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1、10申请公布号CN104250659A43申请公布日20141231CN104250659A21申请号201410472021322申请日20140916C12P13/08200601C12R1/19200601C12R1/13200601C12R1/1520060171申请人安徽丰原发酵技术工程研究有限公司地址233030安徽省蚌埠市淮上区怀五路南侧72发明人尚海涛徐斌杨为华邓远德张家泉张雪锋穆晓玲74专利代理机构北京路浩知识产权代理有限公司11002代理人王文君54发明名称一种L赖氨酸的发酵方法57摘要本发明涉及发酵领域，特别涉及一种L赖氨酸的发酵方法。本发明的发酵方法，包括以下步骤将赖氨。
2、酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵溶液。本发明提供的L赖氨酸的发酵方法够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。51INTCL权利要求书1页说明书9页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书9页10申请公布号CN104250659ACN104250659A1/1页21一种L赖氨酸的发酵方法，包括以下步骤将。
3、赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵。2根据权利要求1所述的发酵方法，其特征在于，包括以下步骤1赖氨酸一级种子培养赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基在一级种子罐中培养，一级种子罐中氯化铵的初始浓度为812G/L，当一级种子培养基中总糖浓度下降至815G/L时，停止培养，得成熟赖氨酸一级种子液；2赖氨酸二级种子培养将成熟赖氨酸一级种。
4、子液接入赖氨酸二级种子培养基在二级种子罐中培养，二级种子罐中氯化铵的初始浓度为1015G/L，当二级种子培养基中还原糖浓度下降至58G/L时，停止培养，得成熟赖氨酸二级种子液；3赖氨酸发酵培养将成熟赖氨酸二级种子液接入赖氨酸发酵培养基中，在流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的条件下，在发酵罐中发酵培养，发酵罐中的氯化铵初始浓度为914G/L，培养4044小时，得L赖氨酸。3根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖2040G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸二氢钾0515G/L，氯化铵812G/L，酵母浸粉510G/L，苏氨酸0406G/L，蛋氨酸0406G/L，味精710。
5、G/L，丙酮酸钠0508G/L。4根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖6080G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸二氢钾0515G/L，氯化铵1015G/L，玉米浆水解液115G/L，毛发水解液115G/L，甜菜糖蜜1015ML/L，苏氨酸0406G/L，蛋氨酸0406G/L。5根据权利要求1或2所述的发酵方法，其特征在于赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖2040G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸0305ML/L,氯化铵914G/L，玉米浆水解液051G/L，毛发水解液051G/L，甜菜糖蜜1015ML/L，甜菜碱0508G/L。6根据权利要求2所述的发酵方法，其特。
6、征在于步骤3流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的方法为发酵培养过程中每24H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至48G/L时，开始流加质量体积浓度为5060葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为48G/L，当发酵液中的氨氮浓度下降为12G/L时，开始流加质量体积浓度为2528氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为12G/L。7根据权利要求6所述的发酵方法，其特征在于流加质量体积浓度为28的氯化铵溶液。8根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于步骤1赖氨酸摇瓶种子的接种量为赖氨酸一级培养基体积的13，培养过程中控制溶氧3050。9根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于步骤2成熟。
7、赖氨酸一级种子液的接种量为赖氨酸二级培养基体积的25，培养过程中控制溶氧3050。10根据权利要求2所述的发酵方法，其特征在于步骤3成熟赖氨酸二级种子液的接种量为赖氨酸发酵培养基体积的1015，培养过程中控制溶氧2540。权利要求书CN104250659A1/9页3一种L赖氨酸的发酵方法技术领域0001本发明涉及发酵领域，特别涉及一种L赖氨酸的发酵方法。背景技术0002L赖氨酸为碱性必需氨基酸，同时也是人体和动物所不能合成的八种必需氨基酸中最重要的一种，故常称为第一限制性氨基酸。人体必需通过日常饮食和补品获得赖氨酸，但由于食物中赖氨酸含量甚低，且在加工过程中易被破坏，造成赖氨酸缺乏。0003L。
8、赖氨酸在医药工业、食品工业、畜牧饲料等领域都有着广泛的应用。在谷类为主的食品中添加一定量的L赖氨酸，可提高其蛋白质的吸收率和营养价值；在饲料中添加L赖氨酸能够提高饲料的利用率；在医药工业上，L赖氨酸一般被用作氨基酸输液，可以作为治疗铅中毒的药物、利尿的辅助治疗剂、血栓预防剂。0004赖氨酸多是通过微生物发酵来制备，具体方法为将赖氨酸发酵菌种接种至发酵罐中，并根据发酵罐发酵液的碳源和氮源的残留量，添加碳源和氮源，以发酵产生赖氨酸。0005经检索发现，公开号为102533891A的发明专利公开了一种可提高终点赖氨酸含量、单罐供酸量和转化率，即提高赖氨酸产能的方法，所述方法具体包括将赖氨酸发酵菌种接。
9、入赖氨酸发酵培养基中，在流加碳源和流加氮源的条件下，进行发酵培养，在发酵培养15小时后，向发酵液中流加营养盐，所述营养盐包括氯化钾、硫酸镁和硫酸锰。0006中国专利CN101104863A公开了一种赖氨酸发酵的方法，该方法包括如下步骤将菌种从斜面试管到大种子瓶培养911小时后移到二级种子罐，种量为0203，培养温度为3840，培养时间为1517小时后移入三级种子罐，种量56，培养911小时后移入发酵罐中进行发酵，在发酵罐接种后，连续流加糖、流加有机氮源，种量为1418，发酵底糖含量。0007但目前赖氨酸制备方法的终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率低，生产成本居高不下。因此，需要开发一种新型的赖。
10、氨酸的制备方法，以提高赖氨酸的发酵效率，降低赖氨酸的生产成本。发明内容0008本发明的目的是提供一种L赖氨酸的发酵方法。0009为达到上述的目的，采用如下的技术方案一种L赖氨酸的发酵方法，包括以下步骤将赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基培养成熟后，再接入赖氨酸二级种子培养基培养，待达到赖氨酸二级种子成熟标准后，接入赖氨酸发酵培养基，在流加碳源和氮源的条件下，进行发酵培养至发酵终点；所述赖氨酸一级种子培养基、赖氨酸二级种子培养基和赖氨酸发酵培养基中的氮源为氯化铵，发酵培养过程中流加的氮源为氯化铵溶液。0010本发明中的赖氨酸摇瓶种子选自产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子、产赖氨酸黄色短杆菌摇瓶种子、产。
11、赖氨酸谷氨酸棒杆菌摇瓶种子中的一种或几种。0011本发明的中的碳源选用现有技术中的所有碳源，例如木薯液化液、玉米液化液、葡说明书CN104250659A2/9页4萄糖溶液、蔗糖溶液、果糖溶液。优选的，以葡萄糖溶液作为碳源。更优选的，以质量体积浓度为5060葡萄糖溶液作为碳源。0012具体的，本发明L赖氨酸的发酵方法包括以下步骤00131赖氨酸摇瓶种子接入赖氨酸一级种子培养基在一级种子罐中培养，一级种子罐中氯化铵的初始浓度为812G/L，当一级种子液中总糖浓度下降至815G/L时，停止培养，得成熟赖氨酸一级种子液；00142将成熟赖氨酸一级种子液接入赖氨酸二级种子培养基在二级种子罐中培养，二级种。
12、子罐中氯化铵的初始浓度为1015G/L，当二级种子液中还原糖浓度下降至58G/L时，停止培养，得成熟赖氨酸二级种子液；00153将成熟赖氨酸二级种子液接入赖氨酸发酵培养基中，在流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的条件下，在发酵罐中发酵培养，发酵罐中的氯化铵初始浓度为914G/L，培养4044小时，得L赖氨酸。0016本发明根据发酵后期不产酸或者产酸较慢来判断发酵终点，培养4044小时可以达到发酵终点，优选培养42小时。0017具体的，步骤3中流加葡萄糖溶液和氯化铵溶液的方法为发酵培养过程中每24H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至48G/L时，开始流加质量体积比为5060。
13、葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为48G/L，当发酵液中的氨氮浓度下降为12G/L时，开始流加质量体积比为2528氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为12G/L。优选的，流加流加质量体积比为28的氯化铵溶液。0018上述L赖氨酸的发酵方法中，总糖浓度、还原糖浓度、氨氮浓度的测定为本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定。0019更具体的，本发明的L赖氨酸的发酵方法中，步骤1赖氨酸摇瓶种子的接种量为赖氨酸一级培养基体积的13，培养过程中控制溶氧3050。可采用如下的控制手段温度3537，罐压005007MPA，通风比104106，搅拌300350RPM，PH6668。0020对赖氨酸一级种子培。
14、养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN。优选的，为了防止在较低PH情况下培养基物料会产生沉淀或不利于发酵的反应，在灭菌前用20氢氧化钾调PH值为6064。0021步骤1中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖2040G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸二氢钾0515G/L，氯化铵812G/L，酵母浸粉510G/L，苏氨酸0406G/L，蛋氨酸0406G/L，味精710G/L，丙酮酸钠0508G/L。优选的，赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖35G/L，硫酸镁07G/L，磷酸二氢钾07G/L，氯化铵11G/L，酵母浸粉7G/L，苏氨酸06G。
15、/L，蛋氨酸046G/L，味精7G/L，丙酮酸钠05G/L。0022本发明的L赖氨酸的发酵方法中，步骤2成熟赖氨酸一级种子液的接种量为赖氨酸二级培养基体积的25，培养过程中控制溶氧3050。可采用如下的控制手段温度3537，罐压005007MPA，通风比104106，搅拌300350RPM，PH6668。0023对赖氨酸二级种子培养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN。优选的，在灭菌前用氨水调PH值为6064。说明书CN104250659A3/9页50024步骤2中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖6080G/L，硫酸镁05。
16、15G/L，磷酸二氢钾0515G/L，氯化铵1015G/L，玉米浆水解液115G/L，毛发水解液115G/L，甜菜糖蜜1015ML/L，苏氨酸0406G/L，蛋氨酸0406G/L。优选的，赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60G/L，硫酸镁05G/L，磷酸二氢钾05G/L，氯化铵11G/L，玉米浆水解液13G/L，毛发水解液13G/L，甜菜糖蜜11ML/L，苏氨酸04G/L，蛋氨酸04G/L。0025本发明的L赖氨酸的发酵方法中，步骤3成熟赖氨酸二级种子液的接种量为赖氨酸发酵培养基体积的1015，培养过程中控制溶氧2540。可采用如下的控制手段温度3537，罐压00701MPA，通风比103105。
17、，搅拌350450RPM，PH6668。0026对赖氨酸发酵培养基的灭菌处理可采用本领域常规的技术手段，本发明对此不作限定，例如可通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN。优选的，在灭菌前用氨水调PH值为6064。0027步骤3中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖2040G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸0305ML/L，氯化铵914G/L，玉米浆水解液051G/L，毛发水解液051G/L，甜菜糖蜜1015ML/L，甜菜碱0508G/L。优选的，赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖30G/L，硫酸镁05G/L，磷酸03ML/L,氯化铵11G/L，玉米浆水解液1G/L，毛发水解液1G/L，甜菜糖蜜10ML/L。
18、，甜菜碱06G/L。0028本发明提供的L赖氨酸的发酵方法够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。具体实施方式0029以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。0030在下述实施例和对比例中0031OD值测定将取样的发酵液稀释25倍，采用7230G可见分光光度计，在波长562NM可见光下测定吸光值。0032按照GB/T500972008的方法测定还原糖的浓度。0033按照GB359583的方法测定铵根离子的浓度。0034按照GB1079489标准测定发酵液中的赖氨酸浓度以赖氨酸盐酸盐计。0035总酸量放罐的赖氨酸浓度放罐体积中间排料的赖氨酸浓度排料体积0036总耗糖量种子罐用糖。
19、重量发酵罐用糖重量，其中发酵罐用糖重量包括，发酵培养基中添加的糖和发酵过程中流加的糖。0037糖酸转化率总酸量/总耗糖量100。0038实施例10039本实施例中L赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下00401、赖氨酸一级种子培养0041配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20G/L，硫酸镁05G/L，磷酸二氢钾15G/L，氯化铵9G/L，酵母浸粉5G/L，苏氨酸05G/L，蛋氨酸05G/L，味精7G/L，丙酮酸钠05G/L。说明书CN104250659A4/9页60042将配制好的赖氨酸一级种子。
20、培养基，用20体积比氢氧化钾溶液调节PH值为60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至36并维持恒定。开搅拌300RPM，按照通风比104通入无菌空气，调节罐压为005MPA，并用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。0043将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至10G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。00442、赖氨酸二级种子培养0045配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二。
21、级种子培养基包括葡萄糖70G/L，硫酸镁1G/L，磷酸二氢钾1G/L，氯化铵10G/L，玉米浆水解液1G/L，毛发水解液1G/L，甜菜糖蜜10ML/L，苏氨酸04G/L，蛋氨酸04G/L。0046将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调节其PH值为62，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌300RPM，按照通风比104通入无菌空气，调节罐压为005MPA，用氨水调节PH值为66并维持恒定，校溶氧100。将步骤1得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧305。
22、0，培养10H后，每隔2H取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。00473、赖氨酸发酵培养0048配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖20G/L，硫酸镁05G/L，磷酸03/L,氯化铵9G/L，玉米浆水解液05G/L，毛发水解液05G/L，甜菜糖蜜10ML/L，甜菜碱05G/L。0049将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20氢氧化钾调节其PH指为56，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至36并维持恒定。开搅拌400RPM，按照通风比103通入无菌空气，调节罐压为007MPA，用氨水调节PH值为。
23、67并维持恒定，校溶氧100。将步骤2得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧2540。0050培养过程中每2H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至4G/L时，开始流加60M/V葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为4G/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至1G/L时，开始流加28M/V氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1G/L左右。赖氨酸发酵培养42H放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。0051实施例20052本实施例中L赖氨酸的。
24、发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下00531、赖氨酸一级种子培养0054配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖40G/L，硫酸镁15G/L，磷酸二氢钾15G/L，氯化铵10G/L，酵母浸粉8G/L，苏氨酸04G/L，蛋氨酸说明书CN104250659A5/9页704G/L，味精9G/L，丙酮酸钠06G/L。0055将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20氢氧化钾调PH60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌350RPM，按照通风比105通入无菌空气，调节罐压为。
25、005MPA，并用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。0056将产赖氨酸谷氨酸棒杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的2接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至12G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。00572、赖氨酸二级种子培养0058配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖80G/L，硫酸镁05G/L，磷酸二氢钾05G/L，氯化铵10G/L，玉米浆水解液12G/L，毛发水解液12G/L，甜菜糖蜜12ML/L，苏氨酸05G/L，蛋氨。
26、酸05G/L。0059将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调PH至60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌350RPM，按照通风比105通入无菌空气，调节罐压为005MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤1得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至5G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。00603、赖氨酸发酵培养0061配制赖氨酸发酵培养基。本。
27、实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖2040G/L，硫酸镁0515G/L，磷酸0305ML/L,氯化铵914G/L，玉米浆水解液051G/L，毛发水解液051G/L，甜菜糖蜜1015ML/L，甜菜碱0508G/L。0062将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20氢氧化钾调PH至56，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌400RPM，按照通风比104通入无菌空气，调节罐压为008MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤2得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的10接到赖氨酸发酵培养基中进行培养。0063培养过程中通过调节转速、风。
28、量、罐压控制溶氧2540，培养过程中每4H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至6G/L时，开始流加60M/V葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为6G/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至15G/L时，开始流加28M/V氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为15G/L左右。赖氨酸发酵培养44H放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。0064实施例30065本实施例中L赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下00661、赖氨酸一级种子培养说明书CN10425065。
29、9A6/9页80067配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖35G/L，硫酸镁07G/L，磷酸二氢钾07G/L，氯化铵11G/L，酵母浸粉7G/L，苏氨酸06G/L，蛋氨酸046G/L，味精7G/L，丙酮酸钠05G/L。0068将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20氢氧化钾调PH63，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌300RPM，按照通风比106通入无菌空气，调节罐压为006MPA，并用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。0069将产赖氨酸黄色短杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的2接到赖氨酸一级种子培养基。
30、中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至9G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。00702、赖氨酸二级种子培养0071配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60G/L，硫酸镁05G/L，磷酸二氢钾05G/L，氯化铵11G/L，玉米浆水解液13G/L，毛发水解液13G/L，甜菜糖蜜11ML/L，苏氨酸04G/L，蛋氨酸04G/L。0072将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调PH至64，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌。
31、300RPM，按照通风比104入无菌空气，调节罐压为006MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤1得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至6G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。00733、赖氨酸发酵培养0074配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖30G/L，硫酸镁05G/L，磷酸03ML/L,氯化铵11G/L，玉米浆水解液1G/L，毛发水解液1G/L，甜菜糖蜜10ML。
32、/L，甜菜碱06G/L。0075将配制好的赖氨酸发酵培养基用20氢氧化钾调PH至60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌350RPM，按照通风比104通入无菌空气，调节罐压为008MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤2得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的15接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧2540。0076培养过程中每2H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至8G/L时，开始流加60M/V葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为8G/L左右，当发。
33、酵液中的氨氮浓度下降至2G/L时，开始流加28M/V氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为2G/L左右。赖氨酸发酵培养42H放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。0077实施例40078本实施例中L赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下说明书CN104250659A7/9页900791、赖氨酸一级种子培养0080配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20G/L，硫酸镁06G/L，磷酸二氢钾06G/L，氯化铵8G/L，酵母浸粉9G/L，苏氨酸045G/L，蛋。
34、氨酸045G/L，味精75G/L，丙酮酸钠07G/L。0081将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20氢氧化钾调PH61，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌320RPM，按照通风比1044通入无菌空气，调节罐压为005MPA，并用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的12接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至10G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。00822、赖氨。
35、酸二级种子培养0083配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖60G/L，硫酸镁058G/L，磷酸二氢钾08G/L，氯化铵11G/L，玉米浆水解液1G/L，毛发水解液1G/L，甜菜糖蜜13ML/L，苏氨酸04G/L，蛋氨酸04G/L。0084将配制好的赖氨酸二级种子培养基，灭菌前用氨水调PH至61，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌350RPM，按照通风比104入无菌空气，调节罐压为005MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤1得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的2接到赖氨酸二级种。
36、子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至5G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。00853、赖氨酸发酵培养0086配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖25G/L，硫酸镁055G/L，磷酸034ML/L,氯化铵9G/L，玉米浆水解液05G/L，毛发水解液05G/L，甜菜糖蜜10ML/L，甜菜碱07G/L。0087将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20氢氧化钾调PH至56，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅450RPM，按照。
37、通风比104通入无菌空气，调节罐压为008MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤2得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的14接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧2540。0088培养过程中每3H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至8G/L时，开始流加50M/V葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为6G/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至2G/L时，开始流加27M/V氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为1G/L左右。赖氨酸发酵培养43H放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖。
38、量和糖酸转化率见表1。0089实施例50090本实施例中L赖氨酸的发酵方法包括赖氨酸一级种子培养、赖氨酸二级种子培养和赖氨酸发酵培养三个步骤。每个步骤的具体操作如下说明书CN104250659A8/9页1000911、赖氨酸一级种子培养0092配制赖氨酸一级种子培养基。本实施例中赖氨酸一级种子培养基包括蔗糖20G/L，硫酸镁06G/L，磷酸二氢钾06G/L，氯化铵85G/L，酵母浸粉6G/L，苏氨酸055G/L，蛋氨酸055G/L，味精7G/L，丙酮酸钠055G/L。0093将配制好的赖氨酸一级种子培养基，用20氢氧化钾调PH60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至3。
39、7并维持恒定。开搅拌300RPM，按照通风比1048通入无菌空气，调节罐压为005MPA，并用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将产赖氨酸大肠杆菌摇瓶种子按赖氨酸一级种子培养基体积的1接到赖氨酸一级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测总糖，当镜检菌体形态正常且总糖下降至8G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟一级种子液。00942、赖氨酸二级种子培养0095配制赖氨酸二级种子培养基。本实施例中赖氨酸二级种子培养基包括葡萄糖80G/L，硫酸镁15G/L，磷酸二氢钾15G/L，氯化铵15G/L，玉米浆水解液15G/L，毛发。
40、水解液15G/L，甜菜糖蜜15ML/L，苏氨酸06G/L，蛋氨酸06G/L。0096将配制好的赖氨酸二级种子培养基，用氨水调PH至60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌350RPM，按照通风比104入无菌空气，调节罐压为005MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤1得到的成熟赖氨酸一级种子液按赖氨酸二级种子培养基体积的4接到赖氨酸二级种子培养基中进行培养，培养过程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧3050，培养10H后，每隔2H取样镜检并测还原糖，当镜检菌体形态正常且还原糖下降至8G/L时停止培养，得到赖氨酸成熟二级种子液。
41、。00973、赖氨酸发酵培养0098配制赖氨酸发酵培养基。本实施例中赖氨酸发酵培养基包括葡萄糖40G/L，硫酸镁15G/L，磷酸05ML/L,氯化铵14G/L，玉米浆水解液1G/L，毛发水解液1G/L，甜菜糖蜜15ML/L，甜菜碱08G/L。0099将配制好的赖氨酸发酵培养基，用20氢氧化钾调PH至60，通水蒸气将培养基升温至121，灭菌20MIN，开循环水降温至37并维持恒定。开搅拌450RPM，按照通风比104通入无菌空气，调节罐压008MPA，用氨水调节PH至67并维持恒定，校溶氧100。将步骤2得到的成熟赖氨酸二级种子液按赖氨酸发酵培养基体积的15接到赖氨酸发酵培养基中进行培养，培养过。
42、程中通过调节转速、风量、罐压控制溶氧2540。0100培养过程中每2H取样测发酵液的还原糖浓度和氨氮浓度，当发酵液中的还原糖浓度下降至7G/L时，开始流加60M/V葡萄糖溶液并维持发酵液的还原糖浓度为7G/L左右，当发酵液中的氨氮浓度下降至2G/L时，开始流加28M/V氯化铵溶液并维持发酵液中的氨氮浓度为2G/L左右。赖氨酸发酵培养42H放罐时，测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。0101对比例10102按照实施例1的方法制备赖氨酸，不同的是，赖氨酸种子罐和发酵罐培养基中的氮源均为硫酸铵，发酵培养过程中流加的氮源为硫酸铵溶液。赖氨酸发酵培养42H放罐时，说明书CN104250659A109/9页11测放罐赖氨酸含量和中间排料的赖氨酸含量，计算总酸量、总糖量和糖酸转化率见表1。0103表1发酵终点的总酸量、总糖量和糖酸转化率01040105从表1可以看出，采用本发明方法发酵生产赖氨酸，能够显著提高终点赖氨酸含量、总酸量和糖酸转化率。0106虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。说明书CN104250659A11。