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1、(10)申请公布号 CN 102928970 A (43)申请公布日 2013.02.13 CN 102928970 A *CN102928970A* (21)申请号 201210402820.4 (22)申请日 2012.10.19 G02B 21/00(2006.01) G02B 21/06(2006.01) G02B 21/36(2006.01) (71)申请人 华中科技大学 地址 430074 湖北省武汉市洪山区珞喻路 1037 号 (72)发明人 骆清铭 龚辉 许冬力 李安安 (74)专利代理机构 武汉开元知识产权代理有限 公司 42104 代理人 唐正玉 (54) 发明名称 一种大。
2、样本快速三维显微成像的方法和系统 (57) 摘要 本发明涉及一种大样本快速三维显微成像的 方法及系统， 本发明方法 ：（1） 样本包埋在样本块 中固定在精密三维电动平移台上 ；（2） 数字微镜 阵列工作在二值调制的模式下， 对照明光进行二 值调制， 形成结构光条纹， 结构光显微镜采集样本 表层 1 100 微米深度内的图像 ；（3） 完成成像区 域内表层的成像后， 利用金刚石或硬质合金刀具， 去除样本块表层已成像部分 ；（4） 重复步骤 （2） 和 步骤 （3） ， 直到完成数据获取任务。本发明的数字 微镜阵列工作在二值调制的模式下， 有效加快成 像速度 ； 通过数字微镜阵列与面阵相机的曝光同。
3、 步方法， 使得只有在面阵相机曝光时样本才会接 受到激发光的照射， 进一步降低样本的曝光量， 避 免光漂白效应对成像带来负面影响。 (51)Int.Cl. 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 4 页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 5 页 附图 4 页 1/2 页 2 1. 一种大样本快速三维显微成像的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： （1） 样本包埋在样本块中， 固定在精密三维电动平移台之上 ； （2） 数字微镜阵列工作在二值调制的模式下， 对照明光进行二值调制， 形成结构光条 纹， 结构光显微镜采集样本表层 1 100 微米深。
4、度内的图像 ； （3） 完成成像区域内表层的成像后， 利用金刚石或硬质合金刀具， 去除样本块表层已成 像部分 ； （4） 重复步骤 （2） 和步骤 （3） ， 直到完成数据获取任务。 2. 根据权利要求 1 所述的大样本快速三维显微成像的方法， 其特征在于所述步骤 （2） 具体方法为 ： （a） 数字微镜阵列工作在二值调制的模式下 ： 指当面阵相机进行曝光时， 数字微镜阵列 中的每个微型反射镜都工作在稳定状态下， 不进行任何翻转， 出射光在物镜焦面只有亮和 暗两种状态， 分别对应微型反射镜固定在入射光出射和非出射两种角度的状态， 不存在灰 度的变化 ； （b） 当曝光完成后， 数字微镜阵列中的。
5、微镜进行翻转， 改变至下一相位图案， 同时触发 面阵相机进行再次曝光， 重复该过程直到完成结构光成像所需的 0、 2/3pi 和 4/3pi 三幅不 同相位图像的采集 ； （c） 步骤 （b） 完成后， 数字微镜阵列中的微镜统一翻转至入射光非出射的角度上， 阻挡 照明光照射到样本上 ； （d） 压电位移器带动物镜进行轴向移动， 使物镜焦面对准同一个成像子区域的更深层 样本进行成像 ； （e）采 集 得 到 的 图 像 存 储 在 计 算 机 硬 盘 或 者 内 存 中，利 用 公 式 获得层析图像， S 表示层析图像， I 表示面值相机 获取的三幅原始图像， 其下标表示三幅原始图像的相位。 3。
6、. 一种大样本快速三维显微成像系统， 包括 ： 光源、 光导、 一块激发滤光片、 一块发射 滤光片、 三块透镜、 数字微镜阵列、 二块反射镜、 一块二向色镜、 压电位移器、 物镜、 精密三维 电动平移台、 面阵相机、 数字微镜阵列驱动板、 压电位移驱动器、 平台控制器、 图像采集卡、 计算机、 金刚石或硬质合金刀具， 其特征在于 ： 计算机分别与数字微镜阵列驱动板、 压电位 移驱动器、 平台控制器、 图像采集卡相连， 数字微镜阵列与数字微镜阵列驱动板相连， 压电 位移器与压电位移驱动器相连， 精密三维电动平移台与平台控制器相连， 面阵相机与图像 采集卡相连， 面阵相机受数字微 镜阵列驱动板输出。
7、的触发脉冲信号控制采集时刻 ； 由光源 出射的光耦合入光导中， 均匀化后经由激发滤光片、 第一透镜进行准直， 第一反射镜将光束 反射至数字微镜阵列中， 当数字微镜阵列中的微镜处于 12 状态时， 被微镜反射的光线经 由第二反射镜被第二透镜收集， 经过二向色镜反射后进入固定在压电位移器上的物镜中 ； 样本固定在精密三维电动平移台之上， 样本接受激发光后发出的光经物镜、 二向色镜， 第三 透镜和发射滤光片， 最后在面阵相机上成像 ； 金刚石或硬质合金刀具固定在钢制刀架上。 4. 根据权利要求 3 所述的大样本快速三维显微成像系统， 其特征在于 ： 所述的光源为 LED、 卤素灯或汞灯。 5. 根据。
8、权利要求 3 所述的大样本快速三维显微成像系统， 其特征在于 ： 所述的光导为 权 利 要 求 书 CN 102928970 A 2 2/2 页 3 光纤或液态光导。 6. 根据权利要求 3 所述的大样本快速三维显微成像系统， 其特征在于 ： 所述的面阵相 机为电荷耦合元件 CCD 相机或互补金属氧化物半导体 CMOS 相机。 权 利 要 求 书 CN 102928970 A 3 1/5 页 4 一种大样本快速三维显微成像的方法和系统 技术领域 0001 本发明涉及显微成像方法及系统， 具体地说是指一种适用于大样本的， 基于结构 光三维层析的显微光学成像方法及系统。 背景技术 0002 在光学。
9、显微镜领域， 人们一直追求能在更大的成像区域内对获取样本的三维细节 信息。 但这一目标受到三方面的因素的制约， 一是散射光的存在会导致背景光的产生， 导致 传统显微镜成像除了得到物镜焦面上的信息， 还会叠加上来自其它区域的模糊背景， 无法 获得样本的三维层析图像 ； 二是受限于显微物镜的视场和成像速度， 对于厘米级大样本的 显微成像通常需要数十天， 这不仅是对成像系统稳定性和寿命本身是一个很大的挑战， 成 像样本也很难在成像环境下长时间保持性状不变 ； 三是标记样本的成像信号强度会由于蛋 白的光漂白效应而在整个成像过程中不断下降， 成像时间越长， 曝光量越大， 光漂白对成像 的负面影响越大。 。
10、0003 美国专利 US6376818 中描述结构光显微成像作为一种具有获得光学断层成像数 据的成像技术， 基于面扫探测方式使其具有对样本进行快速成像的潜力。目前的结构光显 微镜的大都基于光栅作为光源的调制器， 使用压电位移的方式实现对结构照明光的相移， 这使得结构光显微镜的成像速度严重受限于光栅机械位移的速度， 一般情况只有 1 赫兹左 右。 另一类基于数字微镜阵列的结构光显微镜中(例如中国专利， 申请号200810071628.5， 201110448980.8)， 探测器进行曝光期间， 数字微镜驱动版通过产生一系列的脉宽调制信号 （PWM） 控制每个微镜开关状态的占空比， 数字微镜时刻在。
11、翻转， 在不同的两个状态下不停切 换， 产生 256 级不同亮度灰度图案。虽然数字微镜阵列中单个微镜的切换速度可达数万赫 兹， 但这种灰度调制方式将其有效调制速度限制在数十赫兹的水平上。且微型反射镜不断 的翻转， 使得即使在最亮的灰度级数下， 灰度调制的微镜阵列也无法将照明光全部反射至， 照明光的利用率较低， 降低了结构光照明图案的调制深度， 影响了成像速度和成像效果。 0004 综上所述， 现存的针对大样本的三维显微成像方法和系统存在以下不足 ：（1） 成 像速度慢， 对于结构光显微镜， 其成像速度主要受限于调制器的有效调制频率 ；（2） 光漂白 影响成像质量。这些问题在实际应用中限制了此类。
12、方法的发展和应用， 因此发展一种适用 于大样本的快速三维显微成像方法和系统很有必要。 发明内容 0005 本发明的提供一种大样本快速三维显微成像的方法和系统， 目的在于克服现有技 术中成像速度慢， 对样本光漂白严重， 机械加工对样本形态的影响的缺点。 0006 一种大样本快速三维显微成像的方法， 其特征在于包括以下步骤 ： 0007 （1） 样本包埋在样本块中， 固定在精密三维电动平移台之上 ； 0008 （2） 数字微镜阵列工作在二值调制的模式下， 作为结构光显微镜中的空间光调制 器， 对于照明光进行二值调制， 形成结构光条纹， 结构光显微镜采集样本表层 1 100 微米 说 明 书 CN 。
13、102928970 A 4 2/5 页 5 的深度内的图像 ； 0009 （3） 完成成像区域内表层的成像后， 利用金刚石或硬质合金刀具， 去除样本块表层 已成像部分 ； 0010 （4） 重复步骤 （2） 和步骤 （3） ， 直到完成数据获取任务。 0011 所述步骤 （2） 具体方法为 ： 0012 （a） 数字微镜阵列工作在二值调制的模式下 ： 指当面阵相机进行曝光时， 数字微镜 阵列中的每个微型反射镜都工作在稳定状态下， 不进行任何翻转， 出射光在物镜焦面只有 亮和暗两种状态， 分别对应微型反射镜固定在入射光出射和非出射两种角度的状态， 不存 在灰度的变化 ； 0013 （b） 当曝光。
14、完成后， 数字微镜阵列的微镜进行翻转， 改变至下一相位图案， 同时触 发面阵相机进行再次曝光， 重复该过程直到完成结构光成像所需的 0、 2/3pi 和 4/3pi 三幅 不同相位图像的采集 ； 0014 （c） 步骤 （b） 完成后， 数字微镜阵列中的微镜统一翻转至入射光非出射的角度上， 阻挡照明光照射到样本上 ； 0015 （d） 压电位移器带动物镜进行轴向移动， 使物镜焦面对准同一个成像子区域的更 深层样本进行成像。 0016 （e）采 集 得 到 的 图 像 存 储 在 计 算 机 硬 盘 或 者 内 存 中，利 用 公 式 获得层析图像， S 表示层析图像， I 表示面值相机 获取的。
15、三幅原始图像， 其下标表示三幅原始图像的相位 ； 0017 一种大样本快速三维显微成像系统， 包括 ： 光源、 光导、 一块激发滤光片、 一块发射 滤光片、 三块透镜、 数字微镜阵列、 二块反射镜、 一块二向色镜、 压电位移器、 物镜、 精密三维 电动平移台、 面阵相机、 数字微镜阵列驱动板、 压电位移驱动器、 平台控制器、 图像采集卡、 计算机、 金刚石或硬质合金刀具， 其特征在于 ： 计算机分别与数字微镜阵列驱动板、 压电位 移驱动器、 平台控制器、 图像采集卡相连， 数字微镜阵列与数字微镜阵列驱动板相连， 压电 位移器与压电位移驱动器相连， 精密三维电动平移台与平台控制器相连， 面阵相机。
16、与图像 采集卡相连， 面阵相机受数字微镜阵列驱动板输出的触发脉冲信号控制采集时刻 ； 由光源 出射的光耦合入光导中， 均匀化后经由激发滤光片、 第一透镜进行准直， 第一反射镜将光束 反射至数字微镜阵列中， 当数字微镜阵列中的微镜处于 12 状态时， 被微镜反射的光线经 由第二反射镜被第二透镜收集， 经过二向色镜反射后进入固定在压电位移器上的物镜中 ； 样本固定在精密三维电动平移台之上， 样本接受激发光后发出的光经物镜、 二向色镜， 第三 透镜和发射滤光片， 最后在面阵相机上成像 ； 金刚石或硬质合金刀具固定在钢制刀架上。 0018 所述的光源为 LED、 卤素灯或汞灯。 0019 所述的光导为。
17、光纤或液态光导。 0020 所述的面阵相机可以是电荷耦合元件 CCD 相机或互补金属氧化物半导体 CMOS 相 机。 0021 计算机用于控制成像的进行， 存储采集的图像数据与平台的移动 ； 0022 平台控制器连接至计算机并受计算机控制， 驱动控制精密三维电动平移台的移 动， 样本由精密三维电动平移台带动移动 ； 0023 光源出射光线耦合入光导均匀化后， 经过激发滤光片和第一透镜进行准直后被第 说 明 书 CN 102928970 A 5 3/5 页 6 一反射镜反射至数字微镜阵列中 ； 0024 数字微镜阵列作为空间光调制器产生结构光条纹 ； 0025 压电位移驱动器驱动压电位移器， 压。
18、电位移器带动物镜移动， 用于物镜对样本进 行轴向扫描， 压电位移驱动器受计算机控制 ； 0026 金刚石或硬质合金刀具用于切削已成像的样本表层， 计算机通过平台自动控制精 密三维电动平移台， 带动样本移动， 利用刀具与样本间的相对位移完成切削。 0027 综上所述， 本发明较现有技术具有下列优点 ： 0028 （1） 数字微镜阵列工作在二值调制的模式下， 其最高有效调制频率即为数字微镜 的切换速率， 可达数万赫兹以上， 将有效加快成像速度。 0029 （2） 通过数字微镜阵列与面阵相机的曝光进行同步的方法， 使得只有在面阵相机 的曝光时样本才会接受到激发光的照射， 进一步降低样本的曝光量， 避。
19、免光漂白效应对成 像带来负面影响。 附图说明 0030 图 1 为本发明大样本快速三维显微成像方法的流程图。 0031 图 2 为本发明的成像区域划分示意图。 0032 图 3 为本发明的系统结构示意图。 0033 图 4 为本发明的控制结构图。 具体实施方式 0034 下面结合附图和实施方式对本发明作进一步详细的说明。 0035 图 1 为一种大样本快速三维显微成像方法的流程图。在步骤 S101 ： 计算机确定样 本的成像区域， 包括成像的深度， 计算机根据区域的大小自动确定成像的子区域 ； 接下来执 行步骤 S102 ： 计算机控制平台控制器， 移动精密三维电动平移台， 使物镜对准第一个成。
20、像 子区域 ； 步骤 S103 ： 精密三维电动平移台停稳 ； 步骤 S104 ： 计算机控制压电位移驱动器， 驱 动压电位移器带动物镜做轴向位移， 使显微物镜的焦面对准样本的设定深度， 开始采集 ； 步 骤 S105 ： 数字微镜阵列产生结构光显微成像所需的相应的周期照明条纹 ； 步骤 S106 ： 光学 传感器也就是面阵相机进行数据采集 ； 步骤 S105 和 S106 反复进行直到完成结构光成像所 需的三幅相位分别为 0、 2/3pi 和 4/3pi 的图象 ； 步骤 S107 ： 判断是否完成三幅不同相位结 构光图像的采集， 如是不是回到步骤 S105， 如是进行步骤 S108 ： 将。
21、数字微镜阵列的所有微 镜置于-12的状态， 阻挡照明光进入物镜后孔径中 ； 计算机执行步骤S109 ： 对采集的三幅 图像使用结构光成像的计算公式， S 表示层析图 像， I 表示面值相机获取的三幅原始图像， 其下标表示三幅原始图像的相位 ； 获得该子区域 中第一层光学断层图像， 并存储在计算机的存储设备中 ； 步骤 S110 ： 确认该子区域是否完 成设定深度方向上的成像， 若没有则重复S104至S109的步骤直至完成 ； 若完成则执行步骤 S111 ： 检测是否已经完成表层成像区域内的采集， 若没有， 执行步骤 S112 ： 精密三维电动平 移台移动带动样本移动到下一成像子区域， 返回到步。
22、骤 S103 ； 若完成， 则执行步骤 S113 ： 检 测是否已经完成设定的深度采集， 若没有则执行步骤 S114 ： 使用金刚石刀具切除已成像的 表层区域， 然后返回到步骤 S112 ； 若已完成， 则停止采集 （即步骤 S115） 。 说 明 书 CN 102928970 A 6 4/5 页 7 0036 图 2 为一种大样本快速三维显微成像方法的成像区域划分示意图， 成像区域包含 样本块中的感兴趣区域。成像区域进一步划分成较小的成像子区域， 该子区域比显微镜一 次成像的视场略小， 且相邻的子区域间具有少部分的重叠区域。 0037 图 3 为一种大样本快速三维显微成像系统的结构简图， 由。
23、光源 1（可以是 LED、 卤 素灯或汞灯等非相干光源） 出射的光耦合入光导 2（可以是光纤或者液态光导） 中， 均匀化 后经由激发滤光片3、 第一透镜4进行准直， 第一反射镜5将光束反射至数字微镜阵列6中， 当数字微镜阵列中的微镜处于 12 状态时， 准直光束被微镜反射至第二反射镜 7， 并由第 二透镜 8 收集， 经过二向色镜 9 反射后进入固定在压电位移器 10 上的物镜 11 中 ； 样本 12 固定在精密三维电动平移台13之上， 样本接受激发光后发出的光经物镜11、 二向色镜9、 第 三透镜 14 和发射滤光片 15， 最后在面阵相机 16（可以是 CCD 相机或者 CMOS 相机）。
24、 上成像， 刀具 17 用于对已成像的样本表面进行切削加工。 0038 图 4 为一种大样本快速三维显微成像的系统控制结构， 计算机 18 通过驱动板 19 驱动数字微镜阵列6进行翻转 ； 通过压电位移驱动器20控制及驱动压电位移器10 ； 通过平 台控制器 21 控制精密三维电动平移台 13 ； 通过图像采集卡 22 控制面阵相机 16， 并传输采 集的图像至计算机。 实施例 0039 光源采用 Lumen Dynamics 公司生产的 X-cite 120 金属卤化物光源， 该光源自带 输出光纤。数字微镜阵列的规格为 0.7 XGA， 微镜具有 +12 和 -12 两种工作状态。精密 三维。
25、电动平移台采用美国 Aerotech 公司的产品， 精密三维电动平移台置于大理石平台上， 定位精度为亚微米级别， 以满足精密切削和成像的需求。金刚石刀具采用电镜科学中常用 的直线刃金刚石刀具， 刀刃角度为 35， 宽度 3 毫米， 刀具连同刀托固定在钢制刀架上。 0040 成像物镜采用日本 Olympus 的 40x 消色差物镜。压电位移器使用德国 PI 公司产 品， 其定位精度可达 5 纳米。激发滤光片的中心波长为 500 纳米， 二向色镜的透射 / 反射转 换波长为 520 纳米， 发射滤光片的中心波长为 542 纳米。面阵相机采用 Andor 公司科研级 CCD 相机， 像素规格为 20。
26、48x2048。 0041 金刚石刀具一次切片宽度为2000微米， 厚度为20微米， 多次切削将样本块的顶部 表面加工平整后， 开始数据的采集工作。精密三维电动平移台带动样本移动到第一个子区 域， 设定每个成像子区域的大小为 500x500 微米， 相邻子区域间的重叠区域宽度为 5 微米。 面阵相机完成一次曝光和数据传输的时间为 10 毫秒， 由于数字微镜阵列工作在二值状态 下翻转时间在十微秒量级， 相比可以忽略， 采集三幅图像耗时 30 毫秒。压电位移器带动物 镜在轴向以 1 微米的间隔采集 20 微米厚深度的图像， 每次轴向移动需要 30 毫秒的时间， 采 集一个子区域的表层图像共需要 1。
27、.2 秒的时间。假设数字微镜阵列工作在灰度状态下 （即 镜片不断翻转） ， 其调制速度限制在 60 赫兹， 微镜需要 17 毫秒完成一次调制， 而采集一个子 区域的表层图像共需要 2.22 秒， 对比本发明的方法要多出 85% 的时间。完成一个子区域表 层的采集后， 精密三维电动平移台带动样本移动至下一子区域， 需时约 300 毫秒， 重复成像 的步骤直到该表层完成采集。可以估算若是对一个成像区域为 1 平方厘米的样本表层进行 成像， 使用本发明的方法需要 600 秒， 而常规方法需要 1008 秒的时间。再考虑样本曝光量， 由于精密三维电动平移台带动样本移动时， 样本不进行曝光， 实际接受的曝光时间为 480 说 明 书 CN 102928970 A 7 5/5 页 8 秒， 对比常规方法减少 52% 以上的曝光量， 减轻了样本光漂白的效应。 说 明 书 CN 102928970 A 8 1/4 页 9 图 1 说 明 书 附 图 CN 102928970 A 9 2/4 页 10 图 2 说 明 书 附 图 CN 102928970 A 10 3/4 页 11 图 3 说 明 书 附 图 CN 102928970 A 11 4/4 页 12 图 4 说 明 书 附 图 CN 102928970 A 12 。