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1、10申请公布号CN104046672A43申请公布日20140917CN104046672A21申请号201310080681222申请日20130313C12P19/62200601C12R1/64520060171申请人上海医药工业研究院地址200040上海市静安区北京西路1320号申请人中国医药工业研究总院72发明人李继安钟京谕林惠敏蓝鸿石煊雯李亚军74专利代理机构北京市金杜律师事务所11256代理人陈长会谢燕军54发明名称一种用于生产多杀菌素的发酵培养基57摘要本发明公开了一种用于刺糖多孢菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSA发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、。
2、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为碳源5090、氮源3060、低级醇0105、植物油0225、氨基酸0105。所述发酵培养基能够提高多杀菌素的发酵单位，提高生产效率，并降低生产成本。51INTCL权利要求书1页说明书4页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书4页10申请公布号CN104046672ACN104046672A1/1页21一种用于刺糖多孢菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSA发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为碳源5090、氮源30。
3、60、低级醇0105、植物油0225、氨基酸0105。2根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麦粉、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一种或多种。3根据权利要求2所述的发酵培养基，其中所述的碳源为3060的葡萄糖和2030的玉米粉的组合。4根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的氮源选自棉籽饼粉、酵母浸粉、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、豆粕和牛肉浸膏中的一种或多种。5根据权利要求4所述的发酵培养基，其中所述的氮源为2040的棉籽粉和1020的酵母浸粉的组合。6根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的低级醇选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇。7根据权利要求6所述。
4、的发酵培养基，其中所述的低级醇为正丁醇，含量为0203。8根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的植物油选自大豆油、玉米油、葵花油或花生油。9根据权利要求8所述的发酵培养基，其中所述的植物油为葵花油，含量为20。10根据权利要求1所述的发酵培养基，其中所述的氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸。11根据权利要求10所述的发酵培养基，其中所述的氨基酸为赖氨酸，含量为0203。权利要求书CN104046672A1/4页3一种用于生产多杀菌素的发酵培养基技术领域0001本发明属于生物农药生产技术领域，具体涉及一种用于生产多杀菌素的发酵培养基。背景技术0002多杀菌素SPIN。
5、OSAD是由放线菌刺糖多孢菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSA产生的大环内酯类抗生素，活性最高的两个组分是SPINOSYNA和SPINOSYND。多杀菌素的作用机制新颖、独特作用于昆虫神经系统及氨基丁酸受体，对昆虫具有快速触杀和胃毒活性摄食毒性。此外，多杀菌素活性选择性较高，对鳞翅目、双翅目和缨翅目等害虫表现出极高的毒性，而对哺乳动物、鸟类和大多数益虫毒性较低。在哺乳动物的慢性毒性试验中，多杀菌素无致癌、致畸及致突变作用，也没有神经毒性。与氯氰菊酯相比，多杀菌素对某些重要益虫的毒性低，而对鳞翅目害虫的活性与之相当，对水生生物具有中低毒性。0003多杀菌素最初是美国陶氏农业科学公司。
6、生产的，因其具有生物农药的安全性、化学合成农药的速效性且杀虫谱广、杀虫活性高、低残留，被美国环保局归类为降低风险杀虫剂产品。1999年，多杀菌素获得美国“总统绿色化学品挑战奖”，2005年美国环保局批准其作为储粮防护剂，2008年欧盟批准其在有机作物上使用。至2003年，多杀菌素已经在24个国家，超过250种作物上进行注册登记。在我国，1999年多杀菌素的注册商品名为催杀TRACER48悬浮液和菜喜SUCCESS25悬浮液。可以看出，目前多杀菌素已成为最具有发展前景的生物杀虫剂，对其进行研究开发具有良好的经济与社会效益。0004ZHJINBXUSZLINQCJINPLCEN；ENHANCEDP。
7、RODUCTIONOFSPINOSADINSACCHAROPOLYSPORASPINOSABYGENOMESHUFFLING；APPLBIOCHEMBIOTECHNOL2009159655663公开了一种多杀菌素产生菌发酵用培养基，所述发酵培养基的配方及含量为葡萄糖6、淀粉2、黄豆粉2、鱼粉1、玉米浆1、谷氨酸盐03、大豆油1、CACO303。该培养基的发酵单位最高为547MG/L。鉴于此发酵配方的发酵单位偏低，不利于产业化。发明内容0005针对现有的利用刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的发酵培养基发酵单位较低，产率低等缺陷，本发明提供了一种新的用于刺糖多孢菌发酵生产多杀菌素的发酵培养基，该发酵培养。
8、基能够提高多杀菌素的发酵单位，提高生产效率，并降低生产成本。0006因此，本发明旨在提供一种用于刺糖多孢菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSA发酵生产多杀菌素的发酵培养基，其包括碳源、氮源、低级醇、植物油、氨基酸和水，其中按培养基的总重量计，其组分及含量为碳源5090、氮源3060、低级醇0105、植物油0225、氨基酸0105。0007本发明中的百分比单位是重量体积百分比单位G/100ML，其是本领域技术人员所熟知的，例如是指在100毫升的溶液中溶质的重量。说明书CN104046672A2/4页40008根据本发明一个优选的实施方式，所述的碳源选自葡萄糖、可溶性淀粉、面粉、燕麦粉。
9、、玉米淀粉、玉米粉和糊精中的一种或多种；优选地，所述的碳源为3060的葡萄糖和2030的玉米粉的组合。0009天然淀粉由直链淀粉和支链淀粉组成，其直链淀粉与支链淀粉之比一般约为1528比7285。直链淀粉是D葡萄糖基以A1，4糖苷键连接的多糖链，分子中有200个左右葡萄糖基，支链淀粉分子中除有A1，4糖苷键的糖链外，还有A1，6糖苷键连接的分支，分子中含300400个葡萄糖基。淀粉与碘呈颜色反应，直链淀粉为蓝色，支链淀粉为紫色。不同来源可溶性淀粉之间并无明显差异。本发明所述的玉米淀粉是从玉米中直接提取所得的天然淀粉，含有直链淀粉及支链淀粉，其成分约为27直链淀粉、73支链淀粉，具有国家标准，市。
10、售可得。0010SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395的基因中含有可以表达为淀粉酶ALPHAAMYLASE的基因，即刺糖多孢菌能产生淀粉酶EC3211，水解1，4糖苷键既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的1，4链。0011本发明所述的可溶性淀粉是由淀粉经过氧化剂、酸、甘油、酶或其他方法处理而成的淀粉衍生物，其成分为100直链淀粉。是一种白色或淡黄色粉末，无味无臭，溶于沸水形成胶体溶液，不溶于冷水、醇和醚。其产品具有国家标准，市售可得。0012根据本发明另一个优选的实施方式，所述的氮源选自棉籽饼粉、酵母浸粉、鱼粉蛋白胨、黄豆饼粉、豆粕和牛肉浸。
11、膏中的一种或多种；优选地，所述的氮源为2040的棉籽粉和1020的酵母浸粉的组合。0013根据本发明一个优选的实施方式，所述的低级醇选自乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇或异丁醇；优选为正丁醇0105，最优选为0203。0014根据本发明另一个优选的实施方式，所述的植物油选自大豆油、玉米油、葵花油或花生油；优选为葵花油0225，最优选为20。0015根据本发明一个优选的实施方式，所述的氨基酸选自甘氨酸、谷氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸或天冬氨酸；优选为赖氨酸0105，最优选为0203。0016上述最优选配方的培养基的发酵单位最高可达1559MG/L，是原有发酵水平的28倍。0017根据本发明另一个优。
12、选的实施方式，所述刺糖多孢菌可以是现有的各种刺糖多孢菌菌株，如SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395、SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460。0018本发明中，上述优选条件在符合本领域常识的基础上可任意组合，即得本发明各较佳实例。0019本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。0020相比于现有技术，本发明发酵培养基的有益效果如下本发明提供了一种有利于刺糖多孢菌高效发酵生产多杀菌素的发酵培养基。通过优选发酵培养基的成分及配比，从而大大提高多杀菌素的产量。本发明提供的发酵生产方法大幅提高了多杀菌素的发酵单位，适用于多杀菌素的规模化。
13、生产。说明书CN104046672A3/4页5具体实施方式0021下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。0022所使用的刺糖多孢菌为SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395或SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460。0023发酵培养方法0024装量100ML/750ML，接种量10，置于28恒温室中旋转摇床240RPM摇瓶发酵9天。0025发酵液中多杀菌素含量测定0026取发酵液2ML置于10ML离心管，加入6ML甲醇溶液，充分振荡，混合超声1。
14、5MIN，避光室温浸提12小时，离心4000RPM，20MIN，取上清液经045M微孔滤膜过滤后用于高压液相色谱检测。0027色谱条件色谱柱C18，46MM250MM，5M；流动相甲醇乙腈005MOL/L乙酸铵454510；流速10ML/MIN；检测波长250NM；柱温40；进样量5L。0028实施例10029利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0030葡萄糖60G、可溶性淀粉30G、棉籽粉50G、乙醇02G、葵花油20G、甘氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为783MG/L。00。
15、31实施例20032利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0033葡萄糖60G、面粉30G、棉籽粉30G、豆粕20G、正丙醇02G、大豆油20G、谷氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为736MG/L。0034实施例30035利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0036葡萄糖60G、燕麦粉30G、棉籽粉30G、鱼粉蛋白胨20G、异丙醇02G、玉米油20G、脯氨酸03G，体积100ML。。
16、发酵后测得发酵单位为641MG/L。0037实施例40038利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0039葡萄糖60G、玉米淀粉30G、棉籽粉30G、黄豆饼粉20G、正丁醇02G、花生油20G、甲硫氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为974MG/L。0040实施例50041利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0042葡萄糖60G、玉米粉30G、棉籽粉30G、酵母浸粉20G、正丁醇02。
17、G、葵花油20G、赖氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为1327MG/L。说明书CN104046672A4/4页60043实施例60044利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0045葡萄糖60G、糊精30G、棉籽粉30G、牛肉浸膏20G、异丁醇02G、葵花油20G、天冬氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为842MG/L。0046实施例70047利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分。
18、比进行配置0048葡萄糖80G、玉米粉10G、棉籽粉10G、酵母浸粉40G、正丁醇02G、葵花油05G、赖氨酸05G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为856MG/L。0049实施例80050利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0051葡萄糖70G、玉米粉20G、棉籽粉20G、酵母浸粉30G、正丁醇03G、葵花油15G、赖氨酸02G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为921MG/L。0052实施例90053利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460。
19、发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0054葡萄糖60G、玉米粉30G、棉籽粉30G、酵母浸粉20G、正丁醇01G、葵花油10G、赖氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为937MG/L。0055实施例100056利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSAATCC49460发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0057葡萄糖70G、玉米粉20G、棉籽粉40G、酵母浸粉10G、正丁醇04G、葵花油20G、赖氨酸01G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为821MG/L。0058实施例110059利用多杀菌素产生菌SACCHAROP。
20、OLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0060葡萄糖60G、玉米粉30G、棉籽粉50G、正丁醇05G、葵花油25G、赖氨酸04G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为832MG/L。0061实施例120062利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，发酵培养基按照下表所列数据重量体积百分比进行配置0063葡萄糖90G、棉籽粉30G、酵母浸粉20G、正丁醇02G、葵花油20G、赖氨酸03G，体积100ML。发酵后测得发酵单位为711MG/L。0064对比实施例10065利用多杀菌素产生菌SACCHAROPOLYSPORASPINOSANRRL18395发酵，按背景技术中所提及的JIN等人文献所述，使用其发酵培养基葡萄糖6、淀粉2、黄豆粉2、鱼粉1、玉米浆1、谷氨酸盐03、大豆油1、CACO303。多杀菌素的产量为523MG/L。说明书CN104046672A。