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1、10申请公布号CN104293951A43申请公布日20150121CN104293951A21申请号201410531776622申请日20141010C12Q1/68200601C12N15/1120060171申请人山东省农业科学院奶牛研究中心地址250100山东省济南市历城区工业北路1591号72发明人鞠志花张帅王长法张燕王秀革黄金明李建斌仲跻峰74专利代理机构济南圣达知识产权代理有限公司37221代理人杨琪崔苗苗54发明名称TP1基因3UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检测方法57摘要本发明公开了一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3UTR区功能SNP位点及其检测引物、试。
2、剂盒和检测方法。该SNP位点为G528GA；核苷酸位置的编号基于GENBANK登录号为AC_0001591的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密码子ATG作为1；用于种公牛TP1基因3UTR区功能SNP位点基因分型的引物，上游引物序列如SEQIDNO4所示，下游引物序列如SEQIDNO5所示；本发明还公开了检测该SNP位点的引物、试剂盒和方法。本发明首次阐明了TP1基因SNP位点与公牛精液品质优劣的相关性，减少种公牛饲养的盲目性，节约成本，增加经济效益。51INTCL权利要求书1页说明书6页序列表2页附图2页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书6页序列表2页。
3、附图2页10申请公布号CN104293951ACN104293951A1/1页21一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3UTR区功能SNP位点，其特征在于，所述SNP位点为G528GA；核苷酸位置的编号基于GENBANK登录号为AC_0001591，在105576568与105577158之间的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密码子ATG作为1。2权利要求1所述的TP1基因3UTR区功能SNP位点在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。3一种用于检测种公牛TP1基因3UTR区功能SNP位点的引物，其特征在于，上游引物的序列如SEQIDNO1所示,下游引物的序列如SEQIDNO。
4、2所示。4权利要求3所述的引物在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。5一种用于检测种公牛TP1基因3UTR区功能SNP位点基因分型的引物，其特征在于，上游引物序列如SEQIDNO4所示,下游引物序列如SEQIDNO5所示。6权利要求5所述的引物在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。7采用权利要求5所述的引物进行种公牛精液品质优劣筛选的方法，其特征在于，以种公牛基因组DNA为模板，利用SEQIDNO4和SEQIDNO5所示的引物对待检测的种公牛的TP1基因3UTR区进行扩增，将PCR产物用FASTDIGEST限制酶TAQ进行切割，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，并根据银染。
5、后的电泳结果进行判定若得到283BP一条带，则为GG基因型；若得到307BP，283BP两条带，则为GA基因型；若得到307BP一条带，则为AA基因型；其中，GG基因型具有优良的精液品质性状，作为种公牛精液品质优劣筛选的分子标记。8一种用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，其特征在于，含有权利要求5所述的引物。9如权利要求8所述的用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，其特征在于，包括上游引物10MOL/L，其序列如SEQIDNO4所示；下游引物10MOL/L，其序列如SEQIDNO5所示；上述引物能够扩增出序列如SEQIDNO6所示的片段；2TAQPCRMASTERMIX；DDH2O；FASTDI。
6、GEST限制酶TAQ；10FASTDIGESTBUFFER。权利要求书CN104293951A1/6页3TP1基因3UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检测方法技术领域0001本发明涉及家畜分子生物学技术领域，具体涉及一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3UTR区功能SNP位点及其检测引物、试剂盒和检测方法。背景技术0002在人工授精及冷冻精液等技术被广泛推广的今天，种公牛已经成为现代奶牛改良体系中最重要的一环，其精液品质优劣是牛群能否可以快速稳定发展的指示标。公牛的采精量、鲜精活力、冻精解冻后活力、鲜精密度和精子畸形率是国际公认的衡量种公牛精液品质的重要指标。一项权威数据表明，我国。
7、的荷斯坦公牛年均冻精生产量仅仅为218万份，但在国外，最高的生产水平是一头公牛年产冻精25万份。这种巨大的差距，直接表明了我国奶牛行业的实际水平还处在起步阶段，未来还有较长路要走。因此，如何提高公牛整体遗传素质，解决公牛冻精质量差的问题，并进而培育大量良种公牛已迫在眉睫。然而，种公牛精液品质属于数量性状，遗传力极低，过去的常规育种手段很难在较短时间内发挥作用。因而，现在育种工作者们开始将目光聚焦到分子水平上以期解决这一问题，即借助标记辅助选择MAS方法，研究与种公牛精液品质性状相关的候选基因，进一步分析与侯选基因紧密连锁的分子标记，从而达到育种目的。0003单核苷酸多态性SNP是哺乳动物基因组。
8、最常见的变异类型，它们可以调控基因的表达，从而对其作用的发挥产生影响，进而引起表型的差异。通常情况下，我们将SNP分为三类，即编码区的SNP、基因间的SNP以及基因周边的SNP。基因3UTR区的SNP便属于基因周边SNP中的一种。研究表明，基因3UTR的SNP主要影响MICRORNA与3UTR结合，促进或抑制基因翻译，发挥着重要的作用。0004种公牛过渡蛋白1TRANSITIONPROTEIN1，TP1是精子中特异存在的一类富含精氨酸和赖氨酸的蛋白，其主要参与了精子变态过程中组蛋白鱼精蛋白转换这一标志性事件。即体细胞的组蛋白逐渐被睾丸特异性的组蛋白1H1T替换，后再由过渡蛋白TP替换H1T，最。
9、后TP被鱼精蛋白PRM顺序性的替换，形成精子的核鱼精蛋白。由此看见，TP1作为这一事件的参与者之一,对于牛精子正常发生是必需的。0005已有很多证据显示，在牛上，相关基因3UTR区的SNP可以通过影响MICRORNA与3UTR结合，调节精液品质特征。如牛KATNAL1基因3UTRSNP可以影响BTAMIR225P对靶基因表达的调控，从而影响牛的精液品质特征张晓建等，2014，高青等2014在牛TNP2基因上也发现类似的机制。但是，在牛TP1基因上至今未有相关SNP及MICRORNA作用对精液品质特征影响的报道。发明内容0006针对上述现有技术，本发明的目的是提出一种影响种公牛精液品质优劣的TP。
10、1基因3UTR区功能SNP位点，该SNP位点可以在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质说明书CN104293951A2/6页4中进行应用。本发明还提供了该SNP位点的引物、试剂盒和检测方法。0007为实现上述目的，本发明的具体技术方案如下0008一种影响种公牛精液品质优劣的TP1基因3UTR区功能SNP位点，所述SNP位点为G528GA；核苷酸位置的编号基于GENBANK登录号为AC_0001591105576568105577158的牛TP1基因序列，且以TP1基因的起始密码子ATG作为1。0009上述TP1基因3UTR区功能SNP位点在筛选和鉴定种公牛是否具有优质的精液品质中的应用。该种。
11、公牛TP1基因3UTR区SNPG528GA可作为功能性分子标记，继而对种公牛精液品质产生影响。经细胞瞬时转染实验验证，通过双荧光素报告系统进行分析，结果表明，TP1基因3UTR区SNP能够改变BTAMIR532结合能力，突变后3UTR区靶序列与BTAMIR532的结合能力比突变前增强，这样使TP1在突变前后呈现出不同表达水平，从而影响种公牛精液品质的优劣。0010一种用于检测TP1基因3UTR区功能SNP位点的引物，上游引物的序列如SEQIDNO1所示,下游引物的序列如SEQIDNO2所示。0011一种用于检测种公牛TP1基因3UTR区功能SNP位点基因分型的引物，上游引物GF序列如SEQID。
12、NO4所示,下游引物GR序列如SEQIDNO5所示。PCR所扩增的片段含有牛TP1第528位核苷酸PCR扩增的片段序列如SEQIDNO6所示。0012一种用于种公牛精液品质优劣筛选的试剂盒，包括上游引物GF10MOL/L，其序列如SEQIDNO4所示；下游引物GR10MOL/L，其序列如SEQIDNO5所示；上述引物能够扩增出序列如SEQIDNO6所示的片段；2TAQPCRMASTERMIX；DDH2O；FASTDIGEST限制酶TAQ；10FASTDIGESTBUFFER。0013一种用于种公牛精液品质优劣筛选的方法，以种公牛基因组DNA为模板，利用SEQIDNO4和SEQIDNO5所示的引。
13、物对待检测的种公牛的TP1基因3UTR区进行扩增，将PCR产物用FASTDIGEST限制酶TAQ进行切割，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测酶切产物，并最终根据银染后的电泳结果进行判定对于TP1基因3UTR区SNP位点G528GA，共有三种基因型，分别是GG基因型电泳显示仅有一条283BP的带，24BP的带分子量太小在电泳图中不显示，GA基因型电泳显示有307BP，283BP两条带，24BP的带分子量太小在电泳图中不显示以及AA基因型电泳显示仅有307BP一条带。其中GG基因型可使BTAMIR532与TP1基因3UTR结合能力降低，有利于TP1的表达，且SAS统计分析显示GG基因型的种公牛个体的一次射精量。
14、显著高于AA基因型个体PA。0018上述是10L的FASTDIGEST限制酶TAQ的酶切体系PCR产物25L，FASTDIGEST限制酶TAQ05L，10FASTDIGESTBUFFER2L，DDH2O5L。0019上述FASTDIGEST限制酶TAQ的酶切反应条件是37，30MIN。0020上述聚丙烯酰胺凝胶电泳所用的凝胶的质量浓度为10。0021本发明的有益效果00221本发明的用于筛选种公牛精液品质优劣的方法，既涉及到SNP对MICRORNA结合能力的影响，又运用了统计学手段进行分析，二者相互结合，大大增加了结果的可靠性，且具有新颖、低成本等优点。00232本发明提供了一种应用性极强的新。
15、型试剂盒，利用种公牛TP1基因3UTR区SNP位点G528GA进行种公牛精液品质优劣的筛选。GG基因型作为优良精液品质特征的有效分子标记，予以留种。应用该试剂盒可增加检测效率，减少了检测的盲目性，使成本费用更低、操作更加简单化。在实际中，可以大规模用于早期对种公牛筛选，淘汰部分精液品质不合格的种公牛，缩短育种所用时间，以期可以积极的推动我国奶牛行业的发展。附图说明0024图1种公牛TP1基因3UTR区SNP位点G528GA的测序图及位置；0025图2种公牛TP1基因3UTR区SNPG528GA在突变前后和BTAMIR532结合的自由能变化示意图；0026图3种公牛TP1基因3UTR区SNP位点。
16、G528GA在10聚丙烯酰胺凝胶电泳中的基因分型图；0027图4细胞瞬时转染实验验证G528GA对BTAMIR532与牛TP1基因3UTR区结合的影响。具体实施方式0028结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。0029下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如SAMBROOK等人，分子克隆实验手册NEWYORKCOLDSPRINGHARBORLABORATORYPRESS，1989中所述的条件或按照制造厂商所建议的条件。0030实施例1种公牛TP1基因3UTR区SNP的鉴定及功能验证00311采集500头种公牛血液或精。
17、液本发明所使用的种公牛精液或血液取自北京奶牛中心、上海光明荷斯坦牧业有限公司、山东奥克斯种公牛站。采用苯酚/氯仿抽提法提取血液基因组DNA，依照高盐法提取精液基因组DNA，然后利用紫外分光光度计对提取的DNA样品进行纯度和浓度的检测，并最终稀释成50NG/L，20保存备用。00322以牛精液基因组DNA为模板，利用PRIMERPREMIER50软件设计引物TP1F如SEQIDNO1所示和TP1R如SEQIDNO2所示，进行PCR扩增，扩增后的序列如SEQIDNO3所示。PCR扩增产物直接测序，测序结果与GENBANK登录号为AC_0001591105576568105577158的牛TP1基因。
18、序列进行比对，发现1个SNP位点G528GA以TP1基因说明书CN104293951A4/6页6的起始密码子ATG作为1，位于TP1基因3UTR区域内。00333利用MIRNA在线预测软件TARGETSCANHTTP/WWWTARGETSCANORG/INDEXHTML预测与TP1基因3UTR区域SNP结合的MIRNAS。结果表明TP1基因3UTR上的SNPG528GA位于BTAMIR532的种子区，可与突变型AA的TP13UTR片段结合，且突变前后和BTAMIR532结合的自由能发生变化，结果如图2所示。通常情况下自由能越小，结合能力越强，因此，结合图2可以得出突变后牛TP1基因3UTR区与。
19、BTAMIR532的结合能力可能比突变前增强。00344利用创造酶切位点的方法，设计出特异性的专用分型引物GF如SEQIDNO4所示和GR如SEQIDNO5所示，使牛TP1第528位碱基GA突变G528GA可以被FASTDIGEST限制酶TAQ识别。以种公牛基因组DNA为模板，利用上述特异性的专用分型引物GF如SEQIDNO4所示和GR如SEQIDNO5所示进行PCR扩增，扩增后的序列如SEQIDNO6所示。PCR扩增产物经FASTDIGEST限制酶TAQ切割后，在10的聚丙烯酰胺凝胶电泳中予以分型。分型结果如图3所示。三种基因型分别为GG基因型电泳显示仅有一条283BP的带，24BP的带分子。
20、量太小在电泳图中不显示，GA基因型电泳显示有307BP，283BP两条带，24BP的带分子量太小在电泳图中不显示以及AA基因型电泳显示仅有307BP一条带00355利用细胞瞬时转染实验对上述预测结果进行验证，分别将含有野生型GG和突变型AA的3UTR片段与PMIR载体连接，构建3UTR荧光素酶表达质粒，并对应命名为PMIR3UTRG和PMIR3UTRA；同时，构建BTAMIR532质粒。随后将3UTR荧光素酶表达质粒PMIR3UTRG和PMIR3UTRA，分别与BTAMIR532质粒、内参GAL质粒共转染小鼠睾丸间质细胞MLTC1，培养36小时后,通过双荧光素报告系统进行分析，结果如图4所示。。
21、野生型质粒的活性高于突变型的质粒，这和上述的预测结果一致。说明突变后即AA基因型时，BTAMIR532与牛TP1基因3UTR区结合能力比突变前即GG基因型时强，从而使TP1基因表达量降低。TP1基因的低表达不利于种公牛精液品质的提高，因此再次可以认定GG基因型是有利的分子标记，AA基因型为不利的分子标记。0036实施例2牛TP1基因3UTR区SNP分子标记与种公牛精液品质的关联分析0037利用统计学软件SAS90，比较分析牛TP1基因3UTR区SNPG528GA的不同基因型与种公牛精液品质的相关性。其模型为YIJKGIYJHKEIJK。YIJK为公牛精液品质性状的观察值；为群体平均值；GI基因。
22、型的固定效应；YJ季节的固定效应；HK场次的固定效应；EIJK随机残差效应。以期通过此关联分析，选择优质精液品质的基因型个体进行留种。0038关联性分析的结果如表1所示，可以得出结论野生GG基因型的种公牛个体的一次射精量显著高于突变AA基因型个体PA的不同基因型与种公牛精液品质的关联分析说明书CN104293951A5/6页700400041实施例3制备用于种公牛精液品质优劣筛选的TP1基因3UTR区SNP检测试剂盒0042如实施例1中所示，牛TP1基因3UTR区SNPG528GA突变前后可以改变BTAMIR532的结合能力，影响TP1基因的表达。其中，GG基因型可以使BTAMIR532与TP。
23、1基因3UTR区序列的结合能力下降，有利于TP1基因的高表达。而高表达的TP1基因对精子发生及精液的品质是极其重要的。又如实施例2中的关联分析所示，此SNPG528GA与一次射精量和精子畸形率显著相关，GG基因型的种公牛个体的一次射精量显著高于AA基因型个体PA与种公牛精液品质优劣密切相关，GG基因型作为有利的分子标记，可参与筛选具有优良精液品质的种公牛。鉴于此，本发明提供了一种用于筛选种公牛精液品质优劣的TP1基因3UTR区的SNP检测试剂盒。其详细成分如下0043上游引物GF10MOL/L，其序列如SEQIDNO4所示；0044下游引物GR10MOL/L，其序列如SEQIDNO5所示；00。
24、452TAQPCRMASTERMIX；0046DDH2O；0047FASTDIGEST限制酶TAQ；004810FASTDIGESTBUFFER；0049该试剂盒的使用说明书包括四部分0050第一部分，25LPCR扩增反应的体系，主要包括上游引物GF如SEQIDNO4所示和下游引物GR如SEQIDNO5所示各1L，引物浓度为10MOL/L；2TAQPCRMASTERMIX125L；模板DNA1L，DNA浓度为100NG/L；DDH2O95L。0051第二部分，PCR扩增反应的条件，预变性，温度94，时间5MIN；35个循环，包括94变性30S，58退火30S,72延伸20S；终延伸，温度72，。
25、时间10MIN0052第三部分，10L的FASTDIGEST限制酶TAQ的酶切体系PCR产物25L，FASTDIGEST限制酶TAQ105L，10FASTDIGESTBUFFER2L，DDH2O5L。0053第四部分，FASTDIGEST限制酶TAQ的酶切反应条件是37，30MIN。0054本发明实际上根据TP1基因3UTR区的SNP，进而提出一种用于筛选种公牛精液品说明书CN104293951A6/6页8质优劣的方法及试剂盒。牛TP1基因3UTR区SNPG528GA与种公牛精液品质性状显著相关，具有GG基因型的种公牛个体的精液品质较优，因此，GG基因型可以作为有效地功能性分子标记，参与种公牛。
26、的育种改良。利用此试剂盒，将GG基因型的种公牛筛选出来，予以留种，淘汰AA基因型种公牛个体。0055本发明与常规的测序手段进行分型相比，具有费用更低、耗时更少及效率更高等优点，符合现代科学发展的理念，可以在未来种公牛遗传育种中被广泛的使用。0056上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。说明书CN104293951A1/2页90001序列表CN104293951A2/2页100002序列表CN104293951A101/2页11图1图2说明书附图CN104293951A112/2页12图3图4说明书附图CN104293951A12。