SARS冠状病毒ORF8区域的应用 【技术领域】
本发明涉及病毒学和分子流行病学领域，更具体地涉及引起严重急性呼吸综合征病毒的SARS冠状病毒ORF8区域的应用。
背景技术
2003年我国和世界上许多国家遭到了一次大规模的非典型肺炎(Atypicalpneumonias)的侵袭，由非典型肺炎引起的严重急性呼吸综合征(Severe AcuteRespiratory Sydrome，SARS)已经在22个国家和地区发生。世界卫生组织(WorldHealth Organization，WHO)在疫情发生后迅速建立起由全球10个国家的13个实验室组成的协作研究和监测网络。4月16日，WHO正式确认SARS的病原体是一种新型冠状病毒，这是一种单链RNA病毒。
全球已有8000多例非典型肺炎患者，在某些发病区其死亡率达到15％，给人民群众带来了极大的恐慌。医务工作者和生物学领域的研究人员及时开展SARS冠状病毒的病原学以及预防、诊断和治疗的研究，并且对于该病毒的变异过程和各阶段的毒性和传染力的特点都有了一定的了解。但是目前对于SARS病毒疫苗地工作仍然没有显著的进展。
由于SARS冠状病毒病毒是不断变异的，其变异一方面随其进化的程度有一定的相关，另一方面，也可能与病毒的传染力相关。因此迫切需要开发快速确定各种不同的SARS冠状病毒变异株的技术，以便在预防工作中能够采取合理的隔离措施。然而，到目前为止没有相应的方法。
因此，本领域迫切需要开发可用于防治SARS冠状病毒的技术，尤其是快速确定SARS冠状病毒基因组分型的方法。
【发明内容】
本发明的目的就是提供一种快速确定SARS冠状病毒基因组分型的方法。
在本发明的第一方面，提供了一种体外确定SARS冠状病毒基因组分型的方法，包括步骤：
(a)抽提待检测的SARS冠状病毒的总RNA；
(b)以步骤(a)中的总RNA为模板，特异性地扩增SARS冠状病毒ORF8区域，从而获得ORF8的扩增产物；
(c)将扩增产物与具有SEQ ID NO：2所示的ORF8序列(基于GZ02 AY390556)进行比较，确定是否存在缺失突变，其中以下缺失突变代表病毒进化的不同阶段：
早期：无缺失或82bp缺失，如ZS-A AY394997；
中期、晚期：29bp缺失，如GZ-A AY394977；39bp缺失，如GZ-B AY394978；或415bp缺失，如CUHK-LC3 AY395000。
在另一优选例中，步骤(c)中的比较是通过电泳或测序进行。
在另一优选例中，所述的突变是ORF8缺失了SEQ ID NO：2中第247-275位的29个核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变是ORF8缺失了SEQ ID NO：2中第221-302位的82个核苷酸。
在另一优选例中，所述的突变是ORF8缺失了SEQ ID NO：2中第134-172位的39个核苷酸；或者缺失了SEQ ID NO：2中第82-496位的415个核苷酸。
在本发明的第二方面，提供了一种SARS冠状病毒ORF8区域的应用，它被用于筛选预防和治疗严重急性呼吸综合征的药物。
在本发明的第三方面，提供了一种筛选SARS冠状病毒生长抑制剂的方法，包括以下步骤：
(a)在体外培养SARS冠状病毒的体系中，加入反义寡核苷酸分子，所述的反义寡核苷酸分子特异性地互补于SARS冠状病毒ORF8区域，并且长度为14-25bp(更佳地为18-23bp)；同时将未加入反义寡核苷酸分子的体外培养SARS冠状病毒的体系作为对照；
(b)观察SARS冠状病毒的生长情况，如果生长慢于对照，则表明所述的反义寡核苷酸分子是SARS冠状病毒生长抑制剂。
在另一优选例中，所述的反义寡核苷酸分子不互补于人类基因组DNA。
在本发明的第四方面，提供了一种对SARS冠状病毒进行突变从而提高其体外培养水平的方法，其中所述的SARS冠状病毒含有完整的ORF8区域。该方法包括步骤：对所述的SARS冠状病毒RNA的ORF8区域或附近进行定点缺失，从而获得重组的SARS冠状病毒。
在另一优选例中，所述的定点缺失选自下组：
(a)缺失了SEQ ID NO：2中第247-275位的29个核苷酸；
(b)缺失了SEQ ID NO：2中第221-302位的82个核苷酸；
(c)缺失了SEQ ID NO：2中第134-172位的39个核苷酸
(d)缺失了SEQ ID NO：2中第82-496位的415个核苷酸。
【附图说明】
图1描述了60种SARS冠状病毒基因组序列的邻近关系，显示了各病毒株的变异来源的树状图。从下至上为早期、中期、晚期的变异。
图2显示了在SARS冠状病毒中ORF8区域的缺失情况。其中GZ02、ZS-A、TOR2(相当于GZ-A)等为各SARS冠状病毒株的名称。
图3显示了早期、中期、晚期SARS与ORF8区域缺失(deletion)的关系图。
【具体实施方式】
本发明人经过广泛而深入研究发现，SARS冠状病毒在进化过程中的一个重要的反复出现的特征就是在其ORF8区域出现各种不同的缺失突变。因此ORF8区域不仅可以作为确定SARS冠状病毒基因组分型的指标，而且可以作为筛选SARS冠状病毒抑制剂(或相关药物)靶点。在此基础上完成了本发明。
虽然最早公布的SARS冠状病毒基因组序列是加拿大分离到的SARS病毒株TOR2的基因序列(Genbank的登录号AY274119 SARS冠状病毒TOR2，完全基因组，SEQ ID NO：1)。然而，由于早期SARS冠状病毒的基因组比TOR2要多29个核苷酸碱基。因此，以早期的病毒，例如GZ02的基因组序列(GenBank登录号AY390556)作为参照更合适。
例如，对于ORF8区域而言，如以TOR2病毒株为基准，则GZ02含有29bp的插入突变；如以GZ02病毒株为基准，则TOR2含有29bp的缺失突变。因此，为了更清楚地描述早期、中期和晚期SARS冠状病毒中ORF8的的变异情况，优选采用GZ02病毒株为基准。
本发明人通过对来自多个早期、中期和晚期病人的各种不同SARS冠状病毒的基因组的全序列测定，并结合已发表的其他SARS冠状病毒基因组序列，发现可将SARS冠状病毒划分为早期、中期和晚期SARS冠状病毒(图1)。
图1是SARS病毒各病毒株变异的树状图，其中可见中晚期的病毒与早期病毒相比经过了多次变异。而且，其中的基因序列也有了很大的不同，下文的表1显示了几种有代表性的SARS病毒核苷酸序列上几个主要位点的变化。
表1 SARS病毒单核苷酸变异的重要位点(与SEQ ID NO：1相比)位置 1206 9404 9479 17564 20840 21721 22222 23823 27827早期型 C C C G A A C G C中期型I T T T G G A C T C中期型II T C T G G A C T C晚期型T T T T G G T T T
各个时期的SARS冠状病毒基因组中存在一些变异，尤其是ORF8区域存在特征性的变异情况。如图2所示，以GZ02的ORF8区域和邻近区域的序列(SEQ IDNO：2)为基准，早期的SARS冠状病毒都含有SEQ ID NO：2所示的ORF8。中晚期的SARS冠状病毒则分别缺失了29bp(SEQ ID NO：2中第247-275位)、82bp(SEQ IDNO：2中第221-302位)、39bp(SEQ ID NO：2中第134-172)或415bp(SEQ ID NO：2中第82-496位)。详细的缺失示意图见图3，其中所示的区域对应于TOR2序列(SEQID NO：1)的核苷酸27259-28132，或对应于GZ02(AY390556)的核苷酸27288-28161。
本发明人通过流行病学分析发现，在原始的果子狸序列(SZ16，GenBank登录号AY304488)以及早期病人(GZ-02，AY390556)分离到的病毒序列中都具有完整的ORF8区域。根据临床观察，GZ02这种早期的SARS病毒在人体内毒性小，感染力弱。虽然该GZ02株分离得自一位老年患者的尸检材料，但是，其他早期病人均具有同类的突变，且病情较弱。进入中期，SARS病毒株与早期及果子狸的病毒株不同，带有中晚期病毒的典型的ORF8区域的29bp缺失变异。而且，不同ORF8区域缺失在SARS传播过程中多次发生。因此，上述研究结果提示， 利用Orf8区域的不同缺失可作为其基因组分型的标记，并有可能与SARS病毒的复制或转录能力相关，也可能最终与传染力或毒性相关。
因此，本发明提供了一种体外确定SARS冠状病基因组分型的方法。通常包括步骤：
(a)抽提待检测的SARS冠状病毒的总RNA；
(b)以步骤(a)中的总RNA为模板，特异性地扩增SARS冠状病毒ORF8区域，从而获得ORF8的扩增产物；
(c)将扩增产物与具有ORF8标准品(如SEQ ID NO：2所示序列)进行比较，确定是否存在缺失突变，其中可能存在不同的缺失突变，代表病毒进化的不同阶段(举例：早期：无缺失或82bp缺失，ZS-A AY394997；中期、晚期：29bp缺失，GZ-A AY394977；39bp缺失，GZ-B AY394978；415bp缺失，CUHK-LC3 AY395000)。
其中，比较可用常规方法，通过电泳(比较片段长度)或测序(比较具体序列)进行。
此外，还可直接用针对ORF8区域不同的已知缺失突变的探针直接进行检测，以确定待测SARS冠状病毒ORF8区域的缺失情况，进而判断传染力大小。
鉴于ORF8在SARS冠状病毒传染力方面的重要作用，本发明还提供了一种SARS冠状病毒ORF8区域的应用，即用于筛选预防和治疗严重急性呼吸综合征的药物。
以筛选小分子反义核酸的方法为例(这些小分子反义核酸可作为SARS冠状病毒生长抑制剂)，本领域技术人员可将SEQ ID NO：2作为基础，用各种市售的计算机软件方便地设计出特异性结合于ORF8的反义寡核苷酸分子，并用常规方法进行大量人工合成。然后，通过以下步骤筛选出SARS冠状病毒生长抑制剂：
(a)在体外培养SARS冠状病毒的体系中，加入反义寡核苷酸分子，所述的反义寡核苷酸分子特异性地互补于SARS冠状病毒ORF8区域(即不互补于SARS冠状病毒的其他区域)，并且长度为14-25bp；同时将未加入反义寡核苷酸分子的体外培养SARS冠状病毒的体系作为对照；
(b)观察SARS冠状病毒的生长情况，如果生长慢于对照，则表明所述的反义寡核苷酸分子是SARS冠状病毒生长抑制剂。
虽然反义寡核苷酸分子可以部分互补于人的基因组序列，但是优选的反义寡核苷酸分子是不互补于人类基因组DNA的。
筛选出的SARS冠状病毒生长抑制剂可进一步通过动物和临床试验，以便从中最终筛选出有效的药物。
此外，中期和晚期的SARS病毒由于感染效力强，在细胞内复制增殖的能力强，因此易于培养，但是安全差。而果子狸和早期的病毒由于感染能力弱，难于培养，因此收集困难。基于ORF8区域与SARS冠状病毒体外培养(或传染力)强弱的关系，本发明还提供了一种对SARS冠状病毒进行突变从而提高其体外培养水平的方法，主要是认识到最长的基因组可能不是最有利于培养的。因此，所述的SARS冠状病毒应含有早期病毒的序列特征但又具有晚期病毒的、具有不同的缺失的ORF8区域(尤其是中期SARS冠状病毒或果子狸的冠状病毒)，即对所述的SARS冠状病毒RNA的ORF8区域进行定点缺失，从而获得重组的SARS冠状病毒。通过这种方法，可望获得易于体外培养且毒性低SARS冠状病毒，从而可用于制备减毒疫苗、灭活疫苗或活疫苗。
可用ORF8区域经过改造的SARS病毒来配制疫苗。为此，将病毒调节到合适的浓度并用合适的疫苗佐剂、稀释剂或载体配制。可将生理学上可接受的介质用作载体。它们包括但不限于：合适的等渗液、磷酸盐缓冲液等等。
佐剂可用多种方法分类(Cox和Coulter，1997；Gupta和Siber，1995；Hughes和Babiuk，1994)。广义而言有两大类，颗粒状或非颗粒状佐剂。在颗粒状佐剂中有铝盐、钙盐、油包水乳液、水包油乳液、免疫刺激复合物(ISCOM)和ISCOM基质、脂质体、纳米和微米颗粒、蛋白质体、病毒颗粒、硬酯酰酪氨酸和-菊粉。非颗粒佐剂包括胞壁酰二肽(MDP)和衍生物(如苏氨酰MDP、胞壁肽等)、非离子嵌段共聚物、皂苷(如Quil A和QS21)、脂类A或其衍生物4′一磷酯酰脂A(MPL)、二霉菌酸海藻糖脂(TDM)、各种细胞因子(包括γ-干扰素和白细胞介素2或4)、糖类聚合物、衍生的多糖(如二乙基氨基乙基葡萄糖)等。现代佐剂制剂常常设计成各种成分的组合以产生最大的特异性免疫应答。
在本发明的一个实施方案中，使用ORF8区域经过改造的SARS减毒病毒或灭活疫苗制备疫苗组合物。病毒可与冷冻防护添加剂或稳定剂混合，例如蛋白质(如白蛋白、明胶)、糖(如蔗糖、乳糖、山梨糖醇)、氨基酸(如谷氨酸钠)、盐水或其它保护剂。将这种混合物维持在液体状态，或然后干燥或冻干以便运输和保存，在使用前再临时与水混合。
包含本发明ORF8区域经过改造的SARS病毒的制剂可以用来免疫人或动物，以诱导产生抗SARS冠状病毒感染的保护力。
为了激发免疫应答，必须给予个体以合适次数的足量疫苗。本领域熟练技术人员能容易地确定该用量和剂次。给药可以通过任一常规有效方式，例如鼻内、肠胃外、经口或局部施用于粘膜表面，例如通过气溶胶喷雾。较佳的施用方式是肠胃外给药。
鉴于ORF8与SARS冠状病毒传染力之间的关系，ORF8区域可作为快速地确定SARS冠状病毒的传染力的标志物，并且可用作筛选预防和治疗严重急性呼吸综合征的药物的靶点，还可用于提高早期和果子狸SARS冠状病毒的体外培养水平，因此具有广泛的应用前景。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
SARS冠状病毒基因组分型检测试剂盒的制备
制备一试剂盒，它含有：
名称 序列(5′→3′) 编号 浓度
正向引物 atgaatgagc tcactttaat SEQ ID NO：3 干粉2OD
反向引物 ttaatttgtt cgtttattta SEQ ID NO：4 干粉2OD
PCR反应液 含Taq酶dNTP镁离子PCR反应缓冲液
实施例2
对SARS冠状病毒传染力和基因组分型的检测
用实施例1中的试剂盒，对待测的三种SARS冠状病毒病毒株(盲法)进行PCR扩增(请稍详细地描述一下检测过程)，然后对扩增产物进行序列测定。根据ORF8区域是否缺失确定其传染力大小。
检测结果与三种SARS冠状病毒病毒株的实际传染力大小(即临床上传染人数)相符，此外，根据缺失而确定的SARS冠状病毒基因型完全正确。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>国家人类基因组南方研究中心
广东省疾病预防控制中心
<120>SARS冠状病毒ORF8区域的应用
<130>040485
<160>4
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>29751
<212>DNA
<213>SARS冠状病毒(SARS coronavirus)
<400>1
atattaggtt tttacctacc caggaaaagc caaccaacct cgatctcttg tagatctgtt 60
ctctaaacga actttaaaat ctgtgtagct gtcgctcggc tgcatgccta gtgcacctac 120
gcagtataaa caataataaa ttttactgtc gttgacaaga aacgagtaac tcgtccctct 180
tctgcagact gcttacggtt tcgtccgtgt tgcagtcgat catcagcata cctaggtttc 240
gtccgggtgt gaccgaaagg taagatggag agccttgttc ttggtgtcaa cgagaaaaca 300
cacgtccaac tcagtttgcc tgtccttcag gttagagacg tgctagtgcg tggcttcggg 360
gactctgtgg aagaggccct atcggaggca cgtgaacacc tcaaaaatgg cacttgtggt 420
ctagtagagc tggaaaaagg cgtactgccc cagcttgaac agccctatgt gttcattaaa 480
cgttctgatg ccttaagcac caatcacggc cacaaggtcg ttgagctggt tgcagaaatg 540
gacggcattc agtacggtcg tagcggtata acactgggag tactcgtgcc acatgtgggc 600
gaaaccccaa ttgcataccg caatgttctt cttcgtaaga acggtaataa gggagccggt 660
ggtcatagct atggcatcga tctaaagtct tatgacttag gtgacgagct tggcactgat 720
cccattgaag attatgaaca aaactggaac actaagcatg gcagtggtgc actccgtgaa 780
ctcactcgtg agctcaatgg aggtgcagtc actcgctatg tcgacaacaa tttctgtggc 840
ccagatgggt accctcttga ttgcatcaaa gattttctcg cacgcgcggg caagtcaatg 900
tgcactcttt ccgaacaact tgattacatc gagtcgaaga gaggtgtcta ctgctgccgt 960
gaccatgagc atgaaattgc ctggttcact gagcgctctg ataagagcta cgagcaccag 1020
acacccttcg aaattaagag tgccaagaaa tttgacactt tcaaagggga atgcccaaag 1080
tttgtgtttc ctcttaactc aaaagtcaaa gtcattcaac cacgtgttga aaagaaaaag 1140
actgagggtt tcatggggcg tatacgctct gtgtaccctg ttgcatctcc acaggagtgt 1200
aacaatatgc acttgtctac cttgatgaaa tgtaatcatt gcgatgaagt ttcatggcag 1260
acgtgcgact ttctgaaagc cacttgtgaa cattgtggca ctgaaaattt agttattgaa 1320
ggacctacta catgtgggta cctacctact aatgctgtag tgaaaatgcc atgtcctgcc 1380
tgtcaagacc cagagattgg acctgagcat agtgttgcag attatcacaa ccactcaaac 1440
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tatgttggct gctataataa gcgtgcctac tgggttcctc gtgctagtgc tgatattggc 1560
tcaggccata ctggcattac tggtgacaat gtggagacct tgaatgagga tctccttgag 1620
atactgagtc gtgaacgtgt taacattaac attgttggcg attttcattt gaatgaagag 1680
gttgccatca ttttggcatc tttctctgct tctacaagtg cctttattga cactataaag 1740
agtcttgatt acaagtcttt caaaaccatt gttgagtcct gcggtaacta taaagttacc 1800
aagggaaagc ccgtaaaagg tgcttggaac attggacaac agagatcagt tttaacacca 1860
ctgtgtggtt ttccctcaca ggctgctggt gttatcagat caatttttgc gcgcacactt 1920
gatgcagcaa accactcaat tcctgatttg caaagagcag ctgtcaccat acttgatggt 1980
atttctgaac agtcattacg tcttgtcgac gccatggttt atacttcaga cctgctcacc 2040
aacagtgtca ttattatggc atatgtaact ggtggtcttg tacaacagac ttctcagtgg 2100
ttgtctaatc ttttgggcac tactgttgaa aaactcaggc ctatctttga atggattgag 2160
gcgaaactta gtgcaggagt tgaatttctc aaggatgctt gggagattct caaatttctc 2220
attacaggtg tttttgacat cgtcaagggt caaatacagg ttgcttcaga taacatcaag 2280
gattgtgtaa aatgcttcat tgatgttgtt aacaaggcac tcgaaatgtg cattgatcaa 2340
gtcactatcg ctggcgcaaa gttgcgatca ctcaacttag gtgaagtctt catcgctcaa 2400
agcaagggac tttaccgtca gtgtatacgt ggcaaggagc agctgcaact actcatgcct 2460
cttaaggcac caaaagaagt aacctttctt gaaggtgatt cacatgacac agtacttacc 2520
tctgaggagg ttgttctcaa gaacggtgaa ctcgaagcac tcgagacgcc cgttgatagc 2580
ttcacaaatg gagctatcgt tggcacacca gtctgtgtaa atggcctcat gctcttagag 2640
attaaggaca aagaacaata ctgcgcattg tctcctggtt tactggctac aaacaatgtc 2700
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gaagttcaag gttacaagaa tgtgagaatc acatttgagc ttgatgaacg tgttgacaaa 2820
gtgcttaatg aaaagtgctc tgtctacact gttgaatccg gtaccgaagt tactgagttt 2880
gcatgtgttg tagcagaggc tgttgtgaag actttacaac cagtttctga tctccttacc 2940
aacatgggta ttgatcttga tgagtggagt gtagctacat tctacttatt tgatgatgct 3000
ggtgaagaaa acttttcatc acgtatgtat tgttcctttt accctccaga tgaggaagaa 3060
gaggacgatg cagagtgtga ggaagaagaa attgatgaaa cctgtgaaca tgagtacggt 3120
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gttgaggaag aagaagagga agactggctg gatgatacta ctgagcaatc agagattgag 3240
ccagaaccag aacctacacc tgaagaacca gttaatcagt ttactggtta tttaaaactt 3300
actgacaatg ttgccattaa atgtgttgac atcgttaagg aggcacaaag tgctaatcct 3360
atggtgattg taaatgctgc taacatacac ctgaaacatg gtggtggtgt agcaggtgca 3420
ctcaacaagg caaccaatgg tgccatgcaa aaggagagtg atgattacat taagctaaat 3480
ggccctctta cagtaggagg gtcttgtttg ctttctggac ataatcttgc taagaagtgt 3540
ctgcatgttg ttggacctaa cctaaatgca ggtgaggaca tccagcttct taaggcagca 3600
tatgaaaatt tcaattcaca ggacatctta cttgcaccat tgttgtcagc aggcatattt 3660
ggtgctaaac cacttcagtc tttacaagtg tgcgtgcaga cggttcgtac acaggtttat 3720
attgcagtca atgacaaagc tctttatgag caggttgtca tggattatct tgataacctg 3780
aagcctagag tggaagcacc taaacaagag gagccaccaa acacagaaga ttccaaaact 3840
gaggagaaat ctgtcgtaca gaagcctgtc gatgtgaagc caaaaattaa ggcctgcatt 3900
gatgaggtta ccacaacact ggaagaaact aagtttctta ccaataagtt actcttgttt 3960
gctgatatca atggtaagct ttaccatgat tctcagaaca tgcttagagg tgaagatatg 4020
tctttccttg agaaggatgc accttacatg gtaggtgatg ttatcactag tggtgatatc 4080
acttgtgttg taataccctc caaaaaggct ggtggcacta ctgagatgct ctcaagagct 4140
ttgaagaaag tgccagttga tgagtatata accacgtacc ctggacaagg atgtgctggt 4200
tatacacttg aggaagctaa gactgctctt aagaaatgca aatctgcatt ttatgtacta 4260
ccttcagaag cacctaatgc taaggaagag attctaggaa ctgtatcctg gaatttgaga 4320
gaaatgcttg ctcatgctga agagacaaga aaattaatgc ctatatgcat ggatgttaga 4380
gccataatgg caaccatcca acgtaagtat aaaggaatta aaattcaaga gggcatcgtt 4440
gactatggtg tccgattctt cttttatact agtaaagagc ctgtagcttc tattattacg 4500
aagctgaact ctctaaatga gccgcttgtc acaatgccaa ttggttatgt gacacatggt 4560
tttaatcttg aagaggctgc gcgctgtatg cgttctctta aagctcctgc cgtagtgtca 4620
gtatcatcac cagatgctgt tactacatat aatggatacc tcacttcgtc atcaaagaca 4680
tctgaggagc actttgtaga aacagtttct ttggctggct cttacagaga ttggtcctat 4740
tcaggacagc gtacagagtt aggtgttgaa tttcttaagc gtggtgacaa aattgtgtac 4800
cacactctgg agagccccgt cgagtttcat cttgacggtg aggttctttc acttgacaaa 4860
ctaaagagtc tcttatccct gcgggaggtt aagactataa aagtgttcac aactgtggac 4920
aacactaatc tccacacaca gcttgtggat atgtctatga catatggaca gcagtttggt 4980
ccaacatact tggatggtgc tgatgttaca aaaattaaac ctcatgtaaa tcatgagggt 5040
aagactttct ttgtactacc tagtgatgac acactacgta gtgaagcttt cgagtactac 5100
catactcttg atgagagttt tcttggtagg tacatgtctg ctttaaacca cacaaagaaa 5160
tggaaatttc ctcaagttgg tggtttaact tcaattaaat gggctgataa caattgttat 5220
ttgtctagtg ttttattagc acttcaacag cttgaagtca aattcaatgc accagcactt 5280
caagaggctt attatagagc ccgtgctggt gatgctgcta acttttgtgc actcatactc 5340
gcttacagta ataaaactgt tggcgagctt ggtgatgtca gagaaactat gacccatctt 5400
ctacagcatg ctaatttgga atctgcaaag cgagttctta atgtggtgtg taaacattgt 5460
ggtcagaaaa ctactacctt aacgggtgta gaagctgtga tgtatatggg tactctatct 5520
tatgataatc ttaagacagg tgtttccatt ccatgtgtgt gtggtcgtga tgctacacaa 5580
tatctagtac aacaagagtc ttcttttgtt atgatgtctg caccacctgc tgagtataaa 5640
ttacagcaag gtacattctt atgtgcgaat gagtacactg gtaactatca gtgtggtcat 5700
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atgtcagagt acaaaggacc agtgactgat gttttctaca aggaaacatc ttacactaca 5820
accatcaagc ctgtgtcgta taaactcgat ggagttactt acacagagat tgaaccaaaa 5880
ttggatgggt attataaaaa ggataatgct tactatacag agcagcctat agaccttgta 5940
ccaactcaac cattaccaaa tgcgagtttt gataatttca aactcacatg ttctaacaca 6000
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tctgtcacat tcttcccaga cttgaatggc gatgtagtgg ctattgacta tagacactat 6120
tcagcgagtt tcaagaaagg tgctaaatta ctgcataagc caattgtttg gcacattaac 6180
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acaaagccag tagatacttc aaattcattt gaagttctgg cagtagaaga cacacaagga 6300
atggacaatc ttgcttgtga aagtcaacaa cccacctctg aagaagtagt ggaaaatcct 6360
accatacaga aggaagtcat agagtgtgac gtgaaaacta ccgaagttgt aggcaatgtc 6420
atacttaaac catcagatga aggtgttaaa gtaacacaag agttaggtca tgaggatctt 6480
atggctgctt atgtggaaaa cacaagcatt accattaaga aacctaatga gctttcacta 6540
gccttaggtt taaaaacaat tgccactcat ggtattgctg caattaatag tgttccttgg 6600
agtaaaattt tggcttatgt caaaccattc ttaggacaag cagcaattac aacatcaaat 6660
tgcgctaaga gattagcaca acgtgtgttt aacaattata tgccttatgt gtttacatta 6720
ttgttccaat tgtgtacttt tactaaaagt accaattcta gaattagagc ttcactacct 6780
acaactattg ctaaaaatag tgttaagagt gttgctaaat tatgtttgga tgccggcatt 6840
aattatgtga agtcacccaa attttctaaa ttgttcacaa tcgctatgtg gctattgttg 6900
ttaagtattt gcttaggttc tctaatctgt gtaactgctg cttttggtgt actcttatct 6960
aattttggtg ctccttctta ttgtaatggc gttagagaat tgtatcttaa ttcgtctaac 7020
gttactacta tggatttctg tgaaggttct tttccttgca gcatttgttt aagtggatta 7080
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ctagacttga caattttagg tctggccgct gagtgggttt tggcatatat gttgttcaca 7200
aaattctttt atttattagg tctttcagct ataatgcagg tgttctttgg ctattttgct 7260
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cccgtttctg caatggttag gatgtacatc ttctttgctt ctttctacta catatggaag 7380
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aatcgtgcca cacgcgttga gtgtacaact attgttaatg gcatgaagag atctttctat 7500
gtctatgcaa atggaggccg tggcttctgc aagactcaca attggaattg tctcaattgt 7560
gacacatttt gcactggtag tacattcatt agtgatgaag ttgctcgtga tttgtcactc 7620
cagtttaaaa gaccaatcaa ccctactgac cagtcatcgt atattgttga tagtgttgct 7680
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catccgctct cccattttgt caatttagac aatttgagag ctaacaacac taaaggttca 7800
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tctgcttctg tgtactacag tcagctgatg tgccaaccta ttctgttgct tgaccaagct 7920
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gacacctttt cagcaacttt tagtgttcct atggaaaaac ttaaggcact tgttgctaca 8040
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gctgcccgac aaggtgttgt tgataccgat gttgacacaa aggatgttat tgaatgtctc 8160
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acctataata aggttgaaaa catgacgccc agagatcttg gcgcatgtat tgactgtaat 8280
gcaaggcata tcaatgccca agtagcaaaa agtcacaatg tttcactcat ctggaatgta 8340
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aacaacatac cttttagact aacttgtgct acaactagac aggttgtcaa tgtcataact 8460
actaaaatct cactcaaggg tggtaagatt gttagtactt gttttaaact tatgcttaag 8520
gccacattat tgtgcgttct tgctgcattg gtttgttata tcgttatgcc agtacataca 8580
ttgtcaatcc atgatggtta cacaaatgaa atcattggtt acaaagccat tcaggatggt 8640
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gcatggttta gccagcgtgg tggttcatac aaaaatgaca aaagctgccc tgtagtagct 8760
gctatcatta caagagagat tggtttcata gtgcctggct taccgggtac tgtgctgaga 8820
gcaatcaatg gtgacttctt gcattttcta cctcgtgttt ttagtgctgt tggcaacatt 8880
tgctacacac cttccaaact cattgagtat agtgattttg ctacctctgc ttgcgttctt 8940
gctgctgagt gtacaatttt taaggatgct atgggcaaac ctgtgccata ttgttatgac 9000
actaatttgc tagagggttc tatttcttat agtgagcttc gtccagacac tcgttatgtg 9060
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gtaacaactt ttgatgctga gtactgtaga catggtacat gcgaaaggtc agaagtaggt 9180
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catgttgttg ctgctaatgc acttttgttt ttgatgtctt tcactatact ctgtctggta 9480
ccagcttaca gctttctgcc gggagtctac tcagtctttt acttgtactt gacattctat 9540
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gtgccttttt ggataacagc aatctatgta ttctgtattt ctctgaagca ctgccattgg 9660
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gagacactgt tgccacttac acagtataac aggtatcttg ctctatataa caagtacaag 9840
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aaggctctaa atgactttag caactcaggt gctgatgttc tctaccaacc accacagaca 9960
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gttgaagggt gcatggtaca agtaacctgt ggaactacaa ctcttaatgg attgtggttg 10080
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gttcaacttc gtgttattgg ccattctatg caaaattgtc tgcttaggct taaagttgat 10260
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cttggtatta tggcaattgc tgcatgtgct atgctgcttg ttaagcataa gcacgcattc 11100
ttgtgcttgt ttctgttacc ttctcttgca acagttgctt actttaatat ggtctacatg 11160
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ttagttattt ctgtaacctc taactattct ggtgtcgtta cgactatcat gtttttagct 11460
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ttacagtgta tcatgcttgt ttattgtttc ttaggctatt gttgctgctg ctactttggc 11580
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tctacacaag aatttaggta tatgaactcc caggggcttt tgcctcctaa gagtagtatt 11700
gatgctttca agcttaacat taagttgttg ggtattggag gtaaaccatg tatcaaggtt 11760
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gttctcaaaa agttaaagaa atctttgaat gtggctaaat ctgagtttga ccgtgatgct 12180
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gattatggta cctacaagaa cacttgtgat ggtaacacct ttacatatgc atctgcactc 12480
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atggacaatt caccaaattt ggcttggcct cttattgtta cagctctaag agccaactca 12600
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catccaaatc ctaaaggatt ctgtgacttg aaaggtaagt acgtccaaat acctaccact 13260
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cttgctgtaa cttatcacac cgtttctaca ggttagctaa cgagtgtgcg caagtattaa 15360
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