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1、10申请公布号CN104293822A43申请公布日20150121CN104293822A21申请号201410525823622申请日20141009C12N15/70200601C12N15/66200601C12N9/8820060171申请人河南农业大学地址450002河南省郑州市金水区文化路95号72发明人杨国宇郭准王江王月影郭豫杰李和平朱河水钟凯鲁维飞韩立强耿娟74专利代理机构郑州联科专利事务所普通合伙41104代理人时立新54发明名称一种用于DISA表达的PEXMBP重组质粒57摘要本发明属于基因工程技术领域，涉及一种DISA表达过程中所使用的重组质粒PEXMBP及其制备。所述。
2、PEXMBP重组质粒的碱基序列如序列表所示。该重组质粒是在PBBB3AGFP的基础上改造而成的。将该重组质粒用于制备可溶性的DISA蛋白时，以丙酸钠作为诱导剂。本发明所提供的PEXMBP重组质粒，特异性的用于DISA蛋白的表达纯化，与传统的PET28（）载体所构建的重组质粒表达体相比，所表达的DISA蛋白可溶度较高；其次所构建的表达系统以丙酸钠作为诱导剂，成本低廉，而且对细菌没有毒性，因而适于表达DISA蛋白，且表达后的蛋白可特异性的切除相关标签蛋白，获得的DISA蛋白纯度较高。51INTCL权利要求书1页说明书7页序列表7页附图7页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1。
3、页说明书7页序列表7页附图7页10申请公布号CN104293822ACN104293822A1/1页21一种用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，其特征在于，所述PEXMBP重组质粒的碱基序列如序列表所示。2权利要求1所述用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒的制备方法，其特征在于，该重组质粒是在PBBB3AGFP的基础上改造而成的，包括以下步骤（1）将质粒PBBB3AGFP上的SSP位点进行突变；（2）用NDE和BAMH双酶切步骤（1）中突变后的PBBB3AGFP；（3）用NDE和BAMH双酶切PMD19THIS6MBPTEVLIC质粒；（4）将步骤（2）和步骤（3）双酶切产物进行。
4、连接即得PEXMBP重组质粒。3如权利要求2所述PEXMBP重组质粒的制备方法，其特征在于，步骤（1）中SSP位点突变为将质粒PBBB3AGFP上的279和5099处的SSP点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT。4权利要求1所述用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒在制备可溶性的DISA蛋白中的应用，其特征在于，制备可溶性的DISA蛋白包括以下步骤（1）PCR克隆、扩增DISA基因；（2）非酶连接方法将步骤（1）中扩增后DISA基因连接到PEXMBP重组质粒上，构建重组质粒表达载体PEXMBPDISA；（3）将重组质粒表达载体PEXMBPDISA转化进入大肠杆菌BL21诱导表达。
5、，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DISA蛋白。5如权利要求4所述PEXMBP重组质粒在制备可溶性的DISA蛋白中的应用，其特征在于，步骤（3）中所述诱导采用丙酸钠作为诱导剂。权利要求书CN104293822A1/7页3一种用于DISA表达的PEXMBP重组质粒技术领域0001本发明属于基因工程技术领域，涉及一种DISA（DNAINTEGRITYSCANNINGPROTEINA，DNA损伤修复蛋白）表达过程中所使用的重组质粒PEXMBP及其制备和用途。背景技术0002DISA（DNAINTEGRITYSCANNINGPROTEINA）是DNA损伤修复蛋白的简写，它能够发现机体的DNA损伤，并。
6、且来进行修复，从而保持DNA的完整性。研究发现，它具有二腺嘌呤环化酶（DIADENYLATECYCLASE，DAC）活性，能够催化两个ATP生成环二腺嘌呤核苷酸CDIAMP，CDIAMP是细菌的第二信使，不但与细胞形态的调控和细胞壁的合成有密切的关系，还与病原菌的致病性和细菌的耐药性有关，因而，CDIAMP在免疫学上也有很好的实用价值。0003目前在大肠杆菌的蛋白表达系统中，广泛采用的是T7表达系统（KANGY，SONMS，HOANGTT；ONESTEPENGINEERINGOFT7EXPRESSIONSTRAINSFORPROTEINPRODUCTIONINCREASINGTHEHOSTRA。
7、NGEOFTHET7EXPRESSIONSYSTEM；PROTEINEXPRPURIF，2007，552325333），它含有T7启动子，T7启动子是通过诱导型的启动子比如LACUV5来调控的，因而宿主必须携带T7基因并且能够编码T7RNA聚合酶，一般广泛使用的宿主菌是BL21DE3。0004T7表达系统表达蛋白过程中，影响蛋白表达效果的一个主要原因是诱导剂的使用。例如常见的以IPTG为诱导剂表达蛋白过程中，LACUV5启动子在IPTG的诱导作用下使宿主菌表达T7RNA聚合酶，使T7启动子与目的蛋白高效率的进行表达。但是由于IPTG成本较高，因而限制了IPTG诱导的T7表达系统在大规模蛋白表达。
8、过程中的使用。另外，由于IPTG很难被细菌细胞消化而易使表达的蛋白污染，加之IPTG的毒性作用，因而无法使用IPTG诱导的T7表达系统来表达人类的蛋白。现有技术中，有研究尝试采用乳糖代替IPTG作诱导剂，或者使用温度控制的表达系统来进行蛋白诱导表达的，但也存在各种需要进一步完善的问题（NEUBAUERP，HOFMANNK，HOLSTOETAL；MAXIMIZINGTHEEXPRESSIONOFARECOMBINANTGENEINESCHERICHIACOLIBYMANIPULATIONOFINDUCTIONTIMEUSINGLACTOSEASINDUCER；APPLMICROBIOLBIOTE。
9、CHNOL，1992，366739744）。例如，采用温控表达系统所表达的蛋白易形成包涵体，可溶性蛋白的量仅为总蛋白量的13。0005另一个影响T7表达系统的因素是部分蛋白表达不稳定，这主要是因为T7RNA聚合酶有时候会缺失表达，即使将基因直接放在LACUV5启动子的后面，RNA聚合酶有时也会缺失表达。因此为了减少RNA聚合酶缺失的影响，研究人员采取了各种措施来防止不诱导时RNA聚合酶的表达，或者在不诱导时来抑制RNA聚合酶的活性，但是效果都不太理想。0006为了克服现有T7表达系统存在的一些问题，有研究人员构建了新的T7表达系统，称为PBADT7系统，但它也并不是没有问题的。该系统是通过阿拉。
10、伯糖进行诱导的（KHLEBNIKOVA，RISAO，SKAUGTETAL；REGULATABLEARABINOSEINDUCIBLEGENEEXPRESSIONSYSTEMWITHCONSISTENTCONTROLINALLCELLSOFACULTURE，J说明书CN104293822A2/7页4BACTERIOL，2000，1822470297034），首先的问题是阿拉伯糖不能够通过细胞膜进行自由扩散，其次阿拉伯糖的价格虽然比IPTG便宜，但是如果要大量表达蛋白的话，代价还是会很高。0007现有技术中，关于DISA蛋白的表达仍然采用传统的T7表达系统，即通过PET28（）载体将DISA基因转。
11、入大肠杆菌BL21表达菌株中，这种方法所制备DISA蛋白可溶度较差，而且诱导表达时以IPTG作为诱导剂，存在蛋白制备成本高，无法大量制备的弊端，因而急需开发一种适于DISA蛋白大量表达的表达系统。发明内容0008本发明目的在于提供一种用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，通过将该质粒引入T7表达系统，同时结合诱导系统的改变，可以大量制备DISA蛋白。0009本发明采取的技术方案如下一种用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，其碱基序列如序列表所示。0010用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒的制备方法，该重组质粒是在PBBB3AGFP的基础上改造而成的，包括以下步骤（1）将质粒。
12、PBBB3AGFP上的SSP位点进行突变；（2）用NDE和BAMH双酶切步骤（1）中突变后的PBBB3AGFP；（3）用NDE和BAMH双酶切PMD19THIS6MBPTEVLIC质粒；其中HIS6表示6个组氨酸标签，MBP（MALTOSEBINDINGPROTEIN）表示麦芽糖酶结合蛋白，TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶序列，LIC表示非酶连接位点；（4）将步骤（2）和步骤（3）双酶切产物进行连接即得PEXMBP重组质粒。0011步骤（1）中SSP位点突变为将质粒PBBB3AGFP上的279和5099处的SSP点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT。0012所述用于DISA蛋白表达的P。
13、EXMBP重组质粒用于制备可溶性的DISA蛋白，包括以下步骤（1）PCR克隆、扩增DISA基因；（2）非酶连接方法将步骤（1）中扩增后DISA基因连接到PEXMBP重组质粒上，构建重组质粒表达载体PEXMBPDISA；（3）将重组质粒表达载体PEXMBPDISA转化进入大肠杆菌BL21诱导表达，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DISA蛋白。0013步骤（3）中所述诱导采用丙酸钠作为诱导剂。0014现有技术中，为增加表达后蛋白的可溶性，可以在载体上增加可溶性标签以避免包涵体的形成（刘爽；原核表达可溶性表达策略；生物技术通讯，2005，162172175），而且有些标签不仅能够增加蛋白的可溶性而。
14、且还可以进行蛋白纯化，比如GST、MBP等。然而需要注意的是，由于许多标签都是分子量大的蛋白，当使用它们做可溶性融合标签后通常需要进一步考虑将它们移除的问题。对于本发明而言，为增加表达后蛋白的可溶性，同样采用了增加标签的做法，本发明采用的是分子量为42KD的MBP标签，它能有效增加表达后的DISA蛋白的可溶性。但本发明所增加的标签是构建于重组后的质粒上的，即将标签与质粒重组后，然后再连接DISA基因进行表达，并非表达DISA蛋白后才增加的标签，与现有技术说明书CN104293822A3/7页5差别较大。0015多聚组氨酸标签所表达的是一种带有多个组氨酸的小肽，作为一种融合标签，用来表达融合蛋白。
15、非常方便，而且易于纯化，本发明所添加的6HIS标签就是利用了这个优点，利用该标签可以准确地识别和纯化目的蛋白。0016增加标签虽然可以提供蛋白的可溶性，但是生物化学研究和用于治疗作用的蛋白则仍需要移除这些标签而保留稳定的、可溶性的目的蛋白。为了达到这样的目的，最常用的措施是在可溶性标签和目的蛋白之间设计一个蛋白酶切割位点，还要确保目的蛋白在移除标签后具有活性。本发明通过在融合部位的N端放置一个TEV标签，它的特异性很高，作为蛋白酶切割位点，在获得高纯度蛋白后，便于从N端进行切割来获得目的蛋白。0017为了克服现有的T7表达系统中采用IPTG作为诱导剂成本较高、且存在毒性的弊端，在将重组质粒表达。
16、载体PEXMBPDISA转化大肠杆菌后，可采用低成本的丙酸钠诱导表达系统。丙酸钠是一种膜通透性弱酸盐，可以通过细胞膜渗透出来，在酶的作用下转变为2甲基枸橼酸，从而进一步激活PRPBCDE操纵子的转录，诱导目的蛋白的表达。由于丙酸钠诱导表达系统可以在不同的诱导物浓度下有效的调控蛋白表达，而且当诱导物浓度很高时也可以高效表达蛋白，因而适于大规模制备DISA蛋白。0018本发明是先将PBBB3AGFP进行位点突变，突变后进行双酶切。重组的HIS6MBPTEVLIC标签是连接于PMD19T质粒载体中的，将PMD19THIS6MBPTEVLIC质粒进行双酶切，然后将其与切开的PBBB3AGFP进行连接，。
17、这样就得到了本发明的重组质粒。具体表达DISA蛋白时，首先将本发明所提供的PEXMBP重组质粒连接DISA基因，构建PEXMBPDISA重组表达质粒载体，然后转化大肠杆菌BL21细胞诱导表达，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DISA蛋白。PEXMBPDISA重组表达质粒载体中，LIC是非酶连接位点，DISA基因是在该位点连入，而TEV正好在LIC位点的N端，而TEV是蛋白酶切割位点，因而蛋白表达完成后便于将相关标签切除。0019综上所述，本发明所提供的用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，特异性地用于DISA蛋白的表达纯化，与传统的PET28（）载体所构建的重组质粒表达载体相比，由于加。
18、入了可溶性的标签麦芽糖结合蛋白（MBP），因而所表达的DISA蛋白可溶度较高；其次所构建的表达系统以丙酸钠作为诱导剂，成本低廉，而且对细菌没有毒性，因而适于表达DISA蛋白，且表达后的蛋白可特异性的切除相关标签蛋白，获得的DISA蛋白纯度较高，因而具有较好的适用性。附图说明0020图1为突变后质粒PBBB3AGFPM的NDE和BAMH双酶切电泳结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2是双酶切电泳结果；图2是质粒PMD19THIS6MBPTEVLIC的NDE和BAMH双酶切结果，其中1是DNA分子质量标准DL5000，2是双酶切电泳结果；图3为重组质粒菌液PCR鉴定结果，其中1是DNA分。
19、子质量标准DL5000，26是菌液PCR结果；图4为构建PEXMBPDISA重组质粒表达载体流程示意图；图5为DISA基因PCR扩增结果，其中1为DNA分子质量标准DL2000，2为DISA基因说明书CN104293822A4/7页6PCR扩增结果；图6为重组质粒PEXMBP的SSP单酶切结果，其中1为DNA分子质量标准DL15000，2为重组质粒PEXMBP的SSP单酶切结果；图7为重组表达质粒载体PEXMBPDISA的酶切鉴定结果，其中1为重组表达质粒载体的ECOR单酶切鉴定，2为DNA分子质量标准DL5000；图8为PEXMBPDISA和PET28DISA诱导后的菌体破碎后的上清的WES。
20、TERNBLOTTING结果，其中1为PET28DISA诱导后的菌体破碎后的上清的WESTERNBLOTTING结果，2为PEXMBPDISA诱导后的菌体破碎后的上清的WESTERNBLOTTING结果。具体实施方式0021下面结合实施例对本发明做进一步的解释说明，以使本领域技术人员便于理解和实施本发明。0022实施例1用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，该质粒是在PBBB3AGFP的基础上进行改造的，首先按照QUIKCHANGESITEDIRECTEDMUTAGENESISKITAGILENTTECHNOLOGIES公司，200518试剂盒说明，对PBBB3AGFP上的279和509。
21、9处的SSP点进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT，突变后载体暂时命名为PBBB3AGFPM，然后用NDE和BAMH双酶切PBBB3AGFPM。HIS6MBPTEVLIC序列由上海生工生物工程有限公司合成，合成后序列连入PMD19T质粒载体中，与PBBB3AGFPM连接时，将PMD19THIS6MBPTEVLIC质粒双酶切，然后与双酶切后的PBBB3AGFPM连接即可得到本发明用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，命名为PEXMBP，其中HIS6表示6个组氨酸标签，MBP（MALTOSEBINDINGPROTEIN）表示麦芽糖酶结合蛋白，TEV表示烟草蚀刻病毒蛋白酶序列，LIC。
22、表示非酶连接位点。0023具体制备过程简要介绍如下（1）突变PBBB3AGFP质粒上的SSP位点引物的设计和合成SSPI279MUTATIONFCATATTACGCAGTTCGCGTATATTACCGGGCCAGCGC；SSPI279MUTATIONRGCGCTGGCCCGGTAATATACGCGAACTGCGTAATATG；SSPI5099MUTATIONFTCATACTCTTCCTTTTTCTATATTATTGAAGCATTTA；SSPI5099MUTATIONRTAAATGCTTCAATAATATAGAAAAAGGAAGAGTATGA。0024位点突变按QUIKCHANGESITEDIR。
23、ECTEDMUTAGENESISKITAGILENTTECHNOLOGIES公司，200518试剂盒说明书对PBBB3AGFP上的279和5099处的SSP进行突变，将AAT/ATT突变为TAT/ATT，突变后载体暂时命名为PBBB3AGFPM。0025（2）构建PEXMBP重组质粒将PBBB3AGFPM用NDE和BAMH双酶切，结果如图1所示，回收4500BP左右片段，然后将上海生工生物工程有限公司所提供的PMD19THIS6MBPTEVLIC质粒也使用NDE和BAMH双酶切，结果如图2所示，回收1200BP左右片段，然后将所回收片段用T4DNA连接酶进行连接。说明书CN104293822A。
24、5/7页70026PBBB3AGFPM双酶切体系NDE（FERMENTAS，FD0584），1L；BAMHFERMENTAS，FD0054，1L；10酶切缓冲液FERMENTAS，FD0054，2L；PBBB3AGFPM（150NG/L），10L；DDH2O，6L；37酶切1H。0027PMD19THIS6MBPTEVLIC双酶切体系NDE（FERMENTAS，FD0584），1L；BAMHFERMENTAS，FD0054，1L；10酶切缓冲液FERMENTAS，FD0054，2L；PMD19THIS6MBPTEVLIC150NG/L，10L；DDH2O，6L；37酶切1H。0028T4DNA。
25、连接酶连接体系T4DNA连接酶（FERMENTAS，EL0014），1L；10连接酶缓冲液（FERMENTAS，EL0014），1L；PBBB3AGFPM切胶回收产物20NG/L，2L；PMD19THIS6MBPTEVLIC切胶回收产物15NG/L，2L；DDH2O，4L；22连接20MIN，然后转化至大肠杆菌DH5感受态细胞。0029转化后菌液铺于含氨苄青霉素（100G/ML）的固体LB平板上，所培养的单菌落用含氨苄青霉素（100G/ML）的液体LB进行扩大培养，培养后菌液进行PCR鉴定，鉴定结果如图3所示，将鉴定结果为阳性的菌落用质粒小量提取试剂盒（上海生工，SK8192）进行提取，提取所。
26、得即为本发明所提供的用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒，其碱基序列如序列表所示。0030实施例2将实施例1所制得的用于DISA蛋白表达的PEXMBP重组质粒构建PEXMBPDISA，构建过程如图4所示，然后诱导表达DISA蛋白，具体过程简述如下首先PCR克隆DISA基因，然后通过非酶连接方法将DISA基因连接到实施例1所制得的PEXMBP重组质粒上，构建PEXMBPDISA重组质粒表达载体，将该载体转化进入大肠杆菌BL21中进行诱导表达，诱导表达时以丙酸钠作为诱导剂，表达完成后破碎、离心、提纯即可获得DISA蛋白。0031详细的制备步骤简要介绍如下（1）PCR克隆DISA基因引物的设计。
27、和合成根据DISA基因的核苷酸序列和表达载体克隆位点的要求，设计引物，具体序列如下F5TACTTCCAATCCAATGCAATGGTTGCTCCGGGTACCGC3；R5TTATCCACTTCCAATGTTATTAACCCATGTAACGTTCCAGC3。0032引物由上海生工生物工程有限公司合成。说明书CN104293822A6/7页80033PCR扩增目的片段PCR体系Q5聚合酶（NEB，M0493L），025L；5Q5聚合酶缓冲液（NEB，M0493L），5L；5Q5聚合酶ENHANCER（NEB，M0493L），5L；PRIMERF（20MOL/L），05L；PRIMERR（20MOL。
28、/L），05L；PMD19TDISA质粒（购自上海生工生物工程有限公司）（100NG/L），1L；25MMDNTP（TAKARA,RR001A），2L；DDH2O，1075L。0034反应条件955MIN，9530S，6530S，7270S，反应35个循环，7210MIN。0035将PCR产物跑1的琼脂糖凝胶电泳，结果见图5，用切胶纯化试剂盒（上海生工，SK8132）进行回收。0036DISA基因与PEXMBP重组质粒连接构建PEXMBPDISA重组质粒表达载体将步骤回收的DISA基因与实施例1制备的PEXMBP重组质粒连接，构建PEXMBPDISA重组质粒表达载体，并筛选，鉴定，过程如下将实。
29、施例1制备的PEXMBP重组质粒用SSP酶FERMENTAS，FD0774进行单酶切，酶切后产物跑1的琼脂糖凝胶电泳，结果见图6，用切胶纯化试剂盒（上海生工，SK8132）进行回收。0037将回收物用非酶连接试剂盒进行连接，连接体系EXNASE（VAZYME，C11201），2L；5EXNASE缓冲液（VAZYME,C11201），4L；PEXMBP单酶切产物10NG/L，10L；步骤的DISA的PCR产物（40NG/L），1L；DDH2O，3L。003837连接30MIN，然后冰上放置5MIN。0039取10L转化入大肠杆菌DH5感受态细胞中，将转化后细胞均匀涂在含氨苄青霉素（100G/ML。
30、）的LB培养平板上培养。挑取单个菌落于含2ML氨苄青霉素（100G/ML）的LB培养液中扩增培养，220RPM振荡条件下，37培养16H后提取质粒，用ECOR进行单酶切鉴定。0040酶切体系ECORFERMENTAS，FD0274，05L；10反应缓冲液FERMENTAS,FD0274，1L；扩增培养的PEXMBPDISA重组质粒表达载体（500NG/L，1L；DDH2O，8L；37酶切10MIN。0041所构建的PEXMBPDISA重组质粒表达载体结构示意图见图4，重组质粒表达载体酶切鉴定图谱见图7。0042将所构建的PEXMBPDISA重组质粒表达载体进一步转化表达DISA蛋白说明书CN1。
31、04293822A7/7页9为检验所构建的PEXMBPDISA重组质粒表达载体所制备的DISA蛋白的可溶性效果，发明人做了进一步的对比实验。以构建的PEXMBPDISA重组质粒表达载体和现有技术中的PET28DISA重组质粒表达载体分别转化进BL21感受态细胞。0043具体培养过程简介如下将PEXMBPDISA重组质粒表达载体转化细胞在涂覆有氨苄青霉素（100G/ML）的LB平板上进行培养过夜，挑取单个菌落进行过夜培养，按1100的体积比接种到50ML含有氨苄青霉素（100G/ML）的LB液体培养基中，30培养到OD6000608，加入1MOL/L丙酸钠溶液1ML，180RPM振荡条件下诱导过。
32、夜。4、10000RPM离心10MIN收菌。超声波破碎，功率160W，工作4S，间歇8S，共持续25MIN。0044将PET28DISA重组质粒表达载体转化细胞在卡那霉素（50G/ML）的LB平板上进行培养过夜，挑取单个菌落进行过夜培养，按1100的体积比接种到50ML含有卡那霉素（50G/ML）的LB液体培养基中，30培养到OD6000608，加入100MG/ML的IPTG溶液120L，180RPM振荡条件下诱导过夜。4、10000RPM离心10MIN收菌。超声波破碎，功率160W，工作4S，间歇8S，共持续25MIN。0045将上述超声波破碎后上清分别用BCA蛋白定量试剂盒北京鼎国昌盛生物。
33、技术公司，43B00150进行定量处理，结果如下表。重组质粒表达载体蛋白浓度（G/ML）对照PET28DISA468862本发明PEXMBPDISA5535740046配置12的SDSPAGE胶，每孔各加50G的蛋白上清液样品，进行WESTERNBLOTTING检测，结果见图8，将WESTERNBLOTTING结果进行灰度扫描分析（GELPROANALYZER4软件），结果如下表。重组质粒表达载体灰度值对照PET28DISA2525本发明PEXMBPDISA537830047从上表可以看出，重组质粒表达载体PEXMBPDISA所表达的蛋白的灰度值是现有的重组质粒表达载体PET28DISA所表达。
34、蛋白的213倍，即与现有的质粒PET28相比，本发明所提供的重组质粒PEXMBP用于表达DISA蛋白时，使表达蛋白的可溶度提高了113，因而具有较好的技术进步效果。说明书CN104293822A1/7页10SEQUENCELISTING河南农业大学一种用于DISA表达的PEXMBP重组质粒NONE1PATENTINVERSION3516729DNAPEXMBP重组质粒1GACGTCTTAATTACCCGACTGGTCTTTGGCACCAGCTTTTAAACGACGCCACAGAGTGGT60GCGGCTAATCCCCAGATAACGCGCCGCGGCGGTCTTATCGCCCTTAAAGCGC。
35、GCCAGTAC120ATCCTGTAACGCGTTCGCATCCACGGTTGAAGGCGTCAGTTCTGCTGTGTTCACCATAAG180CTCAGGTAATAACTGCCGCATAAATTGCCTGTCCAGCGTTGGCGCGGGATCGACGCTTAA240AAAAAGCGCCAGGCGCTCCATCATATTACGCAGTTCGCGTATATTACCGGGCCAGCGCCA300GGCCAGCAAAAGCGGCTGACACTGTGTCAATCCATGACGTATCGATTCGGTAAACGGAAT360TTCCATCGCCGCCAGCGACTGTTTTAAAAAGCTTTCC。
36、GCCAGCGGCAAAATATCAGCCTG420CCGCTCGCGCAAAGGAGGAAGCGTCAGACGCAGAATACTCAGGCGATAAAAGAGATCGGG480GCGAAAACGTCCTTGCATTATCTCCCGATCCAGATCGCAATGCGTAGCGCTGATCACCCG540GACATCCACCGGGATCGGCTGGTGTCCGCCGACGCGAGTGACGGCTTTTTCCTCCAGTAC600序列表CN104293822A102/7页11GCGCAAAAGTCGGGTTTGTAACGGCAAGGGCATTTCGCCGATTTCATCCAGAAACAGCGT66。
37、0GCCGCCGTGTGCGATTTCAAACAGCCCCGCCCGGCCTCCTCGTCGTGAACCGGTAAACGC720GCCCTCTTCATAACCAAACAGTTCCGCTTCCAGCAACGACTCGGTAATCGCGCCGCAATT780GACGGCGACAAAGGGAGGGGATGGCTTATTCTGACGGTGAGGCTGGCGGTGAAAGAACGT840CTGGTGAATCGCCTGCGCCGCCAGCTCTTTTCCGGTCCCTGTTTCCCCCTGAATCAGCAC900TGCCGCACGGGAGCGGGCATAGAGCGTAATCGTCTGGCGGAGCTGCT。
38、CCATTTGCGGCGA960CTGGCCGCGTATATCGCCCAGTTCATACCGGGTTTGTAATCCCTTGCCGGATGGGTAATC1020CACGCGCTGGCGCCGTGTCAGACGGGTCATATCCAGCGCATCATGAAAAGCCTGACGAAC1080GGTCGCCGCGGAATAAATAAAGATGGCGGTCATTCCTGCCTCTTCCGCCAGATCGGTAAT1140TAATCCCGCGCCGACGACGGCCTCAATACCGTTGGCCTTAAGTTCGTTAATTTGCCCGCG1200CGCGTCCTCTTCGGTGACATAGCTTCGC。
39、TGTTCAAGACGGAGGTGAAACGTTTTCTGAAA1260GGCAAGTAAAGCCGGAATGGTCTCCTGATAGGTCACGATACCGATAGACGAGGTGAGCTT1320TCCCGCTTTCGCCAGCGCCTGTAATACATCGAATCCGCTGGGCTTGATGAGGATCACCGG1380TATTGACAGGCGGCTTTTTAAATAGGCCCCATTCGAACCCGCCGCGATAATCGCGTCGCA1440GCGCTCGGTCGCCAGTTTTTTGCGAATGTAGGTCACCGCCTTTTCAAAGCCGAGTTGAAT1500AGGCGTGA。
40、TGGTCGCCAGATGATCAAATTCCAGGCTGATATCCCGAAACAGTTCGAACAG1560ACGCGTTACGGAGACCGTCCAGATCACCGGTTTATCGCTATTATCGCGCGGAGCGCTGTG1620GGCAGTCGTCATCGCAGTAGATTCATCTTTAAGGGGCGATTTTTTGTTTTAAACGTGTTT1680CATAAATGTTGCAATGAAACAGGGTGATTCGTTTCATGAAACGTTAGCTGACACGTTTTT1740TTTTCCCTTAATCGCGCTTATTCATAACAGAAATGACTGTAATTACCTGTTT。
41、TTAAATCT1800序列表CN104293822A113/7页12CATTGTATTTAATTTTCTCGCTGCCTCTTTGCCTGGCATAGCCTTTGCTTTGGTGAATAC1860ATCTTGAATAACAATTTACTAACATGGAATTCAAAAGATCTTTTAAGAAGGAGATATACA1920TATGAAATCTTCTCACCATCACCATCACCATGGTTCTTCTATGAAAATCGAAGAAGGTAA1980ACTGGTAATCTGGATTAACGGCGATAAAGGCTATAACGGTCTCGCTGAAGTCGGTAAGAA2040ATTCGAGAA。
42、AGATACCGGAATTAAAGTCACCGTTGAGCATCCGGATAAACTGGAAGAGAA2100ATTCCCACAGGTTGCGGCAACTGGCGATGGCCCTGACATTATCTTCTGGGCACACGACCG2160CTTTGGTGGCTACGCTCAATCTGGCCTGTTGGCTGAAATCACCCCGGACAAAGCGTTCCA2220GGACAAGCTGTATCCGTTTACCTGGGATGCCGTACGTTACAACGGCAAGCTGATTGCTTA2280CCCGATCGCTGTTGAAGCGTTATCGCTGATTTATAACAAAGATCTGCTGCCGA。
43、ACCCGCC2340AAAAACCTGGGAAGAGATCCCGGCGCTGGATAAAGAACTGAAAGCGAAAGGTAAGAGCGC2400GCTGATGTTCAACCTGCAAGAACCGTACTTCACCTGGCCGCTGATTGCTGCTGACGGGGG2460TTATGCGTTCAAGTATGAAAACGGCAAGTACGACATTAAAGACGTGGGCGTGGATAACGC2520TGGCGCGAAAGCGGGTCTGACCTTCCTGGTTGACCTGATTAAAAACAAACACATGAATGC2580AGACACCGATTACTCCATCGCAGAAGCTGCCTT。
44、TAATAAAGGCGAAACAGCGATGACCAT2640CAACGGCCCGTGGGCATGGTCCAACATCGACACCAGCAAAGTGAATTATGGTGTAACGGT2700ACTGCCGACCTTCAAGGGTCAACCATCCAAACCGTTCGTTGGCGTGCTGAGCGCAGGTAT2760TAACGCCGCCAGTCCGAACAAAGAGCTGGCAAAAGAGTTCCTCGAAAACTATCTGCTGAC2820TGATGAAGGTCTGGAAGCGGTTAATAAAGACAAACCGCTGGGTGCCGTAGCGCTGAAGTC2880TTACGAGGAAGAG。
45、TTGGCGAAAGATCCACGTATTGCCGCCACTATGGAAAACGCCCAGAA2940序列表CN104293822A124/7页13AGGTGAAATCATGCCGAACATCCCGCAGATGTCCGCTTTCTGGTATGCCGTGCGTACTGC3000GGTGATCAACGCCGCCAGCGGTCGTCAGACTGTCGATGAAGCCCTGAAAGACGCGCAGAC3060TAATGGGATCGAGGAAAACCTGTACTTCCAATCCAATGCAATGGTTGCTCCGGGTACCGC3120TCTGCGTGAAGGTCTGGACTCTGTTCTGCGTGCT。
46、AAAACCGGTGCTCTGATCGTTGTTGG3180TGACGCTCCGGAAGTTCTGCGTTTCGTTGAAGGTGGTTTCCACATCGACACCGAATTCAC3240CCCGGCTGGTCTGTACGAACTGGCTAAAATGGACGGTGCTATCGTTCTGTCTCGTGACGC3300TCGTCGTATCCTGTACGCTAACGCTCAGCTGATCCCGGACCCGTCTATCCCGTCTGAAGA3360AACCGGTATCCGTCACCGTACCGCTGAACGTTTCGCTCGTCAGACCGGTGCTCTGGTTAT3420CGCTATCTCTCAGC。
47、GTCGTGGTGTTATCACCCTGTACAAAGGTGCTGAACGTTACTCTCT3480GCAGGACATCTCTGTTATCCTGTCTAAAGCTAACCAGGCTGTTCAGACCCTGGAAAAATA3540CAAAGGTGTTCTGGACAAAGCTCTGATCAACCTGACCGCTCTGGAATTCGAAGACCTGGT3600TACCGTTTACGACGTTGCTCGTGTTGTTCAGCGTGGTGTTATGGTTCTGCAGGTTGTTAA3660AGAACTGGAAAACTACATCTGCGAACTGGGTACCGAAGGTCGTCTGATCACCATGCAG。
48、GT3720TGAAGAACTGCTGGCTAACGTTCGTGAAGAACTGTGCTGCGTTATCCGTGACTACCTGGA3780CGACGAAGGTAAAAACGCTGAAGACGTTCTGCGTGTTGTTTCTTCTTGGCCGCCGGACGA3840CCTGCTGGACCTGACCGGTATCTCTCGTATCCTGGGTTACGGTGCTTCTTCTTCTATCCT3900GGACCTGTCTGTTTACCCGCGTGGTTACCGTATCCTGCAGCGTATCCCGCGTCTGCCGGC3960TCAGATCGTTGAAAACCTGATCCGTACCTTCAAAAACC。
49、TGCAGAACATCCTGAAAGCTTC4020TATCGAAGAACTGGACGACGTTGAAGGTATCGGTGAAGTTCGTGCTAAAGCTATCAAAAA4080CGGTCTGCACCGTCTGCAGGAACAGGTTATGCTGGAACGTTACATGGGTTAATAACATTG4140序列表CN104293822A135/7页14GAAGTGGATAACGGATCCAAACTCGAGTAAGGATCTCCAGGCATCAAATAAAACGAAAGG4200CTCAGTCGAAAGACTGGGCCTTTCGTTTTATCTGTTGTTTGTCGGTGAACGCTCTCTACT4260AGAGTCACACTGGCTCACCTTCGGGTGGGCCTTTCTGCGTTTATACCTAGGCTACAGCCG4320ATAGTCTGGAACAGCGCACTTACGGGTTGCTGCGCAACCCAAGTGCTACCGGCGCGGCAG4380CGTGACCCGTGTCGGCGGCTCCAACGGCTCGC。