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1、10申请公布号CN104046627A43申请公布日20140917CN104046627A21申请号201410249902922申请日20140606C12N15/11200601C12Q1/6820060171申请人江苏里下河地区农业科学研究所地址225007江苏省扬州市扬子江北路568号72发明人张勇张伯桥高德荣吴宏亚张晓张晓祥朱冬梅程凯74专利代理机构北京轻创知识产权代理有限公司11212代理人赵秀斌54发明名称一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法57摘要本发明涉及一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法，所述分子标记是以小麦基因组DNA为底物，以GW。
2、M6421D为SSR引物，进行PCR扩增所得的扩增片段，用于检测小麦面粉水溶剂保持力的特性，该标记不同的等位变异能够解释该性状表型变异的10571568，其中，分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。本申请为小麦面粉水溶剂保持力在品质育种中的分子标记辅助选择提供一条可行的途径。51INTCL权利要求书1页说明书12页序列表1页附图1页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书12页序列表1页附图1页10申请公布号CN104046627ACN104046627A1/1页2。
3、1一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记，其特征在于，所述分子标记是以小麦基因组DNA为底物，以GWM6421D为SSR引物，进行PCR扩增所得的扩增片段，用于检测小麦面粉水溶剂保持力的特性，该标记不同的等位变异能够解释该性状表型变异的10571568，其中，分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。2一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记方法，其特征在于，包括1PCR反应体系为总计10L，包括4NG/L模板DNA，1PCRBUFFER，2MMOL/LMG2，02MOL/L荧光引物，25MMO。
4、L/LDNTP，06U/LTAQDNATAQDNA聚合酶；2扩增程序为94预变性5MIN，前两个循环94变性45S，65退火45S，72延伸55S，随后每两个循环退火温度降2，直至55，保持退火温度55扩增25个循环，最后72延伸10MIN，然后降至4保存；3扩增产物检测在扩增产物中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，用70乙醇洗涤，然后溶解于30L无离子水中，用DNA测序仪ABI3730进行分析，通过GENEMAPPER30进行扩增条带的读取。其中分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。3根据权利要求。
5、2所述的分子标记方法，其特征在于，所述分子标记的上游引物序列如SEQIDNO1所示，下游引物序列如SEQIDNO2所示。权利要求书CN104046627A1/12页3一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法技术领域0001本发明涉及一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法，属于作物遗传育种学领域。背景技术00021994年美国NABISCO饼干公司的小麦粉及烘焙专家SLADE和LEVINE提出了软质小麦品质评价的新方法溶剂保持力SOLVENTRETENTIONCAPACITY，简称SRC，该方法于1999年通过了美国谷物化学协会AACC的认定，编号为AACC5611。
6、。该方法以含水量14的面粉为基准，经过离心后，面粉所保持溶剂质量占面粉干重的百分比作为溶剂保持能力SRC。用于检测的溶剂分为4种，主要有蒸馏水、5碳酸钠溶液、5乳酸溶液以及50蔗糖溶液，其中碳酸钠SRC与面粉中破损淀粉数量相关，乳酸SRC值与麦谷蛋白特性有关，蔗糖SRC则与戊聚糖特性有关，而水SRC受面粉中所有成分的影响，其数值大小可以反映面粉的综合特性。通过4种SRC检测，则可以反映面粉更多的理化特性，从而能够更好地推断面粉的烘焙特性。现SRC在美国已成为评价软麦品质的主导方法。0003面粉的不同品质特性均可以通过不同的SRC得到反映，其中面粉的面筋特性可以通过乳酸SRC值大小来评价，在一定。
7、范围内，乳酸SRC值越高则表明软麦的面筋特性越好；醇溶蛋白的特性可以通过蔗糖SRC值得到反映，在一定范围内，蔗糖SRC值低则醇溶蛋白特性好；破损淀粉的数量则可以通过碳酸钠SRC值大小来评价，其值低则表示破损淀粉含量也较低；而水SRC受面粉中全部成分的影响，反映了面粉组分的综合特性。因为饼干为低水分含量的烘焙食品，因此要求原料面粉具有较低的吸水率、淀粉破损率和戊聚糖含量，SRC检测则正好弥补了饼干测试的某些不足之处，为饼干品质的评价提供了更多的面粉品质特性信息。0004关于SRC值在软麦主要是饼干粉评价中的指标的确定，张岐军研究后认为根据我国弱筋小麦特点，其适宜的SRC值范围为水SRC、碳酸钠S。
8、RC、蔗糖SRC和乳酸SRC值分别为53、66、87和779851，其中与AACC方法划分标准较为接近的为水SRC、碳酸钠SRC、蔗糖SRC，而乳酸SRC则与之相反。0005GUTTIERI等研究结果表明SRC在不同品种间即基因型间差异显著，GUTTIERI和SOUZA等对VANNA/PENAWAWA,KANTO107/IDO488和M2/IDO470等3个软麦组合重组自交系后代群体的研究表明基因型是影响SRC值的主要因素。张岐军等研究结果也表明影响SRC值的主要因素为基因型，除个别指标外，基因型环境间互作对SRC影响均不显著，因此与蛋白含量作为弱筋小麦的品质选择指标相比以SRC值来筛选弱筋品。
9、种则更为可靠。夏云祥研究结果表明决定SRC值的主要因素仍是基因型，不同环境对WSRC影响较小。0006在小麦SRC值的QTL定位研究方面，NSMITH和ESOUZA2008年利用187个选自美国软麦实验室资源库的品种，采用关联分析的方法定位了分别与碳酸钠SRC、乳酸SRC、蔗糖SRC、饼干直径等相关联的分子标记BARC98、GWM429、BARC010和BARC101等，这些标记说明书CN104046627A2/12页4均位于2B染色体上。马庆利用宁7840/CLARK的重组自交系群体材料进行了SRC的QTL定位研究，在染色体5DS上发现了1个与WSRC相关的QTL，在5D、6D染色体上定位出。
10、2个与乳酸SRC相关的QTL，加性效应分别为47和54,各自解释了115和152的表型变异。在4D染色体上发现与碳酸钠SRC相关的QTL1个，加性效应14，贡献率为122。在染色体5A和5D上分别发现与蔗糖SRC相关的QTL各1个，这两个QTL的加性效应分别为284和271，各自解释159和99的表型变异。0007利用关联分析的方法进行SRC的QTL关联定位研究国内尚未见报导。0008尽管SRC检测所需仪器设备比较简单、操作也很方便，但目前在品种遗传改良中主要还是用于种质资源的筛选方面，尚未有育成品种的报导。由于水SRC能够综合反映面粉的特性，而且具有易操作等特点，在江苏里下河地区农科所的高世。
11、代小麦品系检测中已经开始使用。由于小麦品质育种的特殊性，往往需要在种子收获后再根据有关理化指标的检测来进行选择，无法在试验田间就对育种早世代材料进行直接选择，而且在回交或滚动回交育种中则必须根据籽粒测定结果进行选择后再于下季进行配组，严重影响育种进度，因此如果能筛选出稳定可靠的溶剂保持力SRC分子标记并且在育种中加以应用将会促进弱筋小麦育种效率的提高。发明内容0009本发明所要解决的技术问题是提供一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记及分子标记方法，为小麦面粉水溶剂保持力在品质育种中的分子标记辅助选择提供一条可行的途径。0010本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种与小麦面粉水溶剂保持力关。
12、联的分子标记，所述分子标记是以小麦基因组DNA为底物，以GWM6421D为SSR引物，进行PCR扩增所得的扩增片段，用于检测小麦面粉水溶剂保持力的特性，该标记不同的等位变异能够解释该性状表型变异的10571568，其中，分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。0011本发明解决上述技术问题的技术方案如下一种与小麦面粉水溶剂保持力关联的分子标记方法，包括00121PCR反应体系为总计10L，包括4NG/L模板DNA，1PCRBUFFER，2MMOL/LMG2，02MOL/L荧光引物，25MMOL/。
13、LDNTP，06U/LTAQDNATAQDNA聚合酶；00132扩增程序为94预变性5MIN，前两个循环94变性45S，65退火45S，72延伸55S，随后每两个循环退火温度降2，直至55，保持退火温度55扩增25个循环，最后72延伸10MIN，然后降至4保存；00143扩增产物检测在扩增产物中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，用70乙醇洗涤，然后溶解于30L无离子水中，用DNA测序仪ABI3730进行分析，通过GENEMAPPER30进行扩增条带的读取。其中分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。0。
14、015在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进。0016进一步，所述分子标记的上游引物序列如SEQIDNO1所示，下游引物序列如SEQ说明书CN104046627A3/12页5IDNO2所示。0017本发明的有益效果是00181、由于溶剂保持力是通过小麦收获后籽粒来检测面粉的特性，在育种中难以在田间直接筛选，而与溶剂保持力相关联的标记可以利用叶片尽早进行DNA检测来预测和筛选；00192、本发明通过关联分析定位了与面粉水溶剂保持力极显著相关联的SSR分子标记GWM6421D位于RODER发表的小麦遗传连锁图1D的75CM处,参考文献MS，KORZUNV，WENDEHAKEK，PLASCH。
15、KEJ，TIXIERMH，LEROYP，GANALMWAMICROSATELLITEMAPOFWHEATGENETICS，1998，149420072023，可以解释水溶剂保持力表型变异的10571568，检测程序简单，适于杂交和回交育种中目的供体单株的确定，提高选择效率。00203、本发明提供了一种与小麦面粉水溶剂保持力极显著P001相关联的分子标记，使用的与小麦面粉水溶剂保持力相关联的分子标记在国内外均未有发表过。利用该标记可对田间植株DNA进行小麦面粉溶剂保持力的分子标记辅助选择，从而节约成本，提高育种效率。附图说明0021图1为3730DNA测序仪荧光标记结果，GWM6421D等位变异。
16、188BP图；0022图2为3730DNA测序仪荧光标记结果，GWM6421D等位变异202BP图；具体实施方式0023以下对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。0024实验例0025一、试验材料0026试验收集了190个品种，在进行基因型分析时根据试验结果剔除了14个亲缘关系过近的品种，实际用于关联分析的品种清单见表1。0027表1用于分析的176个品种说明书CN104046627A4/12页6002800290030二、试验设计0031以上材料分别于20082009年、20092010年和20102011年3个生长季种植于江苏里下河地区农科所试验。
17、基地江苏扬州湾头镇夏桥村，田间试验采用随机区组设计、说明书CN104046627A5/12页73次重复，每个试验小区种植4行，每行40粒，粒播。行长4尺，行距7寸，相邻的材料间留1空行间隔开。0032三、基因型的检测0033本试验利用了SSR标记和荧光SSR标记进行了基因型检测。00341、试验从834对SSR引物中筛选了多态性较好、带型清晰的引物共154对见表2，对参试的176个品种进行了基因型检测，于2011年在江苏里下河地区农科所完成。引物包括BARC、CFA、CFD、GWM、GDM、WMC等类型。00351田间采摘小麦苗期单株叶片，采用夏先春分子操作书中CTAB法提取小麦基因组DNA，。
18、所用材料与具体步骤0036材料小麦幼嫩叶片或成熟籽粒。0037主要仪器EPPENDORF微量移液器、高速冷冻离心机、研钵、EPPENDORF管、恒温水浴锅、恒温摇床等。0038试剂的配置00391CTAB抽提缓冲液20GCTAB，1MTRISHCLPH80100ML，05MEDTAPH80100ML，5MNACL280ML，用蒸馏水定容至1000ML，灭菌后加巯基乙醇至10MM。004023MNAACPH52。00413酚/氯仿/异戊醇按照25241的比例配制，氯仿/异戊醇按照241的比例配制，存放于20备用酚为TRIS平衡酚。00424异丙醇，无水乙醇，70乙醇，灭菌DDH2O或TE溶液。0。
19、043操作步骤00441取小麦幼嫩叶片12G，放入液氮预冷的研钵中，加入液氮研磨至粉末状样品数较多时，可使用高通量组织研磨器；样品量较少时，可以直接将样品放入20ML的EPPENDORF管中，加液氮，用筷子研磨；如样品为成熟籽粒，机械粉碎至粉末状即可。00452立即转移粉末至加有900L提取液的20MLEPPENDORF管中，充分混匀不可过于强烈震荡以防基因组DNA断裂，于65水浴1030MIN，并不时摇动。00463冷却至室温后，4，12000RPM离心15MIN。00474转移上清至另一无菌20MLEPPENDORF管中，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，轻轻颠倒EPPENDORF管数次，静置。
20、10MIN后，4，12000RPM离心10MIN。00485转移上清至另一无菌20MLEPPENDORF管中，加入等体积氯仿/异戊醇，轻轻颠倒EPPENDORF管数次，静置10MIN后，4，12000RPM离心10MIN。00496转移上清至另一无菌15MLEPPENDORF管中切勿吸到中间层及下层，加入1/10体积的3MNAAC，充分混匀后，加入2/3体积的的异丙醇，混匀，20沉淀30MIN后，4，12000RPM离心10MIN。00507弃上清，沉淀用1ML70乙醇洗涤2次。4，12000RPM，离心10MIN。00518弃上清，在超净台吹干滤纸上慢慢倒扣，防止沉淀脱落，加入适量的灭菌DD。
21、H2O或TE溶解DNA。0052表2分析使用的SSR引物0053说明书CN104046627A6/12页800540055表2分析使用的SSR引物说明书CN104046627A7/12页90056005700582PCR反应体系为总计10L，包括10PCRBUFFER1L，25MMMGCL21L，2MMDNTPMIXTURE02L，引物工作液15L，TAQDNA聚合酶5U/L01L，模板DNA1L，无菌蒸馏水52L。所述引物为0059上游引物5ACGGCGAGAAGGTGCTC30060下游引物5CATGAAAGGCAAGTTCGTCA300613扩增程序为94预变性5MIN，前两个循环94变。
22、性45S，65退火45S，72延伸55S，随后每两个循环退火温度降2，直至55，保持退火温度55扩增25个循环，说明书CN104046627A8/12页10最后72延伸10MIN，然后降至4保存。00624电泳为6聚丙烯酰胺凝胶电泳，将PCR扩增产物加入等体积的LOADINGBUFFER，在PCR仪上95变性5分钟，快速取出并放至冰水混合物2分钟以上备用，变性后的PCR产物在6的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，采用银染法检测。00632、ABI3730荧光标记检测分析0064取10株小苗叶片混合，在液氮中磨样。按照CTAB法提取全基因组DNA和上面步骤一样，用1TE稀释至20NGL1备用。0065本。
23、研究扫描了106个荧光SSR位点见表3。于2013年在中国农科院作科所完成。0066PCR反应体系为总计10L，包括4NG/L模板DNA，1PCRBUFFER，2MMOL/LMG2，02MOL/L荧光引物，25MMOL/LDNTP，06U/LTAQDNATAQDNA聚合酶；0067扩增程序为94预变性5MIN，前两个循环94变性45S，65退火45S，72延伸55S，随后每两个循环退火温度降2，直至55，保持退火温度55扩增25个循环，最后72延伸10MIN，然后降至4保存；0068PCR扩增产物检测在扩增产物中加入3倍体积的无水乙醇沉淀，用70乙醇洗涤，然后溶解于30L无离子水中，用DNA测。
24、序仪ABI3730进行分析，通过GENEMAPPER30进行扩增条带的读取。0069表3、用于检测的荧光SSR引物汇总表说明书CN104046627A109/12页11007000710072四、溶剂保持力检测00731、溶剂保持力的测定说明书CN104046627A1110/12页120074试剂蒸馏水；007550蔗糖溶液称取50G蔗糖分析纯溶解于50G蒸馏水。00765碳酸钠溶液称取5G碳酸钠分析纯溶解于95G蒸馏水。00775乳酸将已知浓度的DL型乳酸分析纯，按一定配比添加蒸馏水稀释至5。0078步骤抽取参试品种收获后种子样品磨成全麦粉，然后进行包括水、5乳酸、5碳酸钠和50蔗糖等4种。
25、SRC的检测，检测方法参照AACC5611进行，并按比例缩小至1克粉等。0079原AACC5611法如下00801量取蒸馏水、5乳酸、5碳酸钠溶液和50蔗糖溶液制备检测溶液；00812称取5OML离心管包含管盖的质量M1；00822准确称取5000005克面粉其水分含量已知放进已经称重的离心管中；00833将2500005克溶剂加入离心管中，同时开始按表计时；00844将管盖扣紧，摇晃约5秒钟，使面粉悬浮；00855使面粉与溶剂溶涨20分钟，并每隔5分钟即5、10、L5、20分钟时各摇晃一次每次约5秒钟；00866迅速将试验样品放入离心机，在1000G力条件下离心15分钟不包含到达1000G离。
26、心力前的时间；00877待离心机停稳后小心取出离心管，待上清液缓慢倒出后将试管垂直倒置于吸水纸上静置10分钟；00888再次称取离心管包括管盖的质量M2；00899计算各溶剂的SRC值。0090本试验中按照标准法以1克粉样品用量按比例缩小；准确称量10000001G全麦粉倒入10ML离心管中；随后加入500G所需溶液；待溶涨20MIN后开始离心，期间每隔5MIN振荡一次约5S；离心后倒干上清液，并将离心管倒立于吸水纸上静置10MIN后称重。0091SRC值计算公式如下0092SRC离心管盖子凝胶的质量离心管盖子的质量/面粉质量86/100面粉水分11000093五、标记与性状的关联定位分析00。
27、94对20092011的供试品种的四种SRC等品质性状分别进行关联定位分析。采用了TASSEL21软件的GLMGENERALLINEARMODEL模型，以个体Q值为协变量将SRC值分别对标记变异进行回归分析，分析模型为0095YJIPJ1X1J2X2JKXKJJ0096上述公式中的YJ表示第J个品系某性状的表型值，IPJ表示第J品种第P个等位变异的指示变量，为供试群体该位点各等位变异的平均效应，为第J个品种第P个等位基因的效应，X1JXKJ表示第J个材料基因组变异源于第1K群体的概率Q值，1K表示亚群中各位点各等位变异的平均效应，J为残差。0097六、结果00983年度关联定位分析共检测到18。
28、个SSR引物与溶剂保持力SRC极显著相关联说明书CN104046627A1211/12页13P001。其中位于2B上的WMC5923年度均被检测到，分别与乳酸SRC、水SRC、碳酸钠SRC均极显著相关联，解释表型变异的53698；位于3D上的BARC423年度均被检出，分别与水SRC和乳酸SRC极显著相关联，解释表型变异的668100；位于2A的WMC658两年度被检测到，与乳酸SRC和水SRC极显著相关联，解释表型变异的10811400；位于3D的CFD152两年度被检测到，均与乳酸SRC极显著相关，解释表型变异的64793。表4。00993年度定位结果表明不同溶剂保持力与荧光SSR引物极显。
29、著相关联的标记有25个表5，其中GWM6421D三年度均与水溶剂保持力极显著相关联，表型解释率分别为1057、1568和1311。0100表4、20092010年度与SRC显著相关联P001的标记位点及其对表型变异的解释率01010102表5、106个荧光标记3年度关联定位结果汇总0103说明书CN104046627A1312/12页1401040105GWM6421D的不同等位变异表型效应值根据FBRESEGHELLO提出的无效等位变异方法进行估算；SSR标记不同等位位点的表型效应值估算AIXIJ/NINK/NK，其中AI表示第I个等位位点的表型效应值，XIJ为携有第I个等位位点的第J个品种。
30、表型性状观察值，NI为携有第I等位位点的品种数目；NK为携有无效等位位点的第K个品种的表型观察值，NK为携有无效等位位点的品种数目；当AI值大于0时可认为该位点为增效等位变异，否则该位点为减效等位变异。计算结果表明，分子量大小为202BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的提高具有增效作用，分子量大小为188BP的条带对小麦面粉水溶剂保持力的降低具有增效作用。见图1、图20106本申请的创新在于定位的GWM6421D三年度均与水溶剂保持力极显著相关联，表型解释率分别为1057、1568和1311。此前未见文献发表，为利用分子标记进行水溶剂保持力的品质辅助筛选提供了技术支撑。0107以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104046627A141/1页150001序列表CN104046627A151/1页16图1图2说明书附图CN104046627A16。