分离表型相关基因的方法及其装置 本发明涉及从有某种确定表型的人或高等动植物的复杂基因组中分离该表型相关基因DNA片段的方法及其装置。特别是涉及一种可直接准确地分离出全基因组DNA链中任何部位、任何类型的表型相关基因DNA片段的方法及其装置。
本发明的现有技术中，从复杂基因组中分离表型相关基因片段则面临两个困难：(1)表型相关基因片段包含多种类型，如遗传系中血亲同一型片段或等基因系(高等生物同一个体的体细胞系，植物的单克隆品系和动植物培养细胞单克隆系)中突变片段；重排型突变(基因的缺失、插入、倒位等)、点突变(碱基置换和小的缺失、插入)或去甲基化突变片段；单基因型突变或多基因型突变片段。然而目前还没有一种可分离出上述所有类型突变片段的方法。(2)人或高等动植物的基因组庞大复杂，如人的基因组包含60亿核苷酸对，它可被限制酶切成107种易于杂交识别的小片段。然而无论是杂交识别还是剂量比较都达不到10-7的分辨率(即分辨出两个基因组间107分之一的差异)。任何分离基因方法首先必须把基因组地复杂度降至102以下，才能进行分辨和分离。现有技术或者以降低灵敏度(减少被检基因组范围)为代价降低复杂度，或者不能把复杂度降低到可分辨的程度，因而缺乏较高的灵敏度和分辨率。在现有技术中，依据分离的突变类型不同，分离基因方法可分为三类：(1)功能克隆法：提纯某种已知功能蛋白质，测其氨基酸顺序，进而推断出其相关基因结构。由于细胞中往往含有上万种蛋白质，大多数种含量极微，难以提纯和分析，这类方法仅适用于极少数蛋白质表达量高的基因的分离。(2)定位克隆法：通过某种表型在遗传家系中与一些位点标记间连锁分析把表型相关基因定位在染色体某区域中。这类方法仅适用于容易找到遗传家系的植物基因或者人类单基因遗传病相关基因的分离。(3)表型克隆法：通过有相同表型的遗传家系中不同个体基因组间杂交分离遗传性血亲同一片段(IBDF，idendical-by-desend-fragment)，或者通过有不同表型的同一个体细胞基因组间杂交或带型比较分离重排型突变。近年来，大量的研究表明，人类大多数致命性疾病，例如恶性肿瘤、脑血管病、心脏病、II型糖尿病、骨质疏松症、老年痴呆症等，甚至人类的衰老都是由多位点、体细胞性点突变所引起的。而现有技术均不适用分离这一类突变片段。本发明所确立的基本方法则可以用于分离这些人类致命基因(R.Nowak，Science，270(1995)，P368-371；P.Aldhous，Science，265(1994)，P2008-2010；J.J.Jonsson et al.，Proc.Natl. Acad. Sci.USA，92(1995)，P83-85)。在现有技术中依据减少基因组的复杂度方式不同，分离基因方法可分为二类：(1)通过特异探针标记(杂交)或特异引物PCR扩增选择性分离基因组中部分区域中基因。这类方法以减少被筛查基因组区域为代价来减少基因组复杂度，因而势必降低其灵敏度(N.Lisitsyn，et al.，Science，259(1993)，P946-951；P.Liang，et al.，Nucl.Acid.Res.21(1993)，P3269-3275)。(2)在杂交前把基因组DNA片段单向电泳或带型比较前把基因组双向电泳，使DNA片段分散到103～104位点上，从而把每个位点上片段种类减少到104以下。这类方法虽然没有减少其灵敏度，但也没有将基因组复杂度减少至102以下可分辨的程度(L.C.Au，et al.，86(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，P5507-5511；H.Yokota，et al.，219(1994)，Analy.Biochem.，P131-138；H.Nakashime.227(1995)，Analy.Biochem.，P319-327)。故而针对现有技术中所存在的问题，研制一种可对全基因组中任何部位任何类型突变片段进行直接分离的新型的分离表型相关基因的方法及其相关装置。
鉴于上述现有技术中所存在的问题，本发明的目的是改进现有表型克隆法存在的上述两个缺陷，建立一种可直接准确分离出全基因组任何部位任何类型的表型相关基因的方法。以双向电泳取代现有的杂交前单向电泳法，以二次酶切(粗切酶和细切酶)凝胶过滤电泳取代现有的带型比较前的普通双向电泳。从而把基因组的复杂度降至102以下，达到了可直接分辨的程度。实现了对全基因组中突变片段的直接分离。以可检出任何型式的突变片段的原位加减法取代现有的仅能分离重排型突变片段的减法杂交或带型比较。实现了对基因组中任何型式的突变片段的分离。
一种分离表型相关基因的方法；包括下列步骤：第一步，把样本和对照本DNA片段分散到凝胶上，从而减少同一位点重叠在一起的DNA片段种数；第二步，通过碱液变性----中性液复性处理上述凝胶片，使其中含有的DNA片段在电泳原位相互杂交；第三步，将不杂交的重排型突变片段和去甲基化/甲基化突变片段及杂交形成错配处的点突变片段分离到另一胶膜上；第四步，通过对突变片段，即等基因系的表型相关基因片段原位PCR，或放射自显影后在试管中PCR扩增其为探针；通过对非突变片段，即遗传系的表型相关基因片段放射自显影后在试管中PCR扩增其为探针。本发明所述的样本和对照本DNA可以分别是同一生物个体不同表型细胞的DNA；也可以分别是不同生物个体细胞的DNA；或可以分别是不同表型、不同生物个体细胞的DNA；另外，样本和对照本DNA可以是全部或部分细胞核DNA，也可以是从mRNA或hnRNA反转录的cDNA、mtDNA等；其中可以是人或高等动、植物及其它任何生物基因组的DNA或cDNA。本发明所述减少同一位点重叠DNA片段种数的步骤，可以是单向凝胶过滤电泳，也可以是杂交前双向电泳或者带型比较前用粗切酶和细切酶的双向电泳；可以是样本和对照本混合电泳，也可以是二者平行电泳。本发明所述的原位相互杂交步骤，可以是在均匀凝胶中进行，也可以是在杂交胶膜上的空心泡内液体中或稀的凝胶中进行；可以通过碱液变性----中性液复性处理中进行，也可以通过高温变性----低温复性处理中进行。本发明所述的分离突变片段的步骤，可以是将非突变片段固定，然后通过电泳或吸印把游离的突变片段分离出来；也可以用化学物或酶把突变片段切短，再通过电泳把短的突变片段和长的非突变片段分离开来；还可以通过原位样本和对照本间萤光比较或是通过用修复酶mutHLS等标记杂交双链错配处以显示分离之。本发明所述的扩增基因片段的步骤，可以是原位PCR扩增，也可以在放射自显影原位显示后取出，然后在试管中进行PCR扩增，还可以将基因片段直接从凝胶片中洗脱到试管中扩增。本发明所述的避免对照片段间不杂交的措施，可以将样本和对照本片段混合电泳或平行电泳以避免二者间错位，也可以将DNA切成小片段以有利于其运动、杂交，还可以通过凝胶过滤电泳提高DNA片段的浓度或是在杂交胶膜空心泡液相中杂交。本发明所述的避免非对照片段间错交，可以将DNA切成小片段减少散在性重复片段的错交，也可以是双向电泳，凝胶过滤电泳或是自交结果对照减少家族基因和等位基因间错交，或以严格条件进行杂交以避免DNA单链的自交。本发明所述一种分离表型相关基因的装置，其包括由用于DNA片段双向电泳和第三向电转移的三维电泳仪(SD)和DNA片段原位杂交的杂交胶膜(Hm)所组成；在三维电泳仪(SD)内具有中央平台，在中央平台的左、右、前、后相对设置电泳液槽(N1，P1，N2，P2)，其中N1，N2为负极电液槽，P1，P2为正极电液槽；在平台的下方设有不锈钢网，在不锈钢网的下面设有负极电泳液槽(N3)，在不锈钢网上面放置用于DNA片段双向电泳的凝胶片，在凝胶片上面放置有杂交胶膜(Hm)，用做正极的不锈钢网(P3)设置在杂交胶膜(Hm)的上面。本发明所述杂交胶膜(Hm)包括一正方形尼龙膜(Nm)或硝酸纤维素膜，其膜孔径为0.1μm，在尼龙膜(Nm)上附有1～2mm薄层聚丙烯酰胺空心凝胶，其浓度为0.8％，空心泡(Cell)孔径10μm--100μm，在泡内含液体或低浓度Hydrolink胶或琼脂糖。
本发明所述的分离表型相关基因的方法包括：(1)、二次酶切双向电泳：以不同表型同一个体细胞基因组DNA(cDNA库、mt DNA库)，或者以同一表型不同个体细胞基因组DNA为样本和对照本。将二者用相同粗切酶(识别6～8个核苷酸对序列的限制酶)充分分解为平均10kb以上长片段，并分别标记放射性同位素和生物素，混合电泳至凝胶条中，再用细切酶(识别4个核苷酸对的酶)把凝胶条中DNA片段进一步分解为平均几百bp片段，横向(与第一次电泳方向垂直)电泳到凝胶片中，使基因组中107种片段分散到105个(200×500)位点上。每个位点上平均含有102种DNA片段。(2)、限制片段原位加减法：同一生物个体中所有细胞都从一个受精卵细胞增殖而来，因此它们有相同的基因组和限制图。任何一种样本中限制片段与其在对照本中对照片段(同染色体上同位点片段)具有相等长度和相同碱基顺序，会被上述电泳移动到相同位置。任何形式的突变将改变二者等位状态：(2.1)、重排性突变会使突变片段与其对照片段间发生移位，因此可通过不移位的非突变片段间减法杂交分离出这类突变片段。具体地，将经双向电泳的凝胶中DNA片段用碱液变性处理后，将它们纵向(与原胶面垂直)电泳到含有生物素亲合素(Avidin)凝胶附着的尼龙膜上，温育固定标有生物素的对照本片段，再以中性液处理使不移位样本片段杂交到已固定的对照本对照片段上，最后把未杂交的样本突变片段转到另一个附有凝胶的尼龙膜上。(2.2)、点突变会使突变片段与其对照片段间发生碱基顺序差异，因此可通过有差异的突变片段间加法杂交分离这类突变片段。具体地，把减法中已被分离出重排性突变片段的凝胶片用化学物，比如锇酸、盐酸羟胺和六氢吡啶或T4内切酶VII，S1核酸酶等处理以切割突变片段的杂交双链错配处，然后把切断而游离下来的突变片段转到另一附有凝胶的尼龙膜上。(3)、突变片段原位显示和扩增：对上述含有突变片的凝胶片进行X光片放射自显影，依据显示的位置取出突变片段，加上寡聚核苷酸接头，再进一步通过PCR扩增为探针，再用于表型相关基因的表达序列和全序列测定。另外，还有不必对样本加以放射性标记的方法：在含有突变片段的胶片上，通过原位PCR把突变片段扩增为探针。或者通过电洗器将胶片中突变片段转入试管，再通过PCR扩增为探针。(4)、降低假阳性率和假阴性率：对照片段间不杂交或杂交效率低，非对照片段间错交都会造成一些假阳性和假阴性。把样本和对照本片段混合在一起电泳可避免对照片段间错位而不杂交。采用空心胶做杂交膜可避免在凝胶中杂交的低效率。把限制片段切成几百bp小片段，既有利于提高杂交效率，又可把单拷贝序列和散在性重复序列(IRS，interspersed repeat sequence)切开，而避免非对照片段的IRS间错交。双向电泳可避免大部份非对照片段的家族基因或等位基因序列间错交。余下的错交结果可通过样本和对照本杂交分离的片段与二者自交分离的片段的对比或进行减法杂交以去除。采用一对限制酶可把基因组80％部份切成0.1kb至2kb适宜长度而被筛查，采用三对不同限制酶即可筛查基因组99.2％部份。综上所述使用本发明的方法和装置，无需昂贵设备和特殊探针，甚至无需放射性标记，具有成本低、实验周期短等特点，即可从人和高等动植物复杂基因组中分离出任何部位、任何型式的表型相关基因片段。特别是为分离至关重要的人类致命基因提供了一个简便快捷的新手段。
本发明共有三张附图，其中：
附图1是分离表型相关基因的方法流程图。
附图2是三维电泳仪的结构示意图。
附图3是杂交胶膜的结构示意图。
图中：
RF--限制片段 Ao--电泳凝胶片 TE--二次酶切双向电泳
SH--减法杂交 AH1--加法杂交1 AH2--加法杂交2
Aa--放射自显影 PCR--链式酶促反应 Tube--试管
N1--负极电液槽1 N2--负极电液槽2 N3--负极电泳液槽3
P1--正极电液槽1 P2--正极电液槽2 P3--正极不锈钢网3
Nm--尼龙膜 Hm--杂交胶膜 Cell--空心泡
Gel--凝胶 A1，A2，B1，B2--杂交胶膜
本发明的具体实施例如附图所示：实施例1用杂交减法分离等基因系重排型突变片段
把样本和对照本的DNA片段(RF)分别标记放射性同位素和生物素。将二者以1∶100比例混合在A0胶中双向电泳(TE)，碱液处理后将全部DNA片段转入含生物素亲合素的杂交胶膜A1中，温育固定标有生物素的对照本片段。然后中性液处理使非突变片段杂交到对照本片段上。把未杂交的突变片段转移到另一杂交膜B1中(SH)。对B1胶膜进行X光片放射自显影(Aa)显示突变片段位置，取出它再进一步扩增为探针。这种方法适用分离小于100bp的突变片段。实施例2 用比较减法分离等基因系重排突变片段
用同种限制酶把样本和对照本的等量DNA切成平均100kb长片段，经平行脉冲电场电泳到胶条中，再用细切酶将它们切成平均10kb片段，并把二者分别在3′末端标记不同颜色的萤光素。将二者在A0胶中作横向电泳，然后把A0胶置于萤光自动扫描仪下检出色差异常位点。即为突变片段位点。取出其中DNA片段通过单链构象多态(SSCP)电泳分离出突变片段，再进一步扩增为探针。这种方法适用于分离大于100bp的突变片段。实施例3 用杂交减法分离等基因系去甲基化突变片段
该方法与实施例1相似，不同之处是前者采用不切割会发生去甲基化突变的CpG序列的限制酶进行二次酶切，后者采用切割去甲基化的CpG而不切割甲基化的CpG序列的酶，而使样本突变片段比对照片段少了一个切点，二者间发生了位移则可用杂交减法进行分离。实施例4 用加法分离等基因系点突变片段
把等量的样本和对照本DNA片段(RF)混合在A0胶中进行双向电泳(TE)，将DNA转入杂交胶膜A2后，碱变性--中性重复性处理，使二者原位杂交。然后用化学物，比如盐酸羟胺、锇酸和六氢吡啶或用酶，比如T4内切酶VII，S1核酸酶等处理DNA片段，在杂交双链错配处切下突变片段，然后将被切短的突变片段转入另一胶膜B2(AH1)。未被切断的非突变片段电泳速度慢而留在胶A2中。将B2胶中突变片段进一步扩增为探针。实施例5 用加减法分离遗传系血亲同一型片段
把等量的样本和对照本DNA片段(RF)分别在3′末端标记放射性同位素和生物素。将二者混合在A0胶中单向电泳，碱液变性后将DNA转入另一含有生物素亲合素的胶膜A1上，温育固定对照本片段，再用中性液复性处理，使非重排型样本片段杂交、固定于A1膜上，把重排型突变片段转入B1膜上(SH)，然后用化学物或酶把A1胶膜中点突变片段切断，把游离的点突变片段转入胶膜B2(AH2)，最后对除去重排型和点突变型片段的胶膜A2进行X光片放射自显影(Aa)，显示位置即为血亲同一片段位置，取出后进一步扩增为探针。实施例6 用加法分离等基因系重排型突变片段
把样本和对照本DNA片段(RF)分别用去甲基化酶和甲基化酶处理，将二者以1∶100比例混合在A0胶中双向电泳和原位杂交。然后用不切割甲基化序列的限制酶把去甲基化的样本自交双链(即为重排突变片段)切断，最后将这些切短的突变片段转入胶膜B2上(AH1)。甲基化的对照本片段和半甲基化的杂交片段都未被切短，它们在电泳时落在后面留在胶膜A2中。然后将胶膜B2中突变片段进一步扩增为探针。