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1、10申请公布号CN104034705A43申请公布日20140910CN104034705A21申请号201310071890022申请日20130306G01N21/64200601C09K11/0620060171申请人常州欣宏科生物化学有限公司地址213022江苏省常州市新北区华山路18号3号楼40172发明人王树王勇74专利代理机构常州佰业腾飞专利代理事务所普通合伙32231代理人金辉54发明名称一种荧光探针检测酶活性方法57摘要本发明涉及一种荧光探针检测酶活性方法，本发明应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物作为荧光探针，使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对。
2、酶的底物进行单标记，在应用于检测酶活性时，可以具有高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏、普适等优点。51INTCL权利要求书2页说明书6页附图4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书2页说明书6页附图4页10申请公布号CN104034705ACN104034705A1/2页21一种荧光探针检测酶活性方法，其特征在于所述的荧光探针为式I，II或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有212个碳原子的烷基或芳基；AR为芴基、苯基、或噻吩基；其中，R2为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有212个碳原子的烷基或芳。
3、基；B为苯二乙烯基（CHCHPHCHCH）或苯二乙炔基（CCPHCC）。2根据权利要求1所述的一种荧光探针检测酶活性方法，其特征在于所述的R1选自下列基团中的一种2磺基乙基、4磺基丁基、6磺基己基、42磺基乙氧基苯基、43磺基丙氧基苯基、44磺基丁氧基苯基、45磺基戊氧基苯基、46磺基己氧基苯基、2羧基乙基、4羧基丁基、6羧基己基、44羧基丁氧基苯基、6磷酸基己基。3根据权利要求1所述的一种荧光探针检测酶活性方法，其特征在于所述的R2选自下列基团中的一种甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2甲氧基乙基、22甲氧基乙氧基乙基、222甲氧基乙氧基乙氧基乙基、2222甲氧基乙氧基乙氧基乙氧基乙基。4。
4、根据权利要求1或2所述的一种荧光探针检测酶活性方法，其特征在于为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为AR为芴基或苯基时，或B为苯二乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂；AR为噻吩基或B为苯二乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。5根据权利要求1所述的一种荧光探针检测酶活性方法，所述的酶活性定量检测方法包括如下的步骤第一步，对酶底物进行化学修饰通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；第二步，绘制标准检测曲线将修饰过的酶底物与上述的。
5、荧光探针反应，完全淬灭荧光权利要求书CN104034705A2/2页3探针的荧光分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光探针的缓冲液中，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99以上，记录此过程中酶底物浓度Q和荧光强度F，以（F0/F1）为纵坐标，Q为横坐标，绘制STERNVOLMER淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系；该淬灭曲线是直线的情况下，STERNVOLMER方程为F0/F1KAPPQ其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，F是加入酶底物之后的荧光强度，Q是混合液中酶底物浓度，KAPP是表观系。
6、数，为一常数值；该淬灭曲线是抛物线的情况下，STERNVOLMER方程为（F0/F1）AQBQ2其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，F是加入酶底物之后的荧光强度，Q是混合液中酶底物浓度，A、B为常数；第三步，待测酶的活性分析将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初速度；再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓度的倒数为横坐。
7、标X，绘制LINEWEAVERBURK曲线，该曲线接近直线，且符合方程Y6106724190445X，通过斜线的横截距1/KM求出KM，可以计算出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。权利要求书CN104034705A1/6页4一种荧光探针检测酶活性方法技术领域0001本发明属于酶分析技术领域，具体地说是涉及一种荧光探针的应用，其可用于检测酶活性。背景技术0002酶是产生于生物体内活细胞的一种生物催化剂，能够高效的催化体内各种生物化学反应，促进生物体的新陈代谢。酶是细胞赖以生存的基础，细胞新陈代谢包括的化学反应几乎都是在酶的催化下进行。因此对于酶活性的检测在生物技术，生。
8、物化学以及临床诊断等领域有着重要意义。0003目前常见的检测酶活性的方法包括分光光度法、HPLC分析、电化学分析、化学发光分析、放射法等。分光光度法是利用酶促反应前后底物吸光度的变化求出底物浓度的变化值，从而计算出酶的活性，但该方法需要依靠紫外检测，灵敏度较低，而且酶和底物的消耗大，无法在低浓度下检测酶活性；HPLC分析虽然具有定量分析的优点，但需要较多的样品量，且灵敏度偏低；电化学分析需要偶联多步反应，甚至需要其它酶的参与，使反应体系变得复杂。化学发光分析灵敏度较高，但不易操作，重复性差，难以准确地定量检测酶活性；放射法具有较高的灵敏度，但需要放射性标记的化合物，操作上有一定的危险性。000。
9、4因此，设计出一种更为灵敏、有效的酶活性检测方法是极为迫切的，而荧光探针作为一种非放射性的标记技术，因其具有较好的安全性和较高的灵敏度，在检测酶的活性方面越来越受到人们关注，该技术通常是将酶的底物设计成双标记分子，即在底物两端共价连接两个不同的染料分子，两个染料分子之间发生能量转移或电子转移，酶作用于底物后两染料分子分开，切断了转移过程，使荧光光谱发生变化。但双标记的成本较高，而且大多底物分子难以双标记修饰，酶的活性也可能受到较大影响，所以此方法也不能广泛地应用。发明内容0005本发明的目的在于提供一种克服上述酶活性检测技术的种种不足，从而应用一系列的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物作为荧光探针，。
10、使用这种具有高荧光量子产率的聚合物或寡聚物作为荧光探针，并对酶的底物进行单标记，高效、灵敏、定量、直接、简便、快速、灵敏的荧光探针检测酶活性的方法。0006实现本发明目的的技术方案是一种荧光探针检测酶活性的方法，所述的荧光探针为式I，II或III所示的水溶性共轭聚合物或共轭寡聚物0007式I0008其中，R1代表链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有212个碳原子的烷基或芳基；说明书CN104034705A2/6页50009AR为芴基、苯基、或噻吩基；0010式II0011其中，R2为链末端含有磺酸根、羧酸根、或磷酸根的且含有212个碳原子的烷基或芳基；0012B为苯二乙烯基（CHCHPH。
11、CHCH）或苯二乙炔基（CCPHCC）。0013上述一种荧光探针检测酶活性方法的R1选自下列基团中的一种2磺基乙基、4磺基丁基、6磺基己基、42磺基乙氧基苯基、43磺基丙氧基苯基、44磺基丁氧基苯基、45磺基戊氧基苯基、46磺基己氧基苯基、2羧基乙基、4羧基丁基、6羧基己基、44羧基丁氧基苯基、6磷酸基己基。0014上述一种荧光探针检测酶活性方法的R2选自下列基团中的一种甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、2甲氧基乙基、22甲氧基乙氧基乙基、222甲氧基乙氧基乙氧基乙基、2222甲氧基乙氧基乙氧基乙氧基乙基。0015上述一种荧光探针检测酶活性方法为了淬灭式I或II所示的化合物，使用的淬灭剂为0。
12、016AR为芴基或苯基时，或B为苯二乙炔基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、硝基苯、多硝基苯、芘、吖啶、荧光素、罗丹明、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂；0017AR为噻吩基或B为苯二乙烯基时，使用选自对甲基红、苯醌、蒽醌、吖啶、联吡啶、卟啉中的一种作为淬灭剂。0018上述一种荧光探针检测酶活性方法的酶活性定量检测方法包括如下的步骤0019第一步，对酶底物进行化学修饰通过共价键合，在酶底物上连接一个与荧光探针所匹配的淬灭剂基团，得到修饰过的酶底物；0020第二步，绘制标准检测曲线将修饰过的酶底物与上述的荧光探针反应，完全淬灭荧光探针的荧光分批将第一步得到的修饰过的酶底物加入含有荧光探针的缓冲液中。
13、，修饰过的酶底物与荧光探针通过静电作用在缓冲液中形成静电复合物并淬灭荧光，直至荧光探针的荧光淬灭至99以上，记录此过程中酶底物浓度Q和荧光强度F，以（F0/F1）为纵坐标，Q为横坐标，绘制STERNVOLMER淬灭曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系；0021该淬灭曲线是直线的情况下，STERNVOLMER方程为0022F0/F1KAPPQ0023其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，0024F是加入酶底物之后的荧光强度，0025Q是混合液中酶底物浓度，0026KAPP是表观系数，为一常数值；0027该淬灭曲线是抛物线的情况下，STERNVOLMER方程为0028（。
14、F0/F1）AQBQ20029其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，说明书CN104034705A3/6页60030F是加入酶底物之后的荧光强度，0031Q是混合液中酶底物浓度，0032A、B为常数；0033第三步，待测酶的活性分析将不同浓度的修饰过的酶底物与荧光探针反应后，分别加入待测的酶，荧光信号随着酶的加入量逐渐恢复，进行一系列荧光发射光谱测定混合液的荧光强度值，然后根据第二步得到的标准检测曲线将荧光强度值转换为底物浓度值，并以此底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线，斜率即为反应初速度；0034再以反应初速度的倒数为纵坐标Y，酶底物初始浓。
15、度的倒数为横坐标X，绘制LINEWEAVERBURK曲线，该曲线接近直线，且符合方程0035Y6106724190445X，通过斜线的横截距1/KM求出KM，可以计算出酶促反应过程中某时刻在溶液中的酶底物的浓度，从而计算酶的活性。0036本发明具有积极的效果0037（1）本发明基于利用具有优越的荧光性能的荧光探针与共价连接酶底物的淬灭剂分子先形成复合物淬灭荧光，然后再用靶酶分子使荧光信号恢复，可以连续、均相、定量且实时地混合即测定（“MIXANDDETECT”）地观察底物被酶消化的过程。0038（2）与一般的荧光染料分子相比，本发明应用的水溶性共轭聚合物、共轭寡聚物和具有发色团的非共轭聚合物或。
16、寡聚物在水溶液中具有更高的荧光量子产率，是一种可以在低浓度下使用的荧光探针。0039（3）本发明使用了这种荧光检测体系检测酶的活性时，荧光探针的荧光淬灭达到99以上，即深度淬灭（SUPERQUENCHING），可以显著降低荧光背景，从而可以大幅度地提高检测方法的灵敏度。此外，本发明应用的这种荧光探针还可大幅提高荧光信号恢复倍数，甚至可恢复达100倍以上。0040（4）本发明在检测酶活性中应用了具有优越的荧光性能的荧光探针，使得这些方法具有操作简便、响应快、灵敏度高等特点。附图说明0041为了使本发明的内容更容易被清楚地理解，下面根据具体实施例并结合附图，对本发明作进一步详细的说明，其中0042。
17、图1为实施例1中向PCPSO3加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；0043图2为实施例1得到的STERNVOLMER淬灭曲线；其中，F0是加入酶底物之前的荧光强度，F是加入酶底物之后的荧光强度，Q是混合液中酶底物浓度，即修饰的酶底物浓度；0044图3为实施例1中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；0045图4为实施例1中的LINEWEAVERBURK曲线；0046图5为实施例2中向PCYCOOH加入经修饰的酶底物后的荧光光谱；0047图6为实施例2得到的STERNVOLMER淬灭曲线；0048图7为实施例2中不同底物初始浓度和反应时间的曲线；0049图8为实施例2中的LINEWEAVERBURK曲线。
18、；说明书CN104034705A4/6页7具体实施方式0050以下结合附图及本发明的技术方案提供实施例。0051（实施例1）0052荧光探针PCPSO3在酶活性分析及抑制剂筛选中的应用0053（1）化学修饰的酶底物制备在氮气保护下，向装有二甲基亚砜（05ML）的10ML二口瓶中加入6对甲基红氨基己酸（38MG，01MMOL）和羰基二咪唑（24MG，015MMOL），室温下磁力搅拌30分钟。用注射器将反应液转移到装有溴乙酰胆碱（10MG，008MMOL）、二氮双环十一碳7烯（21L,014MMOL）和二甲基亚砜（025ML）的5ML单口瓶中，于40搅拌反应24小时。减压浓缩后，经硅胶柱分离（洗脱。
19、剂二氯甲烷/甲醇/水65/25/4,V/V/V），得到目标产物6对甲基红氨基己酰胆碱溴（15MG，34），即在酶底物上连接了与荧光探针PCPSO3所匹配的淬灭剂基团。0054（2）PCPSO3的结构如式（III）所示，合成方法如下向100ML的单口瓶加入50ML甲苯、52克新戊二醇和05克对甲苯磺酸，回流24小时，蒸除溶剂后硅胶柱分离（洗脱剂二氯甲烷）后得到48克1,4苯二硼酸新戊二酯。1HNMR400MHZ,CDCL3PPM7784H,S，3778H,S，10212H,S。向25ML的二口瓶中加入54ML甲苯和36ML2M碳酸钾，鼓入氮气30分钟后，加入295毫克SODIUM442,7DIB。
20、ROMO9HCARBAZOL9YLPHENOXYBUTANE1SULFONATE，165毫克1,4苯二硼酸新戊二酯和20毫克四三苯基膦钯，于氮气下95搅拌反应24小时，冷却后加入20毫升水搅拌、过滤。将分液获得的水溶液用透析袋（分子量大于3500）在水中透析，除去水后得到230毫克聚合物PCPSO3，MN80103。1HNMR400MHZ,DMSOPPM80833H,M，75784H,M，71744H,M，68703H,M，4142（2H,M）,33342H,M，16184H,M。0055式III00563标准检测曲线的绘制向3ML比色池加入10ML磷酸缓冲溶液（25MM，PH8），加入作为荧。
21、光探针的聚合物PCPSO3（式III）至20M，在376NM激发波长下测定其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物至080M，每次滴加酶底物后测定荧光发射光谱（如图1所示）。记录荧光发射光谱424NM处的荧光强度值，以（F0/F1）为纵坐标，Q为横坐标，绘制STERNVOLMER曲线，以此作为标准检测曲线，建立了荧光强度与酶底物浓度的定量关系如图2所示。00574乙酰胆碱酯酶（ACHE）活性分析向3ML比色池中加入10ML磷酸缓冲溶液（25MM，PH8），加热至37，加入聚合物PCPSO3至20M，记录荧光发射光谱424NM处的荧光强度值，再加入上述修饰过的酶底物至02M，记录荧光发射光。
22、谱424NM处的说明书CN104034705A5/6页8荧光强度值，加入10单位ACHE，荧光信号逐渐恢复，80秒内测定一系列荧光发射光谱，并记录荧光发射光谱424NM处的荧光强度值。改变上述修饰过的酶底物初始浓度值分别为025，03，04，06M，重复上述实验。按标准检测曲线（图2）将荧光强度值转换为底物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线（图3），斜率为反应初速度。再以反应初速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，绘制LINEWEAVERBURK曲线（图4），曲线接近直线，方程为Y6106724190445X，横截距1/。
23、KM0252，求出KM40M。0058（实施例2）0059荧光探针PCYCOOH在酶活性分析中的应用00601先按照实施例1中的方法制备相同的化学修饰的酶底物。00612PCYCOOH的结构如式（IV）所示，合成方法如下向100毫升的单口瓶中加入3,6,9,12TETRAOXAPENTADECAN15OICACID取代的2,7二溴咔唑（08G），1，4对苯二炔（02G），10毫升水和10毫升DMF，混合均匀后中通入氮气把溶剂里的氧气除尽，加入含有520毫克PDPPH34和100毫克CUI的10毫升二异丙胺和DMF的混合溶液（各5毫升），升温至55反应14小时。反应液冷却至室温后加入20毫升水搅。
24、拌，溶液用透析袋（分子量大于3500）在水中透析，除去水后得到525毫克聚合物PCYCOOH,MN15104。1HNMR400MHZ,DMSOPPM79813H,M，7476（5H,M）,6972（2H,M）,44452H,M，353916H,M，23242H,M。0062式IV00633绘制标准检测曲线向3ML比色池加入10ML磷酸缓冲溶液（25MM，PH8），加入聚合物PCYCOOH（式VI）至20M，376NM激发波长下测定其荧光发射光谱。然后持续滴加上述修饰过的酶底物，每次滴加上述修饰过的酶底物后测定荧光发射光谱（图5）。记录荧光发射光谱424NM处的荧光强度值，以（F0/F1）为纵坐。
25、标，Q为横坐标，绘制STERNVOLMER曲线，以此作为标准检测曲线，如图6所示。00644ACHE活性分析向3ML比色池加入10ML磷酸缓冲溶液（25MM，PH8），平衡至37，加入聚合物PCYCOOH式IV，MN05至20M，记录EM424NM处的荧光强度值，加入修饰的上述修饰过的酶底物至02M，荧光发射光谱424NM处的荧光强度值，加入10单位ACHE，80S内测定一系列荧光光谱，记录荧光发射光谱424NM处的荧光强度值。改变底物初始浓度值分别为025，03，04，06M，重复上述实验。按标准检测曲线（图6）将荧光强度值转换为底物浓度值，以底物浓度变化值为纵坐标，反应时间为横坐标，在同一。
26、张图上绘制不同底物浓度下的浓度变化曲线（图7），斜率为反应初速度。再以反应初速度的倒数为纵坐标，酶底物初始浓度的倒数为横坐标，绘制LINEWEAVERBURK曲线（图8），曲线接近直线，方程为Y8546217451479X，横截距1/KM0115，说明书CN104034705A6/6页9求出KM87M。0065以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。说明书CN104034705A1/4页10图1图2说明书附图CN104034705A102/4页11图3图4说明书附图CN104034705A113/4页12图5图6说明书附图CN104034705A124/4页13图7图8说明书附图CN104034705A13。