酪氨酸酶衍生的分离肽及其应用 相关申请
本申请是1994年2月28日申请的系列号NO.08/203,054(该申请是1993年6月23日申请的在审申请系列号NO.08/081,673的部分继续申请)的部分继续申请，而NO.08/081,673申请又是在审美国专利申请系列号054714(1994年4月28日申请)的部分继续申请，054714号申请是1992年12月22日申请的在审美国专利申请系列号994,928的部分继续申请。
【发明领域】
本发明涉及衍生自酪氨酸酶的分离肽及其应用，所说肽是由HLA-A2和HLA-B44分子呈递的。另外，本发明涉及鉴别被诊断患有细胞异常状态的个体之能力，其中细胞异常状态的异常细胞呈递这些肽和HLA-A2和HLA-B44的复合物，还涉及呈递的肽及其衍生物。
背景和现有技术
哺乳动物免疫系统识别外源和外来材料并发生反应的过程是一个复杂的过程，该系统的一个重要的方面是T细胞应答。这种应答要求T细胞识别称作为人白细胞抗原(“HLA”)或者主要组织相容性复合物(“HMCs”)的细胞表面分子和肽形成的复合物并与之发生作用。这些肽来源于被也能呈递HLA/MHC分子的细胞加工的较大分子。参见例如Male et al.，Advanced Immunology(J.P.Lipincott Company，1987)，特别是第6-10章。由于要求T细胞特异于HLA分子和一种肽的特定结合，所以T细胞和HLA/肽的复合物的相互作用受到限制。如果不存在特定地T细胞，即使存在其配体复合物也没有T细胞应答。同样，如果没有特定的复合物但存在T细胞，也不发生应答。其机理涉及免疫系统的外来材料的应答，自身免疫病理学，和对细胞异常的应答。最近，更多的研究集中于将蛋白质加工为HLA结合肽的原理，在这方面，参见Barinaga，Science 257：880(1992)；Fremont el al.，Science 257：919(1992)：Matsumura et al.，Science 257：927(1992)；Latron et al.，Science 257：964(1992)。
在癌症中也涉及T细胞识别细胞异常的机理，例如PCT申请PCT/US92/04354，1992年5月22申请，1992年11月26日公开，作为本文的参考，其中公开了一个基因族，它被加工为肽，该肽依次在细胞表面表达，从而导致由特异性CTLs裂解肿瘤细胞。据说这些基因编码“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，并且将由此产生的肽称作为“肿瘤排斥抗原”或“TRAs”。有关该基因族的其它信息参见Traversari etal.，Immunogenetics 35：145(1992；vander Bruggen et al.，Science 254：1643(1991)。
在美国专利申请系列号938,334(作为本文的参考)中，公开了与HLA-A1分子结合的九肽。该参考文献告诉我们，如果已知特定肽与特定HLA分子的特异性，应该可以预期该特定肽与一种HLA分子结合，但不与另一种结合。这是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。因此尽管对作为特定的HLA分子的配体的特定肽的鉴别具有诊断和治疗意义，但他们仅与有特定HLA分子表型的个体相关。在该领域内还需要作进一步的研究，因为细胞异常状态并不局限于一个特定的HLA表型，进行有目的治疗需要一些已经公开的异常细胞表型知识。
酪氨酸酶催化将酪氨酸转化为脱羟基苯基丙氨酸或者“DOPA”的反应并且显示选择性的在黑素细胞上表达(Muller el al.，EMBOJ7：2715(1988))，在Kwon，U.S.Patent NO.4,898,814最早报道有关人的该酶的cDNA。由Bouchardet al.，J.Exp.Med.169：2029(1989)的最近报道提供了稍微有差异的序列。对于鉴别该酶的抑制剂已经花费了大量的精力，因为它与色素沉着疾病有关。该文献的一些例子包括Jinbow，wo9116302；Mishima et al.，U.S.Patent NO.5，077,059，和Nazzaropor，U.S.Patent No.4,818,768，技术人员对其它公开类似物质的文献是熟知的。
美国专利申请08/081,673(1993年6月23日申请，作为参考文献)公开了可以将酪氨酸以类似于外源抗原或TRAP分子的方式处理，即，发现对于特定的细胞异常状态，例如黑素瘤，在异常细胞中酪氨酸酶被加工并且由此产生的一种肽与HLA分子形成一种复合物。发现这些复合物可被胞溶性T细胞(“CTLs”)识别，裂解此异常细胞。对这种令人惊奇的和出入意料的现象的细节已进行了讨论。目前已经发现另外的肽也可作为由HLA/AR分子呈递的肿瘤排斥抗原。这些内容在申请号NO.08/203,054,1994年2月28日申请的申请中描述，该申请作为本文参考文献。
目前已经发现来源于酪氨酸酶的另外的肽是肿瘤排斥抗原，他们是由MHC分子HLA/B44呈递的，并且被胞溶性T细胞溶解。
附图简述
图1集合性的描述了细胞溶解研究结果，具体是：
图1A显示细胞系LB24/MEL的裂解；
图1B显示细胞系SK29/MEL的裂解；
图1C显示细胞系LB4/MEL的裂解；
图1D显示细胞系SK23/MEL的裂解；
图1E显示细胞系LE516/MEL的裂解；
图1F显示细胞系SK29/MEL.1.22的裂解；该细胞系已经失去了HLA-A2表达能力；
图1G显示MZ2-MEL失去溶解能力；
图1H显示对NK靶K562进行研究的溶解情况；
图1I显示在用编码HLA-A2的基因转染之后，图1F变异体失去溶解能力；
图1J显示来自患者SK29的自体EBV转化的B细胞的溶解情况。
图2显示对CTL IVSB的TNF释放情况进行的研究。
图3描述了CTL 210/9的TNF释放情况的研究。
图4描述肽YMNGTMSQV被胞溶性T细胞克隆CTL-IVSB识别但不被胞溶性T细胞克隆CTL2/9识别。
图5显示肽YMNGTMSQV不被胞溶性T细胞克隆CTL 210/9识别。
图6显示在各种细胞，包括那些在其表面呈递HLA-B44的细胞进行的TNF释放试验的结果。
图7集合性的显示利用本申请中描述的肽在三个不同细胞系上进行的一系列铬释放试验。
图7A显示使用SEQ ID No：4肽进行的试验。
图7B显示使用SEQ ID No：5肽的结果。
图7C显示使用SEQ ID No：2肽进行的试验获得的结果。
在图7中，利用标记“○”表示细胞系T2，用“□”表示不能呈递HLA-A2的MZ2-MEL，以及用“●”表示已经被转染能呈递HLA-A2的MZ2-MEL。实施例12描述了这些检测试验。
图8A和8B显示利用能呈递MHC分子HLA-B44的细胞系和胞溶性T细胞克隆22/31(下文中称为“CTL22/31”)进行的研究。在图8A中，用单克隆抗体W6/32预培养细胞系(“Rosi EBV”)，而图8B中没有进行预培养。
优选实施例的详细描述实施例1
在下面的试验中使用黑素瘤细胞系SK 29-MEL(在文献中也称作为SK MEL-29)和LB24-MEL，这两种细胞系已经被研究者使用了许多年。
从患者SK29(AV)和LB2(这些患者也分别是SK MEL-29和LB24-MEL的来源)获得含有单核血细胞的样品。将黑素瘤细胞系与含有单核血细胞的样品接触。观察该混合物中黑素瘤细胞系的溶解情况，这种溶解作用表明在样品中存在特异于由黑素瘤细胞呈递的肽和HLA分子的复合物的胞溶性T细胞(“CTLs”)。
所使用的溶解试验是由Herin et al.，Int.J.Cancer 39：390-396(1987)，作为本文参考文献，呈递的铬释放试验。但是下文中描述了该检测法，体外培养靶黑素瘤细胞，然后以107细胞/ml的浓度重悬于补充了10mM HEPES和30％FCS的DMEM中，并在37℃用200μCi/ml的Na(51Cr)O4培养45分钟。被标记的细胞用补充了10mM HEPES的DMEM洗涤3次。然后重悬于补充了10mM HEPES和30％FCS的DMEM中，之后将含有103细胞的100μl的样品分布到96孔微滴板。在100μl的相同培养基中加入PBLs样品，设置两个相同的试验组。将平板以100g离心4分钟，在37℃，5.5％CO2中培养4小时。
将平板再次离心，收集100μl的上清液并且计数。按下列公式计算51Cr的释放百分数：
51Cr的释放百分数＝(ER－SR)/(MR－SR)×100其中ER是观察到的试验51Cr的释放量，SR是通过将103标记细胞在200μl的培养基中单独培养检测到的自发释放量，MR是通过向靶细胞中加入100μl0.3％Triton X-100获得的最大释放量。
通过有限稀释将显示强CTL活性的单核血样品扩增和克隆，利用相同的方法进行再次筛选。
用相同的方法检测靶K562细胞。如果使用EBV转化的B细胞(EBV-B细胞)，唯一的变化是用补充了5％的Hank’s培养基替代DMEM培养基。
利用这些试验可从患者SK29(AV)中分离出CTL克隆“IVSB”以及从患者LB24分离出CTL克隆210/9。
在图1A，B，G和I中提供了试验结果，具体地说，可以看到两种CTLs可以裂解两种黑素瘤细胞系，K562和EBVB细胞系没有发生溶解。实施例2
对所描述的CTLs抗其它黑素瘤细胞系的能力进行检测，以确定这些靶是否是其它黑素瘤细胞系共有的。对于LB4.MEL，SK23.MEL(也称为SKMEL-23)和LE516.MEL按实施例1中描述的溶解试验进行研究。图1C，D和E组显示克隆溶解这些细胞系。
已知所检测的细胞系是HLA-A2型，结果暗示CTLs特异于肽和HLA-A2形成的复合物，通过对失去了HLA-A2表达能力的SK29-MEL变异体进行检测可以证明这种暗示。图1F组显示这些结果，没有克隆能溶解失去HLA的变异体。然而，当用SK29-MEL的HLA-A2基因转染变异体，而且重新检测时，观察到溶解。因此可以总结出呈递的分子是HLA-A2。实施例3
一旦鉴别出呈递的HLA分子，就可完成鉴别该分子的研究，下文中称该分子为“肿瘤排斥抗原前体”或“TRAP”分子，该分子是所呈递的肽的来源。
为此，从细胞系SK29-MEL.1中分离总RNA，该细胞是SK29-MEL的亚克隆。利用寡聚-dT结合试剂盒，和熟知的技术分离该RNA。一旦获得总RNA，再用标准方法将其转录为cDNA。然后根据制造商说明，将该cDNA连接到EcoRI衔接头上并克隆到pcDNA-I/Amp质粒的EcoRI位点。然后将重组质粒电穿孔到大肠杆菌JM101(电穿孔条件：在25μfarads，2500v1个脉冲)。
用氨苄青霉素(50μg/ml)选择被转染的细菌，然后划分到各200个克隆的700个集合中，每个集合代表约100个不同cDNA，如分析结果所示约50％质粒含有一个插入片段。使每个集合扩增到饱和，根据Maniatis等人在Molecular Cloning：ALaboratory Manual(Cold Spring Harbor，N.Y.，1992)描述的碱裂解，乙酸钾沉淀和酚提取法分离质粒DNA。不使用铯梯度离心。实施例4
然后将经扩增的质粒转染到真核细胞中。以15,000个细胞/孔的浓度将COS-7细胞样品接种到含有添加了10％胎牛血清的Dulbeco’s改良的Eagles培养基(“DMEM”)的组织培养平底微孔中。在37℃将细胞培养过夜，除去培养基，然后用30μl/孔的DMEM培养基替代，所述DMEM培养基含有10％Nu血清，400μg/ml DEAE-葡聚糖，100μM氯喹，100ng质粒pcDNA-I/Amp-A2和100ng的上文中描述的一个集合中的cDNA文库DNA。质粒pcDNA-I/Amp-A2含有来自SK29-MEL的HLA-A2基因。在37℃培养4小时之后，除去培养基，并用含有10％DMSO的PBS 50μl替代。2分钟后除去该培养基，并用补充了10％FCS的200μl的DMEM替代。
在培养基进行这种变更之后，将COS细胞在37℃培养48小时。然后滗去培养基，并将上面描述的CTL克隆各200个细胞加入到100μl的Iscove培养基中，该培养基含有10％库存人血清。如果使用克隆210/9，则使用补充了25U/ml IL-2的培养基。24小时之后，除去上清液，然后按Traversaro et al.，Immunogenetics35：145-152(1992)的描述，在WEHI细胞进行检测以确定TNF的含量，所述文献引入本文作参考。
用IVSB检测700个孔，696个显示1ml中含有0.6至4pg之间的TNF，其余的四个孔含有10和20pg/ml之间的TNF。用CTL210/9检测的同源孔显示相似的，明显更高的值。图2和3呈递了这些资料。实施例5
进一步的实验中对鉴别为高生产者的四个集合中的三个(编号“123”，“181”和“384”)进行选择。具体地说，将细菌克隆，并且对于每个集合对570细菌进行检测。从其中提取质粒DNA，并以类似于上文中的方式转染到COS细胞的一个新样品中，再次检测细胞对CTL210/9和CTLIVSB的刺激作用。在123号集合中发现阳性克隆(“p123.B2”)，并在384号集合中发现一个阳性克隆(“p384.C6”)。通过实施用cDNA和HLA-A2基因转染的COS细胞和仅用HLA-A2转染的COS细胞进行的比较试验获得了由CTLs识别的转染细胞的可信证据。通过在WEHI细胞中检测而测出CTL上清液中TNF释放量。利用MTT检测存活的WEHI细胞的光密度值。结果列于表1中。
表1
cDNA(123.B2) 没有cDNA+试验1 0.087 0.502试验2 0.108 0.562
对于cDNA和HLA-A其WEHI OD的值相当于24Pg/ml，而对于对照相应值为2.3Pg/ml。
从阳性克隆中提取出质粒，并按本领域已知技术进行测序。序列研究结果显示该质粒插入物几乎相同于酪氨酸酶的cDNA，如由Bouchard etal.，J.Exp.Med.169：2029(1989)描述，引入本文作参考。因此，一种天然存在的分子(即酪氨酸酶)具有肿瘤排斥抗原前体的作用并可被加工形成一种肿瘤排斥抗原，该抗原存在于细胞的表面，并与HLA-A2形成一种复合物，从而刺激CTL克隆的溶解。被鉴别分子的核酸序列显示于SEQ ID NO：1中。实施例6
由Chomez et al.，Immunogenetics 35：241(1992)报道的以前的工作已经证明含有编码一个抗原肽的序列的小基因片段导致该肽的表达。该项研究(其全文引入本文作参考)表明对上文中描述的和SEQ ID NO：1中描述的人酪氨酸酶cDNA的小部分序列进行了克隆。利用实施例1-5中描述的方法，将该cDNA的各个片段和编码HLA-A2的基因一起共转染到COS-7细胞中，并检测TNF的释放量。这些试验可对约400个碱基对片段进行检测，当在其转染试验中使用时，该片段可促进TNF从上文中讨论的胞溶性T细胞克隆CTL IVSB中释放，显示出对呈递HLA-A2的细胞具有特异性。所使用的400个碱基片段对应于SEQ ID NO：1的碱基711-1152。从该片段密码子推导出氨基酸序列，然后将该序列与由Hunt等人，Science 255：1261(1992)，和Falk等人，Nature 351：290(1991)提供的资料进行比较，两篇文献引入本文作为参考。这种参考文献讨论了呈递HLA-A2的肽的一致序列。具体地说，Hunt讨论了九肽，其中在第二位上总发现Leu或Ile，Leu是“占优势的残基”。所描述的第9个残基是具有脂肪族烃侧链的一个残基，Val是该位置上占优势的残基。Hunt讨论了第二位为Leu时的强信号，以及为Met时的中等强度信号，在第6位为Val，Len，Ile或Thr之一，第9位为Val或Leu，具有Val时是特别强的。基于比较结果，合成九肽，然后检测其对呈递HLA-A2的细胞是否敏感。为此，使用丧失酪氨酸酶的变异细胞系SK29-MEL1.218和T202LB。将需检测的不同浓度的肽与胞溶性T细胞克隆CTL IVSB或胞溶性T细胞克隆CTL2/9一起加入到细胞系中。上文中讨论的以前的研究工作已经确定前一克隆裂解呈递HLA-A2的表达酪氨酸酶细胞，后一克隆没有此作用。
在37℃，含有51Cr的溶液中，用或不用抗HLA-A2抗体MA2.1培养失去酪氨酸酶的变异体一小时，所述抗体使游离HLA-A2分子变得稳定。在该试验中，将细胞洗四次，然后用浓度从100μM降到0.01μM的不同稀释度的肽进行保温。30分钟之后，以E/T比例为40/1的浓度加入效应细胞，四个小时之后，收集100λ上清液，并检测放射活性。
图4显示由九肽Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val(SEQ ID NO：2)获得的结果。
下文中称作为SEQ ID NO：2的该肽相应于列于SEQ ID NO：1中的酪氨酸酶的cDNA序列的第1129-1155残基。由CTL克隆IVSB识别出HLA-A2和该肽的复合物。
在一个平行试验中，已经证明来自于LB24患者的CTL克隆CTL210/9并不识别HLA-A2和SEQ ID NO：2的肽形成的复合物，虽然它识别HLA-A2和酪氨酸酶衍生的肽形成的复合物。因此，将酪氨酸酶加工为至少一种其他的肽，如果由HLA-A2分子呈递该肽，则可被CTL克隆识别。实施例7
在下面实验中，使用不是编码SEQ ID NO：2肽的第二个基因片段，该片段起始于SEQ ID NO：1的第一位碱基并结束于1101位碱基(即EcoRI-SphI片段)。按上文中描述的方式对胞溶性T细胞克隆CTL210/9(上文中讨论)抗转染了该片段的COS-7细胞的抗性进行检测。也对CTL IVSB进行检测。这些结果显示LB24-CTL210/9识别用该片段转染的表达HLA-A2的细胞的表面上的抗原，但CTL IVSB并不识别。因此，第二个肿瘤排斥抗原肽来源于酪氨酸酶。 实施例8
为了进一步定义由LB24-CTL210/9识别的肿瘤排斥抗原，完成下列实验。
将对应于SEQ ID NO：1的碱基451-1158的第二个片段与编码HLA-A2的基因一起转染到COS细胞中，并对TNF释放进行检测。该序列可刺激TNF从克隆SK29-CTL IVSB(20pg/ml)中释放，但不能刺激从LB24-CTL210/9(3.8pg/ml)释放。这些结果证实两个CTL克隆识别不同的肽，并且由LB24-CTL210/识别的肽是由1-451区编码。实施例9
对由cDNA片段1-451编码的酪氨酸酶衍生的肽进行分析，分析其中已知与HLA-A2结合的共有序列。合成对应于这些共有序列的肽，并检测其使呈递HLA-A2的细胞致敏的能力。为此，使用两个酪氨酸酶阴性黑素瘤细胞系(即，NA8-MEL和MZ2-MEL2.2，已用HLA-A2转染)，以及细胞系T2，如由Salter等人，Immunogenetics 21：235-246(1985)描述的细胞系T2。
用51Cr，和特异于HLA-A2的单克隆抗体MA.2，1，于37℃将细胞培养50分钟，随后进行洗涤(参见Bodmer et al.，Nature 342：443-446(1989)，引入本文作参考)。将靶细胞用不同浓度的肽，和用LB24-CTL克隆210/5或210/9进行培养，培养4小时之后检测铬释放百分数。
发现肽Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu(SEQ ID NO：3)是具活性的。
在此概述的其他实验中，前面已证明可识别YMNGTMSQV的CTL-
结果概述于下列表2-4中：
表2
肽
YMNGTMSQV MLLAVLYCLL
(1120-1155) (25-54) SK29-CTL-IVSB + - LB24-CTL-210/5 - + LB24-CTL-210/9 - +
表3
由LB24-CTL210/5和210/9和SK29-CTL IVSB介导的由酪氨酸酶肽致敏的MZ2-2.2-A2的3/93裂解效应细胞 肽 剂量 MZ2.2.2-A2抗-A2*LB24-CTL MLLAVLYCLL 10μM 18210/5 (LAUS17-5) 3 17(44∶1) 1 16
YMNGTMSQV 30M 1
(MAINZ) 10 1
3 1LB24-CTL MLLAVLYCLL 10μM 18210/9 (LAUS17-5) 3 17(30∶1) 1 15
YMNGTMSQV 30M 1
(MAINZ) 10 1
3 1SK29-CTL MLLAVLYCLL 10μM 1IVSB (LAUS17-5) 3 1(40∶1) 1 1
YMNGTMSQV 30μM 68
(MAINZ) 10 68
3 62
*靶细胞用Cr51和单抗MA2.1(抗-HLA-A2)培养50分钟，然后洗3次。
它们用各种不同浓度的肽培养30分钟。
按所指定(E∶T)比例加入CTL细胞。
培养4小时之后检测特定的Cr51释放百分数。
表4
由LB24-CTL210/5和210/9或SK29-CTL IVSB识别的酪氨酸酶肽的检测
(Cr51特异性释放的百分数)效应细胞 肽 剂量 NA8-MEL* MZ2-2.2∶A2 T2LB24-CTL. MLLAVLYCLL 10μM 30 31 36210/5 (LAUS 17-5) 3 23 27 35
1 17 20 26(41∶1) 300nM 6 17 16
100 2 8 5
30 3 5 2
0 0 0 0LB24-CTL. MLLAVLYCLL 10μM 14 19 21210/9 (LAUS 17-5) 3 13 17 20
1 9 14 13(26∶1) 300nM 3 9 5
100 1 1 1
30 0 1 0
0 0 1 0SK29-CTL. YMNGTMSQV 10μM 30 31 36IVSB (MAINZ) 3 38 44 52
1 27 40 46(42∶1) 300nM 14 22 34
100 3 13 21
30 1 9 10
10 1 3 3
3 0 3 4
1 0 1 0
0 0 4 0特异性释放 339 259 198最大释放 2694 1693 1206％ 11 13 14实施例10
利用CTL克隆22/31完成其他实验。前面已经证明该克隆可溶解自体黑素瘤细胞系MZ2-MEL中的亚细胞系MZ2-MEL.43，但不溶解其他亚细胞系，例如MZ2-MEL3.0和MZ2-MEL61.2，也不溶解自体EBV转化的B细胞，或者杀伤细胞系K562(参见Van den Eynde et al.，Int.J.Cancer 44：634-640(1989)。由MZ2-MEL.43呈递的抗原称作为抗原C。
在包括本申请的母申请中报道的研究工作中，发现酪氨酸酶基因编码一种由大多数表达HLA-A2黑素瘤的自体CTLs识别的一种抗原。通过PCR扩增可检测细胞MZ2-MEL的亚系中该基因的表达。发现MZ2-MEL.43克隆是阳性的，而其他MZ2-MEL克隆，例如MZ2-MEL.3.0是阴性。酪氨酸酶基因的表达与抗原MZ2-C的相关性表明MZ2-C可能是一种肿瘤排斥抗原，它来源于酪氨酸酶，并且是被由MZ2-MEL表达的HLA分子呈递的。该细胞系并不表达HLA-A2，这表明如果所呈递的酪氨酸酶衍生的肽一种TRA，则涉及第二种HLA分子。
进行鉴别那一种HLA分子给CTL22/31呈递了抗原C的研究。为此，从MZ2-MEL.43cDNA文库中分离已知位于细胞表面上的HLA分子的cDNA克隆即HLA-A29，HLA-B37，HLA-B44.02和HLA-C克隆10，然后克隆到表达载体pcDNAI/Amp.中。然后用这些构建体之一或含有HLA-A1，以及编码酪氨酸酶(SEQ ID NO：1)的cDNA的构建体转染受体COS7细胞。共转染按上文中列出的方法进行。一天之后加入CTL22/31，并且24小时之后，通过按照Traversari等人(见上文)的方法用对WEHI-164-13的胞溶性的检测结果确定TNF释放。图6显示仅在由HLA-B44和酪氨酸酶转染的细胞存在的条件下由CTL 22/31释放TNF。由此得出结论HLA-B44呈递了酪氨酸酶衍生的肿瘤排斥抗源。实施例11
上文中描述的实验特别显示了十聚体MLLAVLYCLL有效地诱导呈递HLA-A2细胞的溶解。已公认MHC分子呈递九肽。为此，完成对两个九聚体进行检测的试验，其中实验是以得到阳性结果的十肽为基础的。具体地说，删除了第一或第十个氨基酸以制备两个肽，即Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
(SEQID NO：4)Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu
(SEQ ID NO：5)
按照前面实施例中给出的对浓度为10μM-1nM范围内的十肽进行检测的方法对这些肽进行检测。使用三个现存细胞，概述于下列表5中，“T2”是一种突变的人细胞系，“CEMX721.174T2”由Salter，Immunogenetics 21：235(1985)描述，该细胞系呈递HLA-A2，“G2.2”是细胞系MZ2-MEL变异体，已用编码HLA-A2的基因转染该变异体。缩写“G2.2.5”代表了一种并不表达HLA-A2的变异体。在与胞溶性T细胞克隆接触之前将所有细胞与单克隆抗体MA2.1一起培养。该步骤使所谓“自由”MHC分子稳定，尽管其出现的机理并不是熟知的，并利用了效应细胞CTLs 210/5和210/9。结果列于下文表5中，结果显示在10μM浓度时，与CTL克隆210/5一起使用时SEQID NO：4的九聚体效率为2倍，但用210/9克隆时其效率高4倍，而SEQ ID NO：5的九聚体在诱导裂解方面是无效的。实施例12
在进一步的实验中，利用肽SEQ ID NO：4和5，以及SEQ ID NO：2完成铬释放试验。靶细胞是先前已用HLA-A2转染的异体黑素瘤细胞即MZ2-ME L和呈递HLA-A2的、但具有抗原加工缺陷而导致呈递外源肽能力增加的细胞系T2(Cerundolo et al.Nature 345-449(1990))。所有细胞用单克隆抗体MA2.1预滴定50分钟。用各种浓度的肽培养细胞30分钟，然后，以效应细胞：靶细胞的比例为60加入CTL克隆210/9和ISVB之一。按上文中描述的方法，四小时之后测量释放的铬。
结果列于图7，即图7A-7C中。SEQ ID NO：4肽使细胞对CTL210/9致敏，而DEQ ID NO：5不能。在前面实施例中已注意到SEQ ID NO：6使细胞对CTL IVSB致敏。
表5
表5(续)
表5(续)实施例13
然后完成紧接着实施例10中列出的实验之后的研究，以便对由HLA-B44呈递的抗原肽进行定义。为此，将对应于酪氨酸酶cDNA序列的片段的cDNA序列与编码HLA-B44的基因一起共转染到COS-7细胞中。基本上按上文实施例6中描述的方案实施。使用上文中讨论的胞溶性T细胞克隆22/31确定TNF释放量。两个片段，即碱基片段1-611和427-1134诱导TNF释放，该结果表明所呈递的肽是位于重叠区。根据该结果，对更短的片段进行检测。从385位，442位，514位和574位起始的片段也能诱导TNF的释放，而从579和585位起始的片段却不能。这些结果又暗示按照标准方法合成的13个氨基酸的肽起始于第574位。
然后将该肽用于试验中以确定其是否被CTL22/31诱导溶解，下文表6显示13聚体提供了两个EBV转染的细胞系，它们表达对溶解敏感的HLA-B44。
表610F94类型 13聚体 sur EBV-1 1 2 3 4 效应细胞 肽13A.A的剂量 Ros1-EBV MZ2-EBV 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 MZ2-CTL-22/31 SEWRDIDFAHEA 60∶1 30μM 83 71 10 85 72 3 77 66 1 79 63 300nM 60 33 100 44 17 30 21 4 10 9 5 3 10 6 0 10 6特异性释放 393 472最大释放 1698 1792％ 23 26
下文中将对更短的肽进行检测。对应于核苷酸碱基574-604位的十聚体肽，即
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala(SEQ ID NO：7)可以刺激溶解，正如肽：
Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe(SEQ ID NO：8)一样。
相反没有识别出九聚体：Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala(SEQ ID NO：9)肽。下面表7中概括了这些结果，也描述于附图8中。
由Burrows等人，J.Virol 64：3974(1990)报道的唯一一种与HLA-B44结合的其他肽是Glu Glu Asn Leu Leu Asp Phe Val Arg Phe(SEQ ID NO：10)。上文中描述的资料表明第二位的Glu和第9位的Phe可以给HLA-B44提供“锚着”残基。
表7在B44上的10M94肽酪氨酸酶 1 2 3 4 5 6 7 8 效应细胞 剂量 +W SEIWRDIDFA +W SEIWRDIDF +W EIWRDIDFA -W SEIWRDIDFA -W SEIWRDIDF -W EIWRDIDFA 1 2 3 4 5 6 7 8MZ2-CTL-22/31 1μM 91 93 7 98 99 11 300nM 76 81 4 77 97 645∶1 100 43 73 2 45 64 8 30 17 37 0 15 21 6 10 4 12 1 5 8 4 3 3 4 1 0 7 2 1 2 4 3 0.3 1 1 2
以前的实验证明将酪氨酸酶加工为肿瘤排斥抗原前体，导致得到的肿瘤排斥抗原与至少某些异常细胞例如具HLA-A2或HLA-B44表型的黑素瘤细胞上的分子形成一个复合物。该复合物被CTLs识别后，使呈递该复合物的细胞被裂解。该观察结果具有治疗和诊断意义，这也是本发明的特点。就治疗方法而言，产生特异于呈递上述复合物的异常细胞的CTLs的观察结果预示了各种治疗途径，一种这样的途径是给患有所述表现型的异常细胞的患者施用特异于该复合物的CTLs。体外研制这样的CTLs是本领域内技术人员熟知的。具体地说，将细胞样品(例如血细胞)与呈递该复合物的细胞相接触，并且能够刺激特定的CTL进行增殖。该靶细胞可以是一种转染子，例如上文中描述类型的COS细胞。这些转染子在其表面上呈递了所需复合物，并且当与所需CTL结合时，刺激其增殖。为了使本领域内技术人员能够制备这些CTLs，已经按照布达佩斯条约规定将含有所需基因的载体即pcDNA-1/Amp1(HLA-A2)和p123.B2(人酪氨酸酶)寄存于巴斯德学院，寄存号分别为NO.I1275和I1276。COS细胞，例如本领域内广泛使用的那些，也是另外的合适的宿主细胞。
对于详细的治疗方法，称为过继性转移(Greenberg，J.Immunol.136(5)：1917(1986)；Reddel et al.，Science 257：238(7-10-92)；Lynch etal.，Eur.J.Immunol.21：1403-1410(1991)；Kast et al.，Cell 59：603-614(11-17-89))，将呈递所需复合物的细胞与CTLs结合，从而导致特异于CTLs的细胞增殖。然后将增生的CTLs施用给患有细胞异常的患者，所述细胞异常的特征在于异常细胞呈递特定的复合物。然后CTLs溶解异常细胞，从而达到预期治疗目的。
上述治疗方法假设至少一些患者的异常细胞呈递了一种或多种HLA/酪氨酸酶衍生的肽的复合物。这可以非常容易地确定，例如利用上文中讨论的转染子可识别CTLs，并且一旦分离，就可与患者的异常细胞样品一起用于确定体外溶解情况。如果观察到溶解，然后可使用在该治疗方法中的特异性CTLs来减轻与异常细胞相关的症状。利用标准检测方法，用简单的步骤就可检测异常细胞的HLA表现型，并且利用例如PCR技术通过扩增可确定酪氨酸酶的表达。许多不同的HLA分子呈递来自于酪氨酸酶的TRAs这一事实增加了适合作为本文中讨论的治疗法的患者的个体数目。
过断性转移不是本发明可用的唯一治疗形式。利用许多方法也可以体外激发CTLs。上文中阐明了一种途径，即利用表达该复合物的非增殖性细胞，在该方法中使用的细胞是那些通常表达所述复合物的细胞，例如被辐射的黑素瘤细胞或者用呈递该复合物所需的一或二种基因转染的细胞。Chen等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：110-114(1991年1月)列举了这些途径，显示了在一种治疗方式中表达HPVE7肽的转染细胞的应用。可使用各种细胞类型，同样，可以使用携带一或两种所需基因的载体。病毒或细菌载体是特别优选的。在这些系统中，由例如一种痘苗病毒或细菌BCG携带所需基因，得到的材料称为“感染”宿主细胞。从而导致细胞呈递所需复合物，并由自体CTLs识别，然后增殖。通过将酪氨酸酶本身与一种促进其掺入到呈递HLA-A2细胞中的佐剂结合可达到相似效果。然后将酶加工以产生HLA分子的肽配体。
前面讨论中涉及“异常细胞”和“细胞异常”，这些术语具有最广泛意义上的含意，并且是指其中所指细胞至少显示一种特性的情形，该特性指明它们不同于其特异性类型的正常细胞。异常特性的例子包括形态和生化改变，例如细胞异常包括肿瘤，例如黑素瘤，自身免疫紊乱等等。
本发明还呈递了用于鉴别针对CTL靶的前体的方法。当靶细胞是肿瘤时，这些前体是指肿瘤排斥抗原，但必须指出异常细胞不是肿瘤时，不能将该分子称为肿瘤排斥抗原。实质上，本方法涉及鉴别一种作为上面讨论的类型的胞溶性T细胞的靶的细胞。一旦鉴别出这样一种细胞，就可将总RNA转化为一种cDNA文库，然后将其转染到能呈递一种抗原的细胞样品中，所述抗原与有关的HLA分子形成复合物。将该转染子与上文中讨论的CTL接触，再者，观察到CTL的靶击作用(溶解和/或TNF生产)。然后对被裂解的这些转染子进行处理，以去除cDNA，并进行测序，并且按照该方式可鉴别出异常状态的前体例如肿瘤排斥抗原前体。
本发明的其他方面对本领域技术人员而言是显而易见的，并在此不再重复。
已经使用的术语和表示方式是用作为描述的术语。不是为了限制发明，并不打算使用这样的术语和表达方式而排除具有相同特性的等价体或其部分，因为应认识到各种可能的修改都在本发明范围内。
序列表(1)一般信息：
(i)申请人：Wolfel，Thomas；Van Pel，Aline；Brichard，Vincent；
Boon-Falleur，Thierry
(ii)发明名称：酪氨酸酶衍生的分离肽及其应用
(iii)序列数：10
(iv)联系地址：
(A)联系人：Felfe & Lvnch
(B)街道：805 Third Avenue
(C)城市：纽约市
(D)州：纽约
(F)邮编：10022
(v)计算机可读形式：
(A)媒介类型：5.25寸磁盘，360kb存储
(B)计算机：IBM
(C)操作系统：PC-DOS
(D)软件：Wordperfect
(vi)本申请资料：
(A)申请号：08/233,305
(B)申请日：1994年4月26日
(C)分类：514
(vi)本申请资料：
(A)申请号：08/203,054
(B)申请日：1994年2月28日
(vii)在先申请资料：
(A)申请号：08/081,673
(B)申请日：1993年6月23日(vii)在先申请资料：
(A)申请号：08/054,714
(B)申请日：1993年4月28日(vii)在先申请资料：
(A)申请号：07/994,928
(B)申请日：1992年12月22日(xiii)律师/代理人信息：
(A)姓名：Hanson，Norman D
(B)注册号：30，946
(C)文档号：LUD 5360.1(ix)通讯信息：
(A)电话：(212)688-9200
(B)传真：(212)838-3884(2)SEQ ID NO：1的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：1894bp
(B)类型：核酸
(C)链性：单链
(D)拓扑结构：线性
(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：GGA AGA ATG CTC CTG GCT GTT TTG TAC TGC CTG CTG TGG AGT TTC CAG 48Gly Arg Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln
-15 -10 -5ACC TCC GCT GGC CAT TTC CCT AGA GCC TGT GTC TCC TCT AAG AAC CTG 96Thr Ser Ala Gly His Phe Pro Arg Ala Cys Val Ser Ser Lys Asn Leu
1 5 10ATG GAG AAG GAA TGC TGT CCA CCG TGG AGC GGG GAC AGG AGT CCC TGT 144Met Gly Lys Glu Cys Cys Pro Pro Trp Ser Gly Asp Arg Ser Pro Cys 15 20 25 30GGC CAG CTT TCA GGC AGA GGT TCC TGT CAG AAT ATC CTT CTG TCC AAT 192Gly Gln Leu Ser Gly Arg Gly Ser Cys Gln Asn Ile Leu Leu Ser Asn
35 40 45GCA CCA CTT GGG CCT CAA TTT CCC TTC ACA GGG GTG GAT GAC CGG GAG 240Ala Pro Leu Gly Pro Gln Phe Pro Phe Thr Gly Val Asp Asp Arg Glu
50 55 60TCG TGG CCT TCC GTC TTT TAT AAT AGG ACC TGC CAG TGC TCT GGC AAC 288Ser Trp Pro Ser Val Phe Tyr Asn Arg Thr Cys Gln Cys Ser Gly Asn
65 70 75TTC ATG GGA TTC AAC TGT GGA AAC TGC AAG TTT GGC TTT TGG GGA CCA 336Phe Met Gly Phe Asn Cys Gly Asn Cys Lys Phe Gly Phe Trp Gly Pro
80 85 90AAC TGC ACA GAG AGA CGA CTC TTG GTG AGA AGA AAC ATC TTC GAT TTG 384Asn Cys Thr Glu Arg Arg Leu Leu Val Arg Arg Asn Ile Phe Asp Leu 95 100 105 110AGT GCC CCA GAG AAG GAC AAA TTT TTT GCC TAC CTC ACT TTA GCA AAG 432Ser Ala Pro Glu Lys Asp Lys Phe Phe Ala Tyr Leu Thr Leu Ala Lys
115 120 125CAT ACC ATC AGC TCA GAC TAT GTC ATC CCC ATA GGG ACC TAT GGC CAA 480His Thr Ile Ser Ser Asp Tyr Val Ile Pro Ile Gly Thr Tyr Gly Gln
130 135 140ATG AAA AAT GGA TCA ACA CCC ATG TTT AAC GAC ATC AAT ATT TAT GAC 528Met Lys Asn Gly Ser Thr Pro Met Phe Asn Asp Ile Asn Ile Tyr Asp
145 150 155CTC TTT GTC TGG ATG CAT TAT TAT GTG TCA ATG GAT GCA CTG CTT GGG 576Leu Phe Val Trp Ile His Tyr Tyr Val Ser Met Asp Ala Leu Leu Gly
160 165 170GGA TCT GAA ATC TGG AGA GAC ATT GAT TTT GCC CAT GAA GCA CCA GCT 624Gly Tyr Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe Ala His Glu Ala Pro Ala175 180 185 190TTT CTG CCT TGG CAT AGA CTC TTC TTG TTG CGG TGG GAA CAA GAA ATC 672Phe Leu Pro Trp His Arg Leu Phe Leu Leu Arg Trp Glu Gln Gly Ile
195 200 205CAG AAG CTG ACA GGA GAT GAA AAC TTC ACT ATT CCA TAT TGG GAC TGG 720Gln Lys Leu Thr Gly Asp Gly Asn Phe Thr Ile Pro Tyr Trp Asp Trp
210 215 220CGG GAT GCA GAA AAG TGT GAC ATT TGC ACA GAT GAG TAC ATG GGA GGT 768Arg Asp Ala Glu Lys Cys Asp Ile Cys Thr Asp Gly Tyr Met Gly Gly
225 230 235CAG CAC CCC ACA AAT CCT AAC TTA CTC AGC CCA GCA TCA TTC TTC TCC 816Gln His Pro Thr Asn Pro Asn Leu Leu Ser Pro Ala Ser Phe Phe Ser
240 245 250TCT TGG CAG ATT GTC TGT AGC CGA TTG GAG GAG TAC AAC AGC CAT CAG 864Ser Trp Gln Ile Val Cys Ser Arg Leu Glu Glu Tyr Asn Ser His Gln255 260 265 270TCT TTA TGC AAT GGA ACG CCC GAG GGA CCT TTA CGG CGT AAT CCT GGA 912Ser Leu Cys Asn Gly Thr Pro Glu Gly Pro Leu Arg Arg Asn Pro Gly
275 280 285AAC CAT GAC AAA TCC AGA ACC CCA AGG CTC CCC TCT TCA GCT GAT GTA 960Asn His Asp Lys Ser Arg Thr Pro Arg Leu Pro Ser Ser Ala Asp Val
290 295 300GAA TTT TGC CTG AGT TTG ACC CAA TAT GAA TCT GGT TCC ATG GAT AAA 1008Glu Phe Cys Leu Ser Leu Thr Gln Tyr Glu Ser Gly Ser Met Asp Lys
305 310 315GCT GCC AAT TTC AGC TTT AGA AAT ACA CTG GAA GGA TTT GCT AGT CCA 1056Ala Ala Asn Phe Ser Phe Arg Asn Thr Leu Glu Gly Phe Als Ser Pro
320 325 330CTT ACT GGG ATA GCG GAT GCC TCT CAA AGC AGC ATG CAC AAT GCC TTG 1104Leu Thr Gly Ile Ala Asp Ala Ser Gln Ser Ser Met His Asn Ala Leu335 340 345 350CAC ATC TAT ATG AAT GGA ACA ATG TCC CAG GTA CAG GGA TCT GCC AAC 1152His Ile Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Met Gln Gly Ser Ala Asn
355 360 365GAT CCT ATC TTC CTT CTT CAC CAT GCA TTT GlT GAC AGT ATT TTT GAG 1200Asp Pro Ile Phe Leu Leu His His Ala Phe Val Asp Ser Ile Phe Glu
370 375 380CAG TGG CTC CAA AGG CAC CGT CCT CTT CAA GAA GTT TAT CCA GAA GCC 1248Gln Trp Leu Arg Arg His Arg Pro Leu Gln Glu Val Tyr Pro Glu Ala
385 390 395AAT GCA CCC ATT GGA CAT AAC CGG GAA TCC TAC ATG GTT CCT TTT ATA 1296Asn Ala Pro Ile Gly His Asn Arg Glu Ser Tyr Met Val Pro Phe Ile
400 405 410CCA CTG TAC AGA AAT GGT GAT TTC TTT ATT TCA TCC AAA GAT CTG GGC 1344Pro Leu Tyr Arg Asn Gly Asp Phe Phe Ile Ser Ser Lys Asp Leu Gly415 420 425 430TAT GAC TAT AGC TAT CTA CAA GAT TCA GAC CCA GAC TCT TTT CAA GAC 1392Tyr Asp Tyr Ser Tyr Leu Gln Asp Ser Asp Pro Asp Ser Phe Gln Asp
435 440 445TAC ATT AAG TCC TAT TTG GAA CAA GCG AGT CGG ATC TGG TCA TGG CTC 1440Tyr Ile Lys Ser Tyr Leu Gly Gln Ala Ser Arg Ile Trp Ser Trp Leu
450 455 460CTT GGG GCG GCG ATG GTA GGG GCC GTC CTC ACT GCC CTG CTG GCA GGG 1488Leu Gly Ala Ala Met Val Gly Ala Val Leu Thr Ala Leu Leu Ala Gly
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480 485 490AAG CAG CCA CTC CTC ATG GAG AAA GAG GAT TAC CAC AGC TTG TAT CAG 1584Lys Gln Pro Leu Leu Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln495 500 505 510AGC CAT TTA 1593Ser His Leu
513TAAAAGGCTT AGGCAATAGA GTAGGGCCAA AAAGCCTGAC CTCACTCTAA CTCAAAGTAA 1653TGTCCAGGTT CCCAGAGAAT ATCTGCTGGT ATTTTTCTGT AAAGACCATT TGCAAAATTG 1713TAACCTAATA CAAAGTGTAG CCTTCTTCCA ACTCAGGTAG AACACACCTG TCTTTGTCTT 1773GCTGTTTTCA CTCAGCCCTT TTAACATTTT CCCCTAAGCC CATATGTCTA AGGAAAGGAT 1833GCTATTTGGT AATGAGGAAC TGTTATTTGT ATGTGAATTA AAGTGCTCTT ATTTTAAAAA 1893A 1894(2)SEQ ID NO：2的信息：
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Tyr Met Asn Gly Thr Met Ser Gln Val
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Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu
5 10(2)SEQ ID NO：4的信息：
(i)序列特征：
(A)长度：9个氨基酸残基
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Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu
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Ser Glu Ile Trp Arg Asp Ile Asp Phe
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(i)序列特征：
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5 10