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1、10申请公布号CN104046649A43申请公布日20140917CN104046649A21申请号201410235606322申请日20140522C12N15/81200601C12N1/19200601C12R1/8420060171申请人东北农业大学地址150030黑龙江省哈尔滨市香坊区木材街59号东北农业大学动物营养研究所72发明人单安山高赫54发明名称表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法57摘要本发明提供一种表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法。根据毕赤酵母密码子的偏好性，优化黑曲霉木聚糖酶基因XYNB，连接到毕赤酵母表达载体PPICZA上，并在毕赤。
2、酵母GS115中实现了表达。重组酶GS115/PPICZAXYNBOPT的酶活提高18倍；用体外串联的方式构建木聚糖酶XYNBOPT基因的双拷贝GS115/PPICZAXYNBOPT2，并在毕赤酵母GS115中实现了表达。双拷贝木聚糖酶的活性比单拷贝木聚糖酶的活性提高19倍。诱导10天后，双拷贝酶活达到15158234511U/ML。纯化后木聚糖酶酶活为6853002008U/MG。51INTCL权利要求书1页说明书4页序列表5页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页序列表5页附图4页10申请公布号CN104046649ACN104046649A1/1。
3、页21一种表达高效木聚糖酶重组质粒，其特征在于，序列如序列表SEQIDNO1所示。2一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，构建过程包括如下步骤步骤1根据毕赤酵母密码子的偏好性，对木聚糖酶密码子进行优化；步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的构建；步骤3PPICZAXYNBOPT2双拷贝表达载体的构建；步骤4重组质粒的电转化和表达。3根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的序列如序列表SEQIDNO2所示。4根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法。
4、，其特征在于，所述步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的构建的具体步骤如下在优化合成的目的基因两端设计酶切位点，分别为ECORI和XBAI，将该基因连接在PPICZA载体上；将构建成功的重组表达载体PPICZAXYNBOPT转化到大肠杆菌感受态ECOILTOP10中，在LB低盐培养平板上筛选阳性克隆。5根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤3PPICZAXYNBOPT2双拷贝重组质粒的构建的具体步骤如下将PPICZAXYNBOPT重组质粒分别用BGLII单酶切，BAMHI和BGLII双酶切；然后进行酶切产物的回收后连接；并将连接产物转。
5、化入ECOILTOP10感受态细胞，待长出可见菌落后，筛选出双拷贝重组质粒。6根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，所述步骤4重组质粒的电转化和表达的具体步骤如下将PPICZAXYNB用SACII内切酶单酶切使其线性化；同时，将单、双拷贝的重组质粒用限制性内切酶BGLII单酶切分别使其线性化；经乙醇浓缩后，电转化入毕赤酵母GS115中，电转化条件为2,000V，45MS；将重组菌涂布于含有100G/MLZEOCIN的YPDS平板上，28培养23天直至长出清晰菌落，筛选出高活性阳性克隆。7根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法。
6、，其特征在于，在诱导120小时后表达出的木聚糖酶活性最高，达到15158234511U/ML。8根据权利要求2所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，其特征在于，表达的木聚糖酶经纯化达到电泳纯，比酶活为6853002008U/MG。权利要求书CN104046649A1/4页3表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法技术领域0001本发明属于生物工程技术领域及半纤维素分解领域，具体涉及一种表达高效木聚糖酶重组质粒及重组毕赤酵母菌的构建方法。背景技术0002植物中含有2030的半纤维素，木聚糖XYLAN是半纤维素的主要组分，在植物细胞壁中的含量仅次于纤维素，约占细胞干重的3。
7、5。木聚糖在自然条件下很难被降解利用，通过酸水解或酶水解可将木聚糖转化成寡木糖和单糖，酸水解速度快，但伴随有毒性化合物产生，对随后的微生物发酵过程有影响，而酶水解条件温和，无毒性副产物产生。因此，发展高效的酶水解法处理纤维素废料有着广阔的应用前景。但当前有许多因素制约着其应用和发展，木聚糖酶酶活性不高，产酶效率不高，酶学性质达不到工业应用的要求，这些都成为木聚糖推广应用的制约因素。如何通过基因工程等技术获得产酶高，酶学性质优良，适合工业应用的木聚糖酶是当前亟待解决的问题。0003由于木聚糖酶有广泛的应用价值，国内外有很多研究者致力于木聚糖酶的开发研究。研究集中在天然优良菌株的筛选和驯化，木聚糖。
8、酶的分离纯化及性质分析，优化培养条件等多个领域。同时微生物产生的木聚糖酶系复杂，活性较低，分离纯化增加了工业的成本。通过基因重组表达，可以获得单一酶。木聚糖酶分子生物学方面的研究虽然起步较晚，但发展迅猛。木聚糖酶基因是BERNIER等在1983年从BACILLUSSUBRILIS中最先分离得到的。自从80年代开始研究木聚糖酶的基因以来，至今已经克隆出一百余种不同微生物来源的菌株的木聚糖酶基因，并且在大肠杆菌及酵母等各种宿主菌中达到了活性表达。目前已发现的木聚糖酶基因有XYNA，XYNB，XYNC，XYNV，XYNZ等。0004木聚糖酶的研究方向一方面是对木聚糖酶进行基因改造，改善其酶学性质，使。
9、之更适合工业应用要求。另一方面是研究如何提高木聚糖的表达水平，以期在工业生产中推广应用。发明内容0005本发明的目的在于提供一种采用双拷贝表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌及构建方法，本发明通过基因改造和表达产生高效木聚糖酶。0006本发明的目的是通过如下方法实现的一种表达高效木聚糖酶重组质粒，序列如序列表SEQIDNO1所示。0007本发明还具有如下技术特征00081、一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，构建过程包括如下步骤0009步骤1根据毕赤酵母密码子的偏好性，对木聚糖酶密码子进行优化；0010步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的构建；0011步骤3PPICZAXY。
10、NBOPT2双拷贝表达载体的构建；说明书CN104046649A2/4页40012步骤4重组质粒的电转化和表达。00132、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的序列如序列表SEQIDNO2所示。00143、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤2PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的构建的具体步骤如下在优化合成的目的基因两端设计酶切位点，分别为ECORI和XBAI，将该基因连接在PPICZA载体上；将构建成功的重组表达载体PPICZAXYNBOPT转化到大肠杆菌感受态ECOILTOP10中。
11、，在LB低盐培养平板上筛选阳性克隆。00154、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤3PPICZAXYNBOPT2双拷贝重组质粒的构建的具体步骤如下将PPICZAXYNBOPT重组质粒分别用BGLII单酶切，BAMHI和BGLII双酶切；然后进行酶切产物的回收后连接；并将连接产物转化入ECOILTOP10感受态细胞，待长出可见菌落后，筛选出双拷贝重组质粒。00165、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，所述步骤4重组质粒的电转化和表达的具体步骤如下将PPICZAXYNB用SACII内切酶单酶切使其线性化；同时，将单、双拷贝的重组质粒用限制性内。
12、切酶BGLII单酶切分别使其线性化；经乙醇浓缩后，电转化入毕赤酵母GS115中，电转化条件为2,000V，45MS；将重组菌涂布于含有100G/MLZEOCIN的YPDS平板上，28培养23天直至长出清晰菌落，筛选出高活性阳性克隆。00176、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，在诱导120小时后表达出的木聚糖酶活性最高，达到15158234511U/ML。00187、如上所述的一种表达高效木聚糖酶的重组毕赤酵母菌的构建方法，表达的木聚糖酶经纯化达到电泳纯，比酶活为6853002008U/MG。0019本发明采用的双拷贝重组质粒所获得的木聚糖酶XYNB显示出较高的活性，为。
13、在工业水平生产出高活性的木聚糖酶XYNB奠定了基础。附图说明0020图1为野生木聚糖酶XYNB和优化木聚糖酶XYNB基因的比对图。0021图2为双拷贝的构建过程和一个表达盒的长度图。0022图3为单拷贝质粒和双拷贝质粒的双酶切鉴定图。0023其中，M为DNAMARKER；1为单拷贝质粒BGLII/BAMHI双酶切；2为双拷贝质粒BGLII/BAMHI双酶切结果。0024图4为重组菌GS115/XYNBOPT2表达上清图，0025其中，M为蛋白标准；110分别为发酵24小时，48小时，72小时，96小时，120小时，144小时，168小时，192小时，216小时和240小时的上清液。0026图5。
14、双拷贝重组菌所表达的木聚糖酶XYNB的纯化结果图，0027其中，M为蛋白标准；1为纯化的木聚糖酶XYNB；2为诱导的120小时发酵液上清。具体实施方式说明书CN104046649A3/4页50028实施例10029木聚糖酶基因密码子的优化0030根据毕赤酵母密码子的偏好性，用DNAWORKS软件完成对木聚糖酶基因密码子的优化。优化结果如图1所示。0031实施例20032PPICZAXYNBOPT单拷贝表达载体的构建0033优化的木聚糖酶基因序列XYNBOPTIMIZEDXYNBOPT由北京擎科新业生物技术有限公司合成。在该基因的两端设计酶切位点，分别为ECORI和XBAI，将该基因连接在PPI。
15、CZA载体上。将构建成功的重组表达载体PPICZAXYNBOPT转化到大肠杆菌感受态ECOILTOP10中，在LB低盐培养平板上筛选阳性克隆。0034实施例30035PPICZAXYNBOPT2双拷贝表达载体的构建0036XYNBOPT的双拷贝是用体外串联的方法构建的。将本实验室保存的PPICZAXYNBOPT重组质粒分别用BGLII单酶切，BAMHI和BGLII双酶切，37水浴过夜。双酶切产物经08琼脂糖凝胶电泳切胶回收XYNB基因片段后，与纯化后的单酶切产物用T4DNA连接酶16连接过夜。构建过程如图2所示。0037将连接产物转化入ECOILTOP10感受态细胞，37孵育1H，将菌液涂布于。
16、含25L/100MLZEOCIN的LB固体培养基中，37培养过夜。待长出可见菌落后，采用CRACKING快速鉴定重组质粒的方法，初步筛选出双拷贝重组质粒。挑取双拷贝重组质粒菌落，接于2MLLBZEOCIN液体培养基中，37250转/分钟，培养过夜。0038用质粒小提试剂盒提取单、双拷贝重组质粒。将提取的单、双拷贝重组质粒用BGLII、BAMHI进行双酶切，1琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。结果如图3所示。0039实施例40040重组质粒的电转化、筛选及表达00411、重组质粒的电转化0042将重组质粒PPICZAXYNB用SACII内切酶单酶切使其线性化。同时，将重组质粒PPICZAXYNBOPT。
17、及PPICZAXYNBOPT2用限制性内切酶BGLII单酶切使其线性化。上述酶切产物经乙醇浓缩后，电转化入毕赤酵母GS115中，电转化条件为2,000V，45MS。将所得转化子分别涂布于含有100G/MLZEOCIN的YPDS平板上，28培养23天直至长出清晰菌落，筛选阳性克隆。将筛选出的阳性克隆在BMGY培养基中29，250转/分钟，培养24小时。然后转入BMMY培养基中来诱导木聚糖酶基因XYNBOPT2表达，共72小时。每隔24小时添加一次甲醇，使其终浓度为05。同时每隔24小时取05ML的样品用于酶活性的分析和SDSPAGE电泳分析。筛选出活性最高的菌株。三种重组子所得活性最高的阳性转化。
18、子分别命名为GS115/PPICZAXYNB，GS115/PPICZAXYNBOPT，GS115/PPICZAXYNBOPT2。00432、重组质粒的筛选0044重组质粒电转化后，是按酶活性高低筛选的。选择木聚糖酶的酶活性最高的重组子。木聚糖酶的酶活性测定方法如下00451木聚糖标准曲线制备说明书CN104046649A4/4页60046称取木糖标品0500G，用蒸馏水溶解，定容到50ML，配制成10MG/ML的木糖溶液，再用10MG/ML的木糖溶液稀释成010MG/ML、020MG/ML、030MG/ML、040MG/ML、050MG/ML、060MG/ML、070MG/ML的木糖标准液。以。
19、缓冲液作为空白对照，分别取2ML的不同浓度的标准液于试管中，加入5MLDNS试剂，沸水浴5分钟。流水冷却，加蒸馏水定容至25ML，反转混匀。用紫外分光光度计在540NM处测出17号管的光密度值，用空白管调零。以光密度值为纵坐标，木糖浓度为横坐标，绘制木糖标准曲线。00472DNS酶活性测定方法0048酶活测定具体方法在25ML刻度试管中加入2ML浓度为1的木聚糖溶液，置于恒温水浴锅中50预热5分钟。加入用PH为50的磷酸二氢钠柠檬酸缓冲液稀释的上清液2ML，空白对照在加入含酶上清液的同时加入反应终止液DNS，50反应20MIN，向除空白管外其它试管中加入5MLDNS溶液，终止反应。将试管转移至。
20、沸水中，沸水浴5分钟。待试管中液体冷却，用双蒸水定容至25ML，用紫外可见分光光度计在540NM波长处测试样品OD值，计算酶活。0049实施例50050重组菌株的摇瓶表达0051将上述鉴定正确的三株重组菌株分别接种于56MLYPD培养基中，28250转/分钟培养约24小时。上述三种菌液分别取100L接种于BMGY培养基中。培养24小时至OD600值达到26时，离心收集菌体。用BMMY悬浮菌体，置于250ML摇瓶中培养。每24小时向摇瓶中添加甲醇诱导其表达。同时每24小时取1ML发酵液，并用纯水补加每天蒸发的水，使其总体积不变。离心收集所取发酵液的上清测定酶活，并分别比较24、48、72小时，此。
21、刻的酶活，结果如表1所示。重组单拷贝木聚糖酶的酶活比GS115/PPICZAXYNBWILD提高了18倍，双拷贝木聚糖酶比单拷贝木聚糖酶的活性提高了19倍。进一步进行摇瓶发酵，诱导120小时后双拷贝木聚糖酶的活性最高，达到15158234511U/ML。图4为诱导110天的发酵上清。将GS115/PPICZAXYNBOPT2所表达的木聚糖酶进行纯化，纯化的木聚糖酶达到电泳纯，如图5所示。纯化后的木聚糖酶比酶活为6853002008U/MG。0052表1三种酶的活性对比0053说明书CN104046649A1/5页700010002序列表CN104046649A2/5页80003序列表CN104046649A3/5页90004序列表CN104046649A4/5页100005序列表CN104046649A105/5页11序列表CN104046649A111/4页12图1说明书附图CN104046649A122/4页13图2说明书附图CN104046649A133/4页14图3图4说明书附图CN104046649A144/4页15图5说明书附图CN104046649A15。