度为94.0％，收率为90.2％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:7.35-7.28(m,5H),6.13(s,2H),4.80(d,J＝7.5Hz,2H),4.33-4.28(m,1H),4.12-4.07(m,1H),2.87-2.64(m,2H),1.83-1.79(m,2H),1.37-1.29(m,14H),0.88(t,J＝7.5Hz,3H)。
(7)(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物9a)的制备
向反应瓶中加入乙酸乙酯(10.0mL/g化合物8a)、(4R-cis)-6-(苄氧基)-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物8a，1.0mol)和金属催化剂氢氧化钯(5％)，搅拌，体系密封好后先用氮气置换五次，再用氢气置换三次，体系于约25℃反应至化合物8a基本消失。用氮气置换三次，排压后，将体系抽滤，滤饼用乙酸乙酯洗涤两次，合并滤液和淋洗液，浓缩至干，得到产品(4R-cis)-6-羟甲基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物9a)，产品纯度为96.3％，收率为92.6％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:4.33-4.26(m,1H),4.01-3.98(m,1H),3.81-3.48(m,2H),2.46-2.30(m,2H),1.79-1.76(m,2H),1.42-1.33(m,14H),0.88(t,J＝7.6Hz,3H)。
(8)(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(化合物Ia)的合成
向反应瓶中加入二氯甲烷(10.0mL/g化合物9a)和2-((4R,6S)-6-甲氧基-2,2-二甲基-[1,3]二环氧-4-基)-乙酸酯(化合物9a，1.0mol)，搅拌，将体系降温至-10～0℃，加入二甲基亚砜(10mol)和三乙胺(3.5mol)，然后分批加入三氧化硫吡啶(3.25mol)，加毕后，保温反应至化合物9a基本消失。然后向体系中加入纯化水淬灭反应，分液，水相用二氯甲烷反萃一次，合并有机相，并用纯化水洗涤，浓缩至干，得到目标侧链产物(4R-cis)-6-甲酰基-2,2-二甲基-1,3-二氧己环-4-己酸叔戊酯(式Ia)，产品纯度为95.1％，收率为82.7％。
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ:9.58(s,1H),4.34-4.30(m,2H),2.43-2.37(m,2H),2.46-2.30(m,2H),1.57-1.43(m,2H),1.43-1.36(m,12H),0.89(t,J＝7.8Hz,3H)。
实施例4用于他汀类药物的手性中间体的制备
与实施例1的制备过程相似，不同的是乙酰乙酸酯为乙酰乙酸环戊酯，制备过程如下：
将500.0g环戊醇和20.5g异丙胺冷却至5℃左右，然后缓慢滴加新鲜蒸馏的500.0g双烯酮。滴毕，加热到60～70℃之间反应，TLC监测反应完全。降温至40℃以下，蒸馏出过量的双烯酮得到790.5g化合物乙酰乙酸环戊酯(化合物5b)，收率：80.2％，GC纯度≥97.5％。
1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.22(t,J＝5.8Hz,1H),3.40(s,2H),2.25(s,3H),1.91–1.79(m,2H),1.78–1.66(m,5H),1.65–1.53(m,2H)。
虽然为了说明本发明，已经公开了本发明的优选实施方案，但是本领域的技术人员应当理解，在不脱离权利要求书所限定的本发明构思和范围的情况下，可以对本发明做出各种修改、添加和替换。