细胞转染 基因转移技术已成为人们极为关注的一个领域。把一外源基因导入细胞中(即转染)在科学及医学上具有许多重要应用，范围包括从基因调控及重组蛋白质的生产到基因治疗。
病毒已演化得能绕过各种细胞障碍达到基因转移的目的，其实际上已成为转染的选择性载体。目前人们已对多种病毒〔包括逆转录病毒、腺病毒或疱疹病毒〕进行工程处理以携带治疗基因，用于基因治疗中的人类临床尝试。不过，这方面存在着感染及免疫反应上的危险，而病毒的大规模生产既困难又耗时。
由于这些原因，人们便开发出了非病毒性系统来把DNA携带入细胞中，例如依据阳离子脂质(二油酰氧基三甲铵)的转染技术(Felgner等人，Proc.Natl.，Acad.Sci，USA，84，7413-7417，1987)，商用形式为LipofectinTM。由于发现了这种转染技术，已经合成出多种阳离子脂质，其中一些已做为可商购转染试剂用于实验室：DOGS(Trans-fectamTM)、DOSPA(LipofectamineTM)、DOTAP(DOTAPTM)。
尽管如此，虽然在建立非病毒性基因送递系统方面取得了重要的进展，但仍然存在着对更有效技术的需求，因为合成系统的转染效率通常要低于病毒载体的转染效率。另外，在活体应用方面也存在着许多问题，而生物液体中非病毒系统稳定性差也无法保证活体转染的高、可再现水平。
根据本发明我们发现，与脂肪酸部分相偶联的寡肽可以结合核酸、并可用于细胞转染。
因此，一方面，本发明涉及到具下述分子式I的化合物或其衍生物作为用聚核苷酸或任何其它阴离子大分子转染细胞的载体的应用：
R1-NH-A I
其中，R1为C12-40脂族羧酸的酰基部分，而A是缺少一个氨基的寡肽地残基。
术语“C12-40”指从12-40个碳原子。酰基部分R1可以是直链或支链、 饱和或非饱和部分。酰基部分R1优选含12-20个碳原子。这类基团的实例有月桂酰、棕榈酰、硬脂酰、油酰以及(CH3(CH2)n)2CHCO-，其中n为3-19的整数。最优选者为棕榈酰以及油酰。术语“寡肽”指含氨基酸残基达20个(至少含一个碱性氨基酸)的肽，优选达10个，更优选达2-6个氨基酸残基。术语“衍生物”指寡肽，其中末端羧基被酯化，尤其是形成了低级烷基酯(如甲酯及乙酯)；或者转化为酰胺、低级烷基酰胺或双低级烷基酰胺或酰肼。酰肼为优选衍生物。术语“低级”是指含1-6碳原子的基团。术语“碱性氨基酸”是指所含碱性基团(如氨基、脒基或胍基)比羧基多的氨基酸。这类碱性氨基酸的实例有天然及非天然性的二氨基一元羧酸，如α，β-二氨基丙酸、α，γ-二氨基丁酸，赖氨酸、精氨酸、鸟氨酸和对氨基苯丙氨酸。氨基酸可属于L-或D-系列的，也可以是外消旋的，α，γ-二氨基丁酸、赖氨酸及鸟氨酸为具分子式I的化合物的优选氨基酸组分。聚核苷酸的实例为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。除聚核苷酸之外的阴离子大分子实例为蛋白质如核糖核蛋白及用于免疫作用的蛋白质(例如病毒蛋白)。
本发明中所使用的DNA实例为质粒及基因，特别是那些基因治疗方案中已利用的DNA，如囊性纤维化跨膜调节基因(CFTR)、腺苷脱氨酶(ADA)、腺苷激酶(tk)及HLA B7；还有报告基因，如β-半乳糖苷酶、荧光素酶、氯霉素转移酶以及α-1抗胰蛋白酶。
DNA的其它实例为寡脱氧核苷酸及其用做反义、aptamer或“三螺旋”试剂的类似物。RNA的实例为核酶或寡核糖核苷酸反义分子。
本发明中使用的具分子式I的化合物实例有Nα-棕榈酰-L-赖氨酰-L-赖氨酸及其甲酯及乙酯；Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼；以及Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼。人们已熟知具分子式I的化合物，参见Helv.Chim.Acta.47(1964)P.526-543。
要进行转染的细胞的特性并非要求十分严格。细胞可以是原核或真核细胞、哺乳动物或植物细胞。
依据本发明来转染细胞(例如用DNA或RNA进行转染)时，具分子式I的化合物与DNA或RNA之间的比率优选为：具分子式I的正电荷性化合物与负电荷性的DNA或RNA之间的+/-电荷之比的范围为0.1-10，更优选为0.5-5。
在本发明的优选方面，转染是在存在协助脂质及/或短链磷脂及/或其它已知转染感受态分子的条件下进行的。协助脂质的实例为磷脂，如卵磷脂或脑磷脂或其混合物。优选的协助脂质是脑磷脂，如二油酰脑磷脂。短链磷脂的实例是卵磷脂，其携带着两个C6-12脂肪酸残基。优选的短链磷脂为二辛基及二辛酰基卵磷脂。协助脂质及/或短链磷脂的适宜形式为脂质体、混合性微团、有机溶液或水分散体。
转染感受态分子的实例包括阳离子脂质，如J.B.Behr在Bioconiugate Chem.5：382-389(1994)及X.Gao和L.Huang在GeneTher.2：710-722(1995)中所述；聚阳离子，如A.V.Kabanov及V.A.Kabanov在Bioconjugate Chem.6：7-20(1995)中所述；肤及聚合物及其它非病毒基因送递体系，如F.D.Ledley在Human Gene Therapy6：1129-1144(1995)中所述。
另一方面，本发明涉及含上述分子式I化合物、聚核苷酸或任何其它阴离子大分子、以及可选择的协助脂质和/或短链磷脂及/或如上所述的其它已知转染感受态分子的组合物。在其另一方面，本发明还涉及含上述分子式I化合物、以及协助脂质及/或短链磷脂的组合物。
在本发明的实施中，将适宜量的分子式I化合物加入溶于适当的水溶液中的要转染的分子(例如质粒DNA)中。加入协助脂质，如需要的话，加入短链磷脂及/或其它已知转染感受态分子，可以是脂质体、混合性微团形式，也可以是有机溶液或水分散体形式。另外，向含分子式I化合物、协助脂质及如需要的话，短链磷脂及/或其它已知转染感受态分子的组合物中，加入所要转染的分子。该组合物可以是固态、液态、半固态或气溶胶形式的，适宜的形式为脂质体、混合性微团或为有机溶液或水分散体形式。
组分(即分子式I的化合物、转染分子、及可选择的附加成份)之间的最适比例要依所转染的细胞而定。化合物I及所转染的分子之间的最适+/-电荷比在0.1-10间变化，优选为0.5-5。分子式I的化合物与协助脂质之间的最适摩尔比为0.1-50，优选为1-10。协助脂质与短链磷脂之间的最适摩尔比为2-20。分子式I的化合物与附加性转染感受态分子之间的最适摩尔比为0.1-10。
对转染而言，把含有上述分子式I化合物、聚核苷酸或任何其它阴离子大分子及可选择的协助脂质及/或短链磷脂及/或上述其它已知转染感受态分子的组合物加入细胞中。对病兽或患者的细胞进行转染时，组合物的施用途径可以为口服、肠胃外服用(i.v.，i.m.，s.c.，i.d.，i.p.)、跨皮肤施用、肺部、鼻道、直肠、眼部、心室、血管(导管)及肿瘤内使用。另外，该组合物还可以通过高速嵌塞在皮肤表面使用。转染的进展可通过本领域技术人员所熟知的适宜测试方案进行检测。
下述非限制性实施例将进一步说明本发明。
实施例1
利用真空下干燥氯仿中的脂质溶液，而后再利用30mM Tris Cl(pH8.5)来再水化，以此来制备出二油酰脑磷脂(DOPE，Avanti Polar Lipid公司)。脂质的终浓度为2mM。而后在声波浴(Elgasonic，50kHz)中对脂质分散液进行声波处理10-15分钟。
用260μl的无菌蒸馏水，在聚苯乙烯无菌试管中对20μg质粒DNA进行稀释。而后，加入56nmo1(35.2μg)的Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼，使得Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼与DNA之间的+/-电荷比为2∶1。而后缓慢逐滴加入140μl的DOPE脂质体，使DOPE与Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼之间的摩尔比为5∶1。谨慎混合复合体。将制备液放置室温下大约5分钟，然后加入到在96小格平板上生长的COS-1细胞中。
对于其它分子式I化合物使用类似的制备程序。
各种化合物的转染效率如表1所示。
表1
实施例1中分子式I的化合物在COS-1细胞中的转染效率。
用β-半乳糖苷酶编码质粒来转染细胞，转染后48小时对β-半乳糖苷酶活性进行检测。结果表述为每转染格的β-半乳糖苷酶μ单位。分子式I的化合物β-半乳糖苷酶活性 0.2μg DNA/格 1μg DNA/格Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 5772 9942Nα棕榈酰-L(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 2742 3519Nγ棕榈酰-D(α，γ-二氨基丁酰)-D(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 1847 7768Nγ棕榈酰-L(α，γ-二氨基丁酰)-D(α，γ-二氨基丁酰)-D(α，γ-二氨基丁酰)-L(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 497 542Nγ棕榈酰-L(α，γ-二氨基丁酰)-L(α，γ-二氨基丁酰)-L(α，γ-二氨基丁酰)-L(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 1800 7835Nα棕榈酰-L(α，γ-二氨基丁酸)酰肼 606 1411Nγ-棕榈酰-D(α，ε-二氨基丙酰)-L-(α，ε-二氨基丙酸)酰肼 0 3671Nγ-棕榈酰-D-(α，ε-二氨基丙酰)-L(α，ε-二氨基丙酸)乙酯 359 0Nα棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酸乙酯 138 424Nα棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酰-L赖氨酸酰肼 136 2232Nα棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酸甲酯 0 150Nα棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酸 0 530Nε棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酸甲酯 0 100Nε棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酰-L赖氨酸甲酯 0 1426Nα油酰-L赖氨酰-L赖氨酸乙酯 0 1333Nα花生酰-L赖氨酰-L赖氨酸甲酯 0 148Nα棕榈酰-L-精氨酰-L精氨酸乙酯 0 382Nα棕榈酰-L鸟氨酰-L鸟氨酸甲酯 44 789Nα棕榈酰-(L鸟氨酰)5-L鸟氨酸乙酯 625 12210Nα棕榈酰-L赖氨酰-L丝氨酸甲酯 0 219Nα棕榈酰-L-精氨酰-L鸟氨酸甲酯 0 870Nα棕榈酰-L(α，γ-二氨基丁酰)-L赖氨酸甲酯 62 791Nα棕榈酰-L赖氨酰-L赖氨酸苄酰胺 510 845
实施例2
通过真空下干燥脂质、再用1ml的30mM Tris Cl缓冲液(pH8.5)对脂质膜进行再水化来制备出DOPE(2μmol)和二己酰基卵磷脂(15μmol)的混合性微团。用260μl的蒸馏水在聚苯乙烯无菌试管中将20μg的质粒pCH110稀释。而后，加入56nmol(35.2μg)的Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼，使得Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼与DNA的+/-电荷比为2∶1。然后缓慢加入140μl的DOPE/二己酰基PC混合微团，使得DOPE与Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼之间的摩尔比为5∶1。谨慎混合复合体。把制备液在室温下放置约5分钟，而后加入到96小格平板上生长的COS-1细胞中。
COS-1细胞的转染效率(以β-半乳糖苷酶活性表示)，每格0.2μg及1μg DNA时分别是7280和6375μ单位/格。
实施例3
将56nmol(35.2μg)的Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼与5摩尔过量的DOPE脂质体(280nmol，如实施例1所制备)相混合。将混合物加入到260μl蒸馏水中的20μg质粒DNA中，使得Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼与质粒DNA的+/-电荷比为2∶1。谨慎混合复合体。将制备物在室温下放置约5分钟，而后加入到96小格平板上生长的COS-1细胞中。
COS-1细胞的转染效率(以β-半乳糖苷酶活性表示)在每格为0.2μg及1μg DNA时分别为4205及7880μ单位/格。
实施例4
如实施例1所述，制备出含Nγ-棕榈酰-D-(α，γ-二氨基丁酰)-L-(α，γ-二氨基丁酸)酰肼(化合物A)的转染复合体。依照厂家说明来制备Lipofectamine复合体。利用荧光素酶编码载体在各种细胞系中对二者系统的转染效率进行比较。
结果见表2。
表2 细胞系 cpd A Lipofectamine cpdA优于Lipofectamine的效果293-EBNA CHO K1 HeLa LM tk- 5.0105 1.6106 1.0103 5.7105 9.9104 4.8104 2.4102 4.5104 5 33 4 12
利用荧光素酶编码质粒转染细胞，转染后48小时后对荧光素酶活性进行检测。结果表述为相对光单位。