能生产活性重组藻胆蛋白的微生物及其制备方法 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌新菌株及其制备方法。
海洋是地球生命的摇篮。海洋生物富含各种生物活性物质。海洋中的光合生物蓝藻是早在35亿年前就出现在地球上的化石生物。由于这些化石生物的光合作用才形成了地球的含氧大气层，从而使地球上的各种生命得以繁荣发展，延续生存。
蓝藻进行光合作用的天线色素蛋白是藻胆蛋白。近年，国外有人用从天然蓝藻中提取的藻胆蛋白饲喂患有肝癌的大鼠，5周后，治疗组有90％活下来，而未治疗组只成活25％。8周后，治疗组有25％大鼠存活，而未治疗组大鼠全部死亡。试验说明蓝藻藻胆蛋白具有显著的抗癌作用，能够提高患癌生物的存活率。
现有的大量获取藻胆蛋白的技术，均是将天然蓝藻进行人工培养，然后从蓝藻中提取藻胆蛋白，再将所得产品进行纯化后，开发药物。
但是，海洋生物的资源量有限，采集、培养费用较高。而生物活性物质含量较少，提纯工艺复杂。因此通常从天然海洋生物中提取活性物质用作药物，难以做到质纯量足、价格低廉的要求。
蓝藻的生长，需要特殊的光温和培养基条件，因而培养成本很高。此外，提纯藻胆蛋白的工艺极为复杂，费用很高。如目前已实现大面积培养的螺旋藻价格也在100元人民币/公斤(食品级)以上，医药级的价格更高。国际市场上，用作医药的蓝藻藻胆蛋白的价格高达10万美元/克左右(Sigma公司)。因此，要开发蓝藻藻胆蛋白作为单体抗癌药物，利用现有的提取藻胆蛋白地方法，几乎是不可能的。
针对上述现有技术获取蓝藻藻胆蛋白所存在的问题和局限性，本发明的目的在于利用基因重组技术，将蓝藻藻胆蛋白基因与微生物(细菌)基因重新组合，使细菌大量廉价生产有活性的重组藻胆蛋白，利用一步纯化工艺获得大量单体，开发单体抗癌药物。
本发明通过从蓝藻中克隆藻胆蛋白基因，与大肠杆菌的麦芽糖结合蛋白(MBP)基因构成嵌合基因，在导入大肠杆菌后在Ptac启动子驱动下在大肠杆菌中获得(MBP+藻胆蛋白)融合蛋白的高效表达，得到能生产活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌菌株P1，该菌株已于96年4月17日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.0261，建议分类命名：Escherichiacoli。
上述菌株P1的重组藻胆蛋白经SDS-PAGE电泳得到约60KD条带，该蛋白无色，溶于水，在280nm处有一最大吸收峰，分子量约60KD，其基因核苷酸顺序及氨基酸顺序如下：
27 54ATG AAA ATA AAA ACA GGT GCA CGC ATC CTC GCA TTA TCC GCA TTA ACG ACG ATGMET Lys Ile Lys Thr Gly Ala Arg Ile Leu Ala Leu Ser Ala Leu Thr Thr MET
81 108ATG TTT TCC GCC TCG GCT CTC GCC AAA ATC GAA GAA GGT AAA CTG GTA ATC TGGMET Phe Ser Ala Ser Ala Leu Ala Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp
135 162ATT AAC GGC GAT AAA GGC TAT AAC GGT CTC GCT GAA GTC GGT AAG AAA TTC GAGIle Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe Glu
189 216AAA GAT ACC GGA ATT AAA GTC ACC GTT GAG CAT CCG GAT AAA CTG GAA GAG AAALys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu Glu Glu Lys
243 270TTC CCA CAG GTT GCG GCA ACT GGC GAT GGC CCT GAC ATT ATC TTC TGG GCA CACPhe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile Ile Phe Trp Ala His
297 324GAC CGC TTT GGT GGC TAC GCT CAA TCT GGC CTG TTG GCT GAA ATC ACC CCG GAC Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser G1y Leu Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp
351 378AAA GCG TTC CAG GAC AAG CTG TAT CCG TTT ACC TGG GAT GCC GTA CGT TAC AACLys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn
405 432GGC AAG CTG ATT GCT TAC CCG ATC GCT GTT GAA GCG TTA TCG CTG ATT TAT AACGly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn
459 486AAA GAT CTG CTG CCG AAC CCG CCA AAA ACC TGG GAA GAG ATC CCG GCG CTG GATLys Asp Leu Leu Pro Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp
513 540AAA GAA CTG AAA GCG AAA GGT AAG AGC GCG CTG ATG TTC AAC CTG CAA GAA CCGLys Glu Leu Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu MET Phe Asn Leu Gln Glu Pro
567 594TAC TTC ACC TGG CCG CTG ATT GCT GCT GAC GGG GGT TAT GCG TTC AAG TAT GAATyr Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr Glu
621 648AAC GGC AAG TAC GAC ATT AAA GAC GTG GGC GTG GAT AAC GCT GGC GCG AAA GCGAsn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly Ala Lys Ala
675 702GGT CTG ACC TTC CTG GTT GAC CTG ATT AAA AAC AAA CAC ATG AAT GCA GAC ACCGly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His MET Asn Ala Asp Thr
729 756GAT TAC TCC ATC GCA GAA GCT GCC TTT AAT AAA GGC GAA ACA GCG ATG ACC ATCAsp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys Gly Glu Thr Ala MET Thr Ile
783 810AAC GGC CCG TGG GCA TGG TCC AAC ATC GAC ACC AGC AAA GTG AAT TAT GGT GTAAsn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val
837 864ACG GTA CTG CCG ACC TTC AAG GGT CAA CCA TCC AAA CCG TTC GTT GGC GTG CTGThr Val Leu Pro Thr Phe Lys Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu
891 918AGC GCA GGT ATT AAC GCC GCC AGT CCG AAC AAA GAG CTG GCG AAA GAG TTC CTCSer Ala Gly Ile Asn Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu
945 972GAA AAC TAT CTG CTG ACT GAT GAA GGT CTG GAA GCG GTT AAT AAA GAC AAA CCGGlu Asn Tyr Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro
999 1026CTG GGT GCC GTA GCG CTG AAG TCT TAC GAG GAA GAG TTG GCG AAA GAT CCA CGTLeu Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro Arg
1053 1080ATT GCC GCC ACC ATG GAA AAC GCC CAG AAA GGT GAA ATC ATG CCG AAC ATC CCGIle Ala Ala Thr MET Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile MET Pro Asn Ile Pro
1107 1134CAG ATG TCC GCT TTC TGG TAT GCC GTG CGT ACT GCG GTG ATC AAC GCC GCC AGCGln MET Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val lle Asn Ala Ala Ser
1161 1188GGT CGT CAG ACT GTC GAT GAA GCC CTG AAA GAC GCG CAG ACT CGT TCG AGC TCGGly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp Ala Gln Thr Arg Ser Ser Ser
1215 1242AAC AAC AAC AAC AAT AAC AAT AAC AAC AAC CTC GGG ATC GAG GGA AGG ATT TCAAsn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Leu Gly Ile Glu Gly Arg Ile Ser
1269 1296GAA TTC TTG AGG GAT CCA TTA ATG AGT ATC GTC TCG AAG TCC ATC GTC AAC GCTGlu Phe Leu Arg Asp Pro Leu Met Ser Ile Val Ser Lys Ser Ile Val Asn Ala
1323 1350GAC GCC GAG GCG CGT TAC CTA AGC CCT GGC GAA CTG GAA CGC ATC AAA ACC TTCAsp Ala Glu Ala Arg Tyr Leu Ser Pro Gly Glu Leu Glu Arg Ile Lys Thr Phe
1377 1404GTT GTC GGT GGC GAT CGT CGT CTG CGG ATT GCG CAG ACC ATT GCT GAG TCC CGCVal Val Gly Gly Asp Arg Arg Leu Arg Ile Ala Gln Thr Ile Ala Glu Ser Arg
1431 1458GAG CGG ATC GTC AAG CAA GCT GGC AAC CAA CTT TTC CAA AAG CGT CCT GAC GTGGlu Arg Ile Val Lys Gln Ala Gly Asn Gln Leu Phe Gln Lys Arg Pro Asp Val
1485 1512GTT TCG CCC GGT GGC AAT GCC TAC GGT GAA GAC ATG ACG GCC ACC TGG CTG CGTVal Ser Pro Gly Gly Asn Ala Tyr Gly Glu Asp Met Thr Ala Thr Cys Leu Arg
1539 1566GAC CTC GAC TAC TAC CTG CGT CTT GTG ACC TAC GGT GTA GTT TCG GGC GAC ATCAsp Leu Asp Tyr Tyr Leu Arg Leu Val Thr Tyr Gly Val Val Ser Gly Asp Ile
1593 1620ACC CCG ATT GAA GAA ATC GGC ATT GTC GGT GTC CGC GAA ATG TAC AAA TCG CTAThr Pro Ile Glu Glu Ile Gly Ile Val Gly Val Arg Glu Met Tyr Lys Ser Leu
1647 1674GGA ACC CCC ATC GAA GCT GTC GCT GAA GGC GTC CGT GAG CTG AAA TCG GcT GCAGly Thr Pro Ile Glu Ala Val Ala Glu Gly Val Arg Alu Leu Lys Ser Ala Ala
1701 1728ACC GCC CTA CTG ACT GGT GGA GAC GCT GAC GAA GCA GGC GCT TAC TTT GAC TACThr Ala Leu Leu Thr Gly Glu Asp Ala Asp Glu Ala Gly Ala Tyr Phe Asp Tyr
1749GTA ATT GGC GCT CTC AGC TAAVal Ile Gly Ala Leu Ser
本发明的大肠杆菌P1菌株是通过如下基因工程方法得到的。
使用美国New England Biolabs蛋白融合及表达系统试剂盒，将利用PCR(多聚酶链式反应)技术从蓝藻中克隆的藻胆蛋白的基因(apc)接到pMAL-p2载体MBP基因下游多克隆位点中，进行基因重组，与MBP基因(malE)构成嵌合基因，并转化大肠杆菌，经筛选得到能在Ptac启动子驱动下高效表达活性重组藻胆蛋白的大肠杆菌菌株P1。
然后将所得P1菌株用普通细菌培养基LB于37℃下振荡培养，当OD600＝0.5时加入TPTG至终度为0.3mM再振荡3小时，得到重组藻胆蛋白的大量生产。经离心收集菌体，超声波破碎和MBP亲和柱层析一步纯化工艺制得纯品。
本发明的大肠杆菌菌株P1生产得到的重组藻胆蛋白纯品，每克蛋白成本约5000人民币，大大低于国际市场价格。大规模发醇生产后成本可进一步降低。从而使藻胆蛋白实际用作药物成为可能。
由本发明大肠杆菌菌株P1生产得到的重组藻胆蛋白，经试验具有延长患癌小鼠生命、抑制肿瘤、增强白细胞系统功能、增强腹腔巨噬细胞系统功能活性，并且对动物机体没有毒性。
下面的实施例将进一步说明本发明及本发明产物的效果。
实施例1利用PCR技术从蓝藻中克隆藻胆蛋白基因(apc)
1)模板DNA的提取
100ml组囊藻Anacystisnidulans UTEX 625培养液经3,000r/m离心，收集藻体。藻体用250mMTris-HCl，50mM EDTA，25％蔗糖(pH8.0)悬浮，加入溶菌酶至终度为15mg/ml，在37℃保温1小时，然后加入蛋白酶K至5mg/ml，在65℃保温30分钟。用等体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)提取两遍，水相再用氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一遍，最后水相用二倍体积的乙醇于-20℃沉淀过夜。再经13,000r/m，4℃离心30分钟，沉淀抽干后悬浮于TE缓冲液(10mMTris-HCl，1mMEDTA，pH8.0)并加入RNA酶A于37℃保温30分钟。
2)PCR引物及反应
根据Houmard等1986年发表在Molecular and General Genetics205卷404-410页上的组囊藻Synechococcus PCC 6301的藻胆蛋白基因apc的序列设计引物。正向引物为5′-GAGGGATCCATTAATGAGTATCG-3′，反向引物为：5′-TGGAAGCTTAGCTCAAGCCGGAG-3′。采用华美生物工程公司DNA扩增系统C试剂盒，于93℃变性1分钟，50℃复性1分钟，72℃延伸3分钟，重复35个循环。结果用1％琼脂糖电泳鉴定，可见扩增出一条约1040bp的条带。
3)apc的克隆与测序
1040bp的扩增条带从琼脂糖胶上回收后，按美国Invitrogen公司TA克隆试剂盒手册要求，与PCRII载体连接，转化OneShot感受态细菌，经筛选获得若干阳性克隆。用BamHI和PstI双切，可将apc切成一个650bp的大片段和一个390bp的小片段，将这两个片段亚克隆进BamHI和PstI双切的pB-luescript II SK(+)载体中，按Sanger法进行测序。apc基因全序列包含于上述说明中。
实施例2(MBP+藻胆蛋白)融合蛋白的构建以及在大肠杆菌中的高效表达
将apc用EcoRI从PCRII载体中切下，按美国New EnglandBiolabs蛋白融合及表达系统试剂盒要求，接到pMAL-p2载体MBP基因下游EcoRI位点中，并转化大肠杆菌DH52，经筛选约在1000个菌落中找到一个apc方向正确，读码框也正确的阳性菌落P1。按种于LB培养基中，在37℃振荡培养，OD600＝0.5时加入IPTG至终浓度＝0.3mM，再振荡3小时。按试剂盒手册要求，离心收集菌体，超声波破碎，MBP亲和柱层析一步纯化。经SDS-PAGE电泳得到约60KD-条带。每升菌液约能得到(MBP+藻胆蛋白)重组蛋白纯品35mg。
实施例3.重组蛋白的生物活性试验
重组蛋白以艾氏腹水癌(EAC)为模型进行抑瘤试验
1)EAC模型：
选取24只体重为18-22克的健康昆明种小白鼠，腹腔注射EAC细胞悬浮液，每只动物注射0.21ml(＞2500万/ml)，接种后随机分为阳性对照组、阴性对照组和治疗组。
2)EAC实体型：
选取24只体重为18-22克的健康昆明种小白鼠，皮下注射EAC细胞悬浮液，每只动物注射0.2ml(＞2500万/ml)，皮下接种部位为右前侧腋窝部。接种后随机分为阳性对照组，阴性对照组和治疗组。
3)给药方法：
于接种癌细胞24小时后开始作腹腔或皮下注射，每日一次，连续给药8次，治疗组注射重组藻胆蛋白，剂量14mg/kg/天，阳性对照组注射提纯藻胆蛋白，剂量165mg/kg/天，阴性对照组注射等体积生理盐水。
4)效果：采用皮下注射8天后，治疗组抑瘤率为59.25％(P＜0.05)，阳性对照组抑瘤率为18.51％(P＞0.05)，说明重组藻胆蛋白具有显著的抑瘤活性。
另外采用腹腔注射8天后，治疗组生命延长率为66.67％(P＜0.05)，阳性对照组生命延长率为33.3％(P＞0.05)，说明重组藻胆蛋白具有显著的延长患癌小鼠生命的作用。
上述重组蛋白经口染毒，各染毒组小鼠无一死亡，LD50＞5000mg/kg，根据毒性分级属基本无毒。
另外采用腹腔注射的方法，各组剂量同上，8天后治疗组外周血的白细胞总数高于阴性对照组，外周血的淋巴细胞百分率也高于阴性对照组，且治疗组较阳性对照组增高明显，提示重组蛋白对荷瘤动物白细胞系统有一定的促进作用。
采用皮下注射的方法，各组剂量同上，8天后治疗组腹腔巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数均高于阴性对照组(P＜0.05)提示重组蛋白对荷瘤动物腹腔巨噬细胞的功能有明显的促进作用。阳性对照组效果不显著(P＞0.05)。