扩增多核苷酸的仪器和方法 【技术领域】
本发明涉及扩增多核苷酸的仪器，更具体的是，涉及在单基片(substrate)中具有多室的扩增多核苷酸的仪器和扩增多核苷酸的方法。
背景技术
扩增多核苷酸的常规装置包括至少一个0.2ml或0.5ml反应管，通过使该管进行相同温度循环而实施PCR。在这种情况下，不能扩增扩增的具有不同的温度循环的靶多核苷酸。而且，由于样品体积至少为0.2ml，因而在制备样品时也存在困难。
大多数扩增多核苷酸的常规仪器包括如USP5955029和6126804中所公开的一个聚合反应管。因此，在通过利用这些装置扩增多个多核苷酸时存在困难。而且，在常规的装置中，聚合反应室与该装置的其它部分不是热绝缘的。因此，在包含扩增多核苷酸的装置的芯片-上-实验室(lab-on-a-chip)中，各室的温度影响其它部分的温度。结果，聚合反应室的温度对样品预处理的工具和检测工具有影响。因此，在扩增多核苷酸地具有多个反应室和芯片-上-实验室的装置中，各室应该是绝缘的。否则，由于温度干扰，很难控制各室的温度。
Daniel等将绝缘的概念引入扩增多核苷酸的装置(J.H.Daniel et al.，Sensor and Actuator，A471，pp.81-88，1998)。Daniel的装置具有网孔结构，其中反应室周围被蚀刻并且具有网样形状。该装置在绝缘和冷却方面具有优点，而在装配(fabricate)该装置的多流通道和电极上存在困难。因此，将该结构用于芯片-上-实验室很困难。
发明公开
本发明的目的是提供一种具有热绝缘的工具的扩增多核苷酸的仪器。
本发明的另一目的是提供一种具有热绝缘的工具的扩增多核苷酸的多室仪器。
本发明的另一目的是提供一种利用本发明扩增多核苷酸的仪器扩增多核苷酸的方法。
本发明提供扩增多核苷酸的仪器，包括：基片；基片中排列的微流通道系统和包含样品进口，自样品进口延伸的样品流通道，和与样品流通道流体连通(liquid communication)的多核苷酸聚合反应室；在反应室周围形成的第一绝缘槽；和用于调控反应室温度的工具。
本发明提供一种扩增多核苷酸的仪器，包括基片和在基片上配置的扩增多核苷酸的多个单元装置。每个单元装置包括：基片上的配置微流通道系统和包含样品进口，自样品进口延伸的样品流通道，和与样品流通道流体连通的多核苷酸聚合反应室；在反应室周围形成的第一绝缘槽；和用于调控反应室温度的工具。
本发明还提供一种通过PCR扩增样品中包含的多核苷酸的方法，包括：制备反应室和绝缘槽包含在基片中的生物芯片；传递用于聚合反应的样品多核苷酸和试剂；和控制用于PCR的反应室温度。
而且，本发明提供一种通过实施PCR扩增样品中包含的多核苷酸的方法，包括(a)制备包含基片和多个单元扩增装置的生物芯片，每个单元扩增装置包括一；基片中配置的微流通道系统并包含样品进口，自样品进口延伸的样品流通道，和与样品流通道流体连通的多核苷酸聚合反应室；在反应室周围形成的第一绝缘槽；和用于调控反应室温度的工具，(b)将用于聚合反应的样品多核苷酸和试剂传递到各反应室；和(c)独立控制用于PCR反应室的温度。
附图简述
图1是阐明根据本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器的顶部示意图(schematic top view)。
图2是阐明根据本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器的横截面示意图。
图3是阐明根据本发明另一实施方案扩增多核苷酸的多室仪器的顶部示意图。
图4是根据反应槽宽度的反应室温度升高的模式图。
图5是示波器，阐明本发明另一实施方案扩增多核苷酸的多室仪器的温度传感器电势(potential)的变化。
图6是示波器，阐明与根据图5中温度传感器电势变化对应，由控制器读取的信号。
图7是阐明本发明另一实施方案在仪器热调控过程中产生的最大的过冲量(overshoot)的图表。
图8是阐明本发明另一实施方案在仪器热调控期间中产生的稳定状态的误差的图表。
图9显示本发明另一实施方案使用多室仪器扩增PCR产物的凝胶电泳结果的照片。
实施本发明的最佳模式
参考附图进一步详述本发明的仪器。
图1和图2是阐明本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器的顶部和横截面示意图。
根据图1，所述仪器包括基片4；微流通道系统；第一槽14；和调控室的温度的温度控制器(未显示)。微流通道系统和第一槽14被装配在基片4中。微流通道系统由样品进口10，样品流通道6和聚合反应室8组成。第一槽14在聚合反应室周围微型装配。温度控制器被配置在基片4的较低表面上。
根据图2，基片由较上的基片2和较低的基片4组成。进口10，第一槽14和出口12被装配在较上的基片2中。样品流通道6，第一槽14和聚合反应室8被装配在较低的基片4中。该仪器通过将较上的基片2与较低的基片4结合制成。
将包含靶多核苷酸的样品注射到进口10并通过样品流通道6传递到聚合反应室8。PCR在聚合反应室8内实施。通过温度控制器控制PCR温度循环。反应获得的PCR产物通过样品流通道6被释放到出口12。
基片材料的实施例包括硅，玻璃，聚碳酸酯，聚二甲基硅氧烷和聚甲基丙烯酸甲酯。微流通道系统所具有的宽度，深度和高度分别约为0.1μm到500μm。优选的是聚合反应室的宽度，深度和高度约2.0μm到500μm，更优选分别为3.0μm到500μm。但是室的大小并不限于这些具体的范围，可以使用具有宽度，深度，和高度分别约为1到500mm的相当大的室。反应室可以具有各种形状，包括管状，矩形平行六面体，圆筒形。
第一槽可以具有约0.3mm到3mm的宽度。并且在硅基片具有的深度为300μm时，第一槽具有的深度可以约为200μm到290μm，或在硅基片具有的深度为500μm时，第一槽具有的深度可以约为200到490mm。但是第一槽的大小并不限于这些具体的范围。
调控所述室的温度的温度控制器可包括用于热调控杂交和脱杂交(dehybridization)所需的PCR温度循环的热源和温度传感器。该室的温度可以通过在该室周围补充一种或多个电热源而得以控制，或通过将脉冲激光或其它电磁能用到该室。此外，扩增多核苷酸的仪器可以包括冷却装置，该冷却装置可以是常规用于冷却目的而使用的任何结构。热源的电极可以被配置在该室下或该室周围。优选的是，电极被配置在具有该室的基片的较低表面上。
仪器可以进一步包括检测扩增多核苷酸的检测器或释放扩增多核苷酸的出口12。检测器可用常规工具检测多核苷酸，例如，测定液体流阻力的工具，和荧光或光谱测定检测装置。出口可以制成本发明微流通道系统的一部分，并且可以和该室流体连通。
扩增多核苷酸的仪器还可包括细胞裂解工具。将细胞裂解用作样品的该细胞裂解工具可以与反应室流体连通。
图3是本发明另一实施方案扩增多核苷酸的多室仪器的顶部示意图。
如图3所示，扩增多核苷酸的多室仪器包括扩增多核苷酸的四单元装置。四单元装置被微型装配在单基片上。扩增多核苷酸的各单元装置包括基片4；微流通道系统，第一槽14，和温度控制器(未显示)。该微流通道系统由样品出口10，样品流通道6和聚合反应室8组成。第一槽14被装配在聚合反应室8周围。温度控制器可被配置在基片4较低表面上。或者，该温度控制器可以被配置在基片4中聚合反应室之下。由于多室仪器被装配在单基片中，包含在样品中的多个多核苷酸可以同时在分别的被独立控制的室的温度中同时扩增。
本发明的一实施方案的仪器还可包括限定扩增多核苷酸的各单元装置边缘的第二槽16。各单元装置的反应室可被独立热调控并由此各单元装置可以独立通过在该室周围装配的第一绝缘槽14和单元装置间装配的第二绝缘槽16实施PCR。
扩增多核苷酸的多室仪器可以包括控制反应室温度的工具使得各反应室中的PCR根据相同的时间表或不同的时间表而实施。热控制反应室的工具可以包括控制器，电源(power supplier)，温度传感器和热源。控制器生成控制信号，它是基于关于预选的控制温度和控制时间的控制信息，温度传感器提供的关于真实温度的信息，并且将该控制信号提供给电源。电源根据控制信号为热源提供电能。热源接收到电源的电能后产生热，温度传感器测定反应室的真实温度并将真实温度的信息提供给控制器。可以通过使用PID方法或开/关计算方法自控制器提供控制信号给电源。如果使用的是开/关计算方法，可以应用MOSFET。
扩增多核苷酸的仪器可以通过许多方法制造，尤其是，在半导体制备工业中通常使用的光刻法。
用于制造本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器的光刻法被详细描述。第一基片诸如硅的表面用氧化膜包被，然后样品流通道，聚合反应室，和绝缘槽用光掩模来形成图案。通过使用氧化膜图案和湿蚀刻或干蚀刻包括反应性离子蚀刻将表面蚀刻成所需的深度。如果必要，这些形成图案的方法和蚀刻方法可被重复数次。将第一基片较低表面进行形成图案和蚀刻，并用金属膜如铂，金，镍，和铜包被以形成电极。第二基片诸如硅的表面用氧化膜包被，接着样品进口，绝缘槽和出口通过光掩模来形成图案，然后蚀刻到所需深度。连接第一和第二基片以完成扩增本发明一实施方案的多核苷酸的仪器。该连接可以通过使用包括阴极密封，氟化物密封，热密封或聚合物密封的方法。
将一种或多种热源和传感器置于本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器上。所述传感器在恒定水平维持该室的温度，测定由温度诱导的电势并测定温度和电势之间的关系。控制器通过之间的关系将传感器测定的特定电势转化成特定的温度并显示具体的温度。
本发明通过下面的实施例进一步描述，但并不限于这些实施例。
实施例1根据在扩增多核苷酸的仪器中存在或缺无绝缘槽的室的温度升高模式和温度分布
(1)温度分布测定
如图1所示，当加热反应室达到410K时，对于扩增多核苷酸的仪器的温度分布进行测定，该仪器在该室周围具有绝缘槽。用没有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器作为对照。没有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器与图1中所示的仪器，除了前者无绝缘槽之外是相同的。槽宽度为1mm，深度为250μm。
在有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器中将温度升高到410K，电能消耗约为2.8W，而在对照仪器中为4W。因此，电能消耗降低30％，所以通过配置绝缘槽可完成绝缘效果。
(2)温度升高模式的测定
如图1所示，当提供恒定的电能4W到反应室时，测定在室周围具有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器的温度分布。使用三个有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器，它们具有相同的槽深250μm，和分别为100μm，1000μm，和4000μm的不同槽宽。用没有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器作为对照。没有绝缘槽的扩增多核苷酸的仪器与图1中所示的仪器，除了前者无绝缘槽外是相同的。
结果见图4。如图4中所示，有绝缘槽的仪器比对照仪器温度升高地得更迅速并且前者最终的平衡浓度比后者更高。此外，温度上升的速度与槽的宽度成正比。但是，当宽度大于约1mm时，温度上升的速度和平衡温度没有进一步的变化。
实施例2在具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器中的温度调控
在该实施例中，所用为图3所示的具有四室和铂薄膜温度传感器的扩增多核苷酸的仪器，并且反应室的温度可被控制。
将3.6μl PCR反应液添加到样品进口10和样品流通道6，然后到聚合反应室8(图3)。温度循环55℃30秒，72℃30秒，90℃30秒，95℃30秒的温度控制信息被输入控制器，并且该电能控制器被驱动。
图5是示波器，阐明本发明另一实施方案扩增多核苷酸的多室仪器的温度传感器电势的变化。在图5中x轴表示时间y轴表示电势。对应于各自电势的真实温度和维持时间也被表示。图6是示波器，阐明与根据图5中温度传感器电势变化相对应，由控制器读取的信号。图5和图6中底端部分表示开/关操作。
如图5和6所示，对应于控制器的计算机可以始终如一地识别铂膜温度传感器的输出电势。这些结果表明具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器的温度可被始终如一地调控。
图7和8阐明当本发明一实施方案仪器的反应室自室温被加热到55℃并维持在该温度时，热源的过冲量和稳定状态的误差。如图7和8所示，过冲量低于约0.6℃，稳定状态误差约为±0.4℃。温度升高的速度为6.7℃/秒。与常规的使用0.2ml反应管的大批PCR仪器相比，本发明一实施方案扩增多核苷酸的仪器具有改进的加热和冷却特征及相似的稳定状态误差值。
实施例3具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器的PCR
通过使用如图3所示的扩增多核苷酸具有四室的仪器和铂膜温度传感器实施PCR。
通过PCR Core系统II(Promega Co.，Madison，U.S.A)实施使用所述仪器的PCR。制备包含上游和下游对照引物，dNTP，盐，DNA聚合酶和质粒DNA样品的预混合物。将该预混合样品加到样品进口并通过样品流通道传递到体积2.6μl的聚合反应室。样品流进口和出口通过使用环氧材料封闭。PCR温度循环包括55℃30秒，72℃30秒，95℃30秒，重复30个循环以实施PCR。
图9显示本发明另一实施方案使用多室仪器扩增PCR产物的凝胶电泳结果的照片。在图9中，泳道1表示阴性对照，泳道2表示用本发明一实施方案具有多个反应室的仪器获得的扩增产物，泳道3表示用没有绝缘槽的对照仪器获得的扩增产物，M为大小标记物。如图9中所示，用本发明一实施方案具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器获得的扩增产物，它的结果类似于用扩增多核苷酸没有绝缘槽的对照仪器获得的扩增产物。
工业实用性
本发明扩增多核苷酸的仪器，通过在基片上形成绝缘槽可提高反应室的温度控制能力并且降低电能消耗。
本发明的仪器，通过在基片上形成绝缘槽可制备在单基片中具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器。
本发明一实施方案具有多个反应室的扩增多核苷酸的仪器，反应室的温度可被独立调控。
扩增多核苷酸的方法，可以高速低成本扩增大量的基因。