骨替代材料及其制备方法 【发明领域】
本发明涉及一种结晶很少的合成羟基磷灰石，它可以用作人或动物的骨替代材料或用作其它用途。本发明还涉及用于在低温下形成结晶很少的羟基磷灰石的无定形磷酸盐化合物的合成方法。
【发明背景】
磷酸钙是硬组织(骨头、软骨、齿釉和牙质)的主要成分。天然存在的骨材料是由纳米大小的、结晶很少的具有羟基磷灰石结构的磷酸钙形成的。但是，与理想的化学计量的Ca/P原子比为1.67的结晶羟基磷灰石Ca10(PO4)6(OH)2不同的是，骨矿物质的组成明显不同并且可以由下列通式来表示：
Ca8.3(PO4)4.3(HPO4，CO3)1.7(OH，CO3)0.3
骨矿物质非化学计量主要是由于存在二价离子，如CO32-和HPO42-，它们取代了三价PO43-离子。HPO43-和CO32-离子的取代使Ca/P比发生了变化，从而导致Ca/P比根据年龄和骨头的位置而在1.50-1.70之间变化。通常，Ca/P比在骨头的老化过程中逐渐增加，这就说明碳酸盐地量通常对于较老的骨头增加较多。
正是Ca/Po比，它与纳米晶体尺寸及很低的结晶性能一起使骨矿物质产生特殊的溶解性能。而且由于骨组织承受不断的由矿物质吸收细胞(破骨细胞)和矿物质生成细胞(成骨细胞)调节的组织修复，因此矿物质溶解性能在使这些细胞在活动之间保持良好的代谢平衡方面是特别重要的。
与天然骨矿物质非常相似的人造骨移植材料是天然骨头的一种合适替代品。令人满意的人造骨头应当避免自身骨头(病人自己的骨头)的获得和收集问题以及与同种异基因移植骨头(来自尸体的骨头)有关的危险及复杂性，例如病毒转移的危险。因此，人们不断地尝试合成与天然骨头极其相似的陶瓷材料，以用作植入体。羟基磷灰石是优选的选择对象，这是因为尽管它是一种通常具有较大晶体尺寸的化学计量晶体，但它与天然存在的骨矿物质在化学上极其相似。
理想的人造骨移植物至少必需具有下列四种性能：(1)它必需象羟基磷灰石那样在化学上具有生物兼容性；(2)它必需能提供一定的结构完整性，从而将移植物保持在其位置上并且不被接触，直到病人自己的骨头围绕它长出；(3)它必需是可容形式的以便被吸收，从而使病人自己的骨头取代外来的羟基磷灰石；以及(4)由于必需可以将生物分子导入到该人造骨材料中，所说的生物分子是例如可以促进形成骨头的成骨细胞的骨生长蛋白质，要求用来形成该材料的方法在低温下进行。绝大多数骨生长蛋白质(例如骨形态形成蛋白质)是热敏性的并且在超过体温的温度下会失去生物活性。
通过使用一种其参数，如Ca/P比、晶体尺寸、结晶性能、孔隙率、密度、热稳定性和材料纯度可以控制的材料，可以满足这些要求。
现有技术(LeGerosR.Z.，“口腔生物学与药物中的磷酸钙”卡格尔出版公司，纽约1991)指出高度结晶的羟基磷灰石可以通过溶液沉淀而后在高温(800-1200℃)下烧结而制得。高温处理产生高度化学计量的羟基磷灰石，其晶体尺寸在数微米范围内，Ca/P比为1.67。这种高度结晶的羟基磷灰石具有极低的溶解度，从而它基本上不溶于宿主组织中。因此，它不能被活体骨组织替代并在病人体内过分长的时间保持不变。
现有技术进一步指出羟基磷灰石可以通过基本上结晶的磷酸钙试剂的固相酸碱反应来制备。这种方法导致有时是反应较差的不均匀的材料，该材料相当高的结晶羟基磷灰石含量。
康斯坦斯在美国专利4880610中报导了磷酸钙材料的制备，它是采用高度浓缩的磷酸与一种钙源在碱和羟基磷灰石晶体的存在下进行反应而制备的。所获得的产品是一种多晶材料，它含有结晶羟基磷灰石矿物。类似地，康斯坦斯等人的美国专利5053212公开了采用一种粉状酸来改进酸/碱混合物的操作性和混合性能，但是，它报导了一种与US4880610相似的混合相磷酸钙材料。最近，康斯坦斯等人在科学(第267卷第1796-9页，1995.3.24)中报导了由磷酸一钙一水合物、β-磷酸三钙、α-磷酸三钙和碳酸钙在磷酸钠溶液中的反应而形成碳酸化磷灰石的过程，由此产生一种磷酸钙材料，它仍然基本上比天然存在的骨头矿物质具有更多的晶体。
类似地，布朗等人在US再颁专利33221中报导了结晶磷酸四钙(Ca/P比为2.0)与酸性磷酸钙的反应。刘等人在美国专利5149368中公开了结晶磷酸钙盐与一种酸性柠檬酸盐的反应。
所有这些现有技术公开了一种化学反应，该反应导致了结晶磷酸钙固体，该固体已经由人们通过磷酸钙结晶固体的反应而制得。人们至今尚未报导说采用无定形磷酸钙(Ca/P约为1.5)作为一种反应试剂，这是因为无定形磷酸钙是磷酸钙中最少为人们所知的固体并且常规的无定形磷酸钙大都被人们认为是惰性的、非活性的固体。
在现有技术中仅仅提及采用无定形磷酸钙作为在常规高温处理中形成高度结晶的羟基磷灰石化合物的直接母物。这种高度结晶的材料对于人造骨是不适用的，其原因在于它在生理条件下是高度不可溶解的。
例如，帕尔默等人在US4849193中报导了结晶羟基磷灰石粉末的形成过程，它是通过将一种酸性磷酸钙溶液与一种氢氧化钙溶液反应而制得的，这两种溶液均接近饱和，从而形成一种无定形羟基磷灰石沉淀粉末。然后随即将该无定形粉末干燥并在700-1100℃高温下烧结以获得一种高度结晶的羟基磷灰石。布朗等人在美国再颁专利33221中报导了用作牙齿粘接剂的结晶羟基磷灰石的形成过程，它是将特别限定为磷酸四钙(Ca/P比为2.0)的无定形相与至少一种强酸性磷酸钙反应。另外，布朗等人没有公开这种无定形磷酸四钙的制备过程和性能。唐在US5037639中公开标准无定形磷酸钙浆料在牙齿补充矿物质中的运用。唐提出采用与一种口腔冲洗液或齿糊混合并通过口腔冲洗液或齿糊输送的标准惰性无定形磷酸钙作为一种口香糖、濑口液或牙膏，它在进入口腔液体中时会转变成含有氟化物的结晶羟基磷灰石，这可以用来向齿釉补充矿物质。西姆克斯在PCT/GB93/01519中描述了抑制剂，如Mg离子、焦磷酸根的运用，它们与无定形磷酸钙混合并植入活体组织中。在将例如Mg离子渗入周围的体液中后，无定形磷酸钙-镁转变成结晶羟基磷灰石。
人们仍然需要开发出新型人造骨材料，这种材料更加紧密地与骨头中天然存在的矿物质的性能相似。特别是，人们仍然需要提供这样一种人造骨材料，该材料是可以完全生物吸收的、结晶很少的纳米大小的晶体，它可以在低温下形成。
本发明的概述
本发明的一个目的在于提供一种可以生物吸收的骨替代材料。
本发明的另一个目的在于提供可以在低温下形成并且较容易成型且可注射的骨替代材料。
本发明的进一步的目的在于形成纳米大小的、结晶很少的羟基磷灰石固体，其Ca/P比可以与天然存在的骨矿物质相比较。
本发明的目的在于提供一种将标准惰性无定形磷酸钙转变成活性无定形磷酸钙的方法。
本发明的目的在于提供表面性能与天然存在的骨矿物质的表面活性极为相似的活性无定形磷酸钙。
本发明的另一个目的在于提供一种活性无定形磷酸钙，它可以在低温下(在体温37℃下)形成结晶很少的羟基磷灰石。
本发明的另一个目的在于提供一种可注射的磷酸钙混合物。
在本发明的一个方面，提供了一种获得活性无定形磷酸钙的方法。通过将钙离子、磷酸根离子和第三种离子反应可以制得活性无定形磷酸钙，由此获得一种无定形磷酸钙，然后至少除去部分第三种离子，由此获得活性无定形磷酸钙。
用于本文时，术语“无定形”是指具有明显无定形特性的材料。明显的无定形特性为75％以上的无定形含量，优选地为大于90％的无定形含量并且具有宽的无特征的X-射线衍射图。可以认为在该材料中仍然存在少量结晶，但是可以预测对于本发明的无定形成分，这种结晶不大于在结晶很少的羟基磷灰石磷酸钙产品中所需的结晶度。
用于本文时，术语“活性”是指本发明的无定形磷酸钙与其它磷酸钙的反应性。该活性的特征在于该无定形磷酸钙可以在5小时以内、在37℃下硬化并且可以在约1-5小时内、在磷酸钙或结晶促进剂的存在下基本上硬化。反应的完成、反应的速度、所获得的产品的均匀性以及与其它惰性化合物的反应能力是本发明的活性ACP(无定形磷酸钙)的特性。
本发明的另一方面包括一种至少具有90％无定形特征的活性无定形磷酸钙材料，并且其特征在于当在37℃下在水中作为与二磷酸二钙的1∶1混合物制备时，该混合物在约10-60分钟内硬化。本发明还包括一种活性无定形磷酸钙，它是通过将无定形磷酸钙的碳酸盐预成分(pre-component)热分解成气态或蒸汽付产物以除去该预成分而获得的。本发明还包括一种活性无定形磷酸钙，它是通过将无定形磷酸钙的不稳定成分热分解成气态或蒸汽付产物以除去该不稳定成分而获得的。本发明还包括一种至少具有90％无定形特性的活性无定形磷酸钙材料，并且其特征在于当在37℃下在水中作为与二磷酸二钙的1∶1混合物制备时，该反应在约75分钟内，优选地为40分钟内基本上完成。
本发明的另一个方面提供了一种制备结晶很少的羟基磷灰石的方法，其中本发明的活性无定形磷酸钙与第二种磷酸钙反应。第二种磷酸钙与该活性无定形磷酸钙以一定的比例混合形成一种羟基磷灰石磷酸钙。
本发明的另一方面还提供了一种制备结晶很少的羟基磷灰石的方法，其中本发明的活性无定形磷酸钙与一种促进剂反应。该促进剂选择用来将该活性无定形磷酸钙转变成羟基磷灰石磷酸钙。
本发明的另一方面包括可吸收的骨替代材料，它包括具有基本上如图7d中所示的X-射线衍射图的结晶很少的羟基磷灰石。本发明还包括一种可吸收的骨替代材料，它包括具有下列X-射线衍射图的结晶很少的羟基磷灰石，所说的衍射图包括在2θ为26°、28.5°、32°和33°处的宽峰。本发明还包括一种可吸收的骨替代材料，它包括结晶很少的羟基磷灰石，其特征在于当将其放在鼠肌肉内位置时，在一个月内这种骨替代材料的吸收至少为100毫克，优选为300毫克。
该可吸收的骨替代材料进一步的特征在于当通过无定形磷酸钙与第二种磷酸盐在一种流体的反应而制备时，该反应混合物在约22℃下、在60分钟以上的时间以后硬化并且该反应混合物在37℃下、在约10-60分钟内硬化。在优选的实施方案中，该混合物在约22℃下可以注射约60分钟以上。在其它优选的实施方案中，该混合物在约22℃下在约60分钟以上的时间内可成型。
本发明的另一个方面包括一种适用作为可吸收的骨替代材料的可成型浆料。该浆料包括本发明的活性无定形磷酸钙的混合物和第二种磷酸钙粉末和数量足以提供所需的稠度的流体，所说的混合物能够在约22℃下硬化。
本发明的浆料还包括本发明的活性无定形磷酸钙的混合物和选择用来将该活性无定形磷酸钙转变成羟基磷灰石磷酸钙的一种促进剂和数量足以提供所需的稠度的流体，所说的混合物能够在约22℃下硬化。在优选的实施方案中，所说的混合物在约22℃下、在60分钟以上的时间内能够硬化。并且其中所说的混合物在约37℃下、在约10-60分钟内硬化。
附图简述
将参照下列附图对本发明进行描述，其中：
图1是所述活性无定形磷酸钙的高分辩率透射电子显微图，它表示纳米大小的晶粒群，这些晶粒群具有模糊的边缘并且部分处于无形形状(箭头)；
图2是本发明的活性无定形磷酸钙在加热步骤之前(a)和之后(b)的红外光谱。注意在加热处理以后，H-O-H基团(～3550cm-1和1640cm-1)和CO32-基团(1420-1450cm-1)消失了；
图3是本发明的活性无定形磷酸钙在真空加热步骤之前(a)和之后(b)X-射线衍射图。该材料在真空加热处理之后仍然保持无定形状态。其特征在于在20度和35度衍射角之间没有陡峭的吸收峰和宽的极大值。该固体的无定形状态在本发明的整个工艺过程中一直保持；
图4是本发明的活性无定形磷酸钙在真空加热处理之后的能量分布电子显微光谱，所说的处理工艺产生1.58的Ca/P比；
图5是与结晶羟基磷灰石相比、由本发明的无定形磷酸钙获得的结晶很少的羟基磷灰石的溶解度曲线。可以看到用在37℃下释放到溶液中的钙离子的量计算，本发明的材料的溶解度明显高于较高结晶的羟基磷灰石的溶解度；
图6是活性无定形磷酸钙的X射线衍射图(a)和在用于形成本发明的骨替代材料的反应中所用的二磷酸二钙的X射线衍射图；
图7a-d是活性无定形磷酸钙与二磷酸二钙的混合物反应形成本发明的骨替代材料的过程中的X射线衍射图；
图8是二磷酸二钙(a)、本发明的活性ACP(b)和本发明的结晶很少的HA(c)的红外光谱；以及
图9是天然存在的骨头的X射线衍射图。
本发明的详细描述
本发明提供了一种可以完全吸收并再骨化的结晶很少的羟基磷灰石(HA)，它作为骨替代材料(BSM)，可用于对骨疾病和受伤进行治疗以及用于其它需要可吸收的磷酸钙的生理运用中。本发明的结晶很少的HA其特征在于其生理可吸收性及其最少结晶性。它可以是高度多孔的并且能快速被吸收，也可以是孔隙率较少但可以慢慢被吸收的。其结晶性能基本上与天然骨头相类似，没有在已知的骨替代材料中所看到的高度结晶性。本发明的结晶很少的HA还是生物相容的并且对宿主无害。
在本发明的一个重要方面，相对于本领域内已知的骨替代材料来说，结晶很少的HA特别容易用于外科手术中。更进一步地说，该反应在体外开始进行并且在室温下慢慢进行，从而使该材料在用于手术位置之前就发生硬化由此变得不适用的可能性降至最小。该反应在体温下明显加快并且该材料在某一位置处硬化。此外，结晶很少的HA的稠度和成型性能以及反应速度可以根据治疗需要通过仅改变几个简单参数就可以改变。
本发明的骨替代材料的可吸收性归功于其多孔性与大量无定形特性的结合。本发明的骨替代材料包括结晶很少的羟基磷灰石磷酸钙，该成分基本上类似于在天然骨头中发现的成分。磷灰石缺少结晶在一定程度上与在含水系统中较高的溶解度(与其它结晶较多的材料相比)有关。因此低结晶性和/或稳定的无定形磷灰石区域的存在促进了其在生理系统中的可吸收性。多孔性使细胞渗透并进入该骨替代材料以及物质扩散到基质内部和由基质内部扩散出来均较容易。因此低孔隙率的骨替代材料比高孔隙率的材料在体内吸收更慢。
在优选的实施方案中，反应试剂在体外混合，产生适合用于外科手术位置的可成型骨替代材料。该反应通常在运用到外科手术位置上后完成。本发明的骨替代材料通常在不到5小时的时间内硬化并且在生理条件下基本上在1-5小时，优选地为约10-30分钟内硬化。在优选的实施方案中，该反应是通过将蒸馏水加入到两种干成分的混合物中以形成一种稠浆料而开始的，该浆料在半个小时时间内会硬化。可以采用其它含水试剂，如血清或组织培养介质来代替蒸馏水。最常得到的可吸收的结晶很少的羟基磷灰石是钙磷比低于1.5的低钙物质(羟基磷灰石理想化学计量值约为1.67)。
本发明还提供了鉴别适用的活性骨替代材料和活性母物的试验方法。该试验方法包括将成分组合在一起，产生可成型的物质并验证其在合适的时间内、在体温温度下或其附近硬化的能力。然后将以这种方式硬化的成分放在试验动物的肌肉内并检查其生理可吸收性。在1个月内、在鼠肌肉内将会吸收100毫克，优选地为300毫克本发明的骨替代材料。某些更慢吸收的骨替代材料可能需要一年以上的时间来完全吸收。
骨替代材料的制备反应至少采用一种无定形磷酸钙(ACP)母物，优选地采用一种活化了的ACP母物。在某些情况下，可以仅仅采用一种ACP母物，它可以以可控制的方式部分或全部地转变成本发明的结晶很少的HA(骨替代材料)。另外，该反应可以采用一种或多种附加的母物，优选地为钙和/或磷酸根源，它们与ACP一起产生本发明的结晶很少的羟基磷灰石。在任何情况下，最优选的是采用可以在体外开始、以浆料形式进行并且在37℃下明显加快的反应。
仅仅ACP母物：当采用无定形磷酸钙作为唯一的母物来制备可以吸收的骨替代材料时，重要的一点是控制ACP转化成高度结晶的羟基磷灰石的自然趋势。另一方面，转化的过程必须足够快以适用于外科手术。一种方法是将含有晶体形成抑制剂的ACP(如实施例1中的ACP)与不含晶体形成抑制剂的ACP(如促进剂)混合。将这些试剂在干燥状态下混合，它们具有合适的颗粒尺寸并且含有抑制剂。的ACP是过量的。然后向这些试剂施以形成晶体的条件，如加入水，而后升高温度，例如在导入体内后发生的情况，以使试剂转化成本发明的结晶很少的HA。
ACP母物加上附加的磷酸钙源：采用任何一种反应促进技术，可以将ACP与第二种钙源(包括第二种ACP)反应。被加快的反应是无定形磷酸钙转化成纳米级或结晶很少的羟基磷灰石的反应。这种反应包括酸/碱、位移、取代和水解反应以及纯物理和机械反应(如研磨、混合)。在任何反应方案下，重要的一点是ACP在整个反应中保持明显的无定形特性。更进一步地说，在起始产物中的结晶度不能超过在最终产物中所要求的。因此，某些反应可能需要在反应过程中对ACP的无定形特性进行稳定化处理。已知的合适的晶体形成抑制剂的例子包括碳酸根、氟离子和镁。
在本发明的多种形式中，至少有一种母物必须是活化的，以与其它成分在生理条件下起反应。在某些优选的实施方案中，ACP成分在加热条件下活化，以使其与第二种含钙试剂的反应容易进行。合适的第二种试剂的例子包括DCPD，其它结晶或结晶很少的磷酸钙，钙源或磷酸根源，或第二种ACP。也可以采用本领域内已知的其它活化方法，如催化或采用离子型溶剂，从而促进取代物之间的反应。第二种磷酸钙试剂可以是任何一种晶体结构并且应该选择成可以与第一种ACP直接或通过采用一种反应促进载体，如离子型溶剂起反应。合适的反应条件应通过检测在将试剂混合并加入水以后在37℃下的快速硬化情况来确定。
也可以将骨替代材料形制备应设计成产生多孔的最终产物。在一种实施方案中，酸/碱化学规则加上采用颗粒尺寸受到控制的试剂的干混合物，可以形成多孔骨替代材料。也可以采用其它促进产生多孔的方法，如化学或物理蚀刻和浸洗。
本发明提供了一种新型的将标准惰性无定形磷酸钙沉淀物转变成高度活性无定形固体的方法，该无定形固体可以用于上述反应中，以形成结晶很少或纳米晶体的人造羟基磷灰石，这种材料具有生物活性、生物可吸收性和结构完整性。这种新型无定形材料可以与其它磷酸钙在37℃下或低于37℃下起反应，从而形成由结晶很少的羟基磷灰石组成的类似骨头的材料。
本发明的无定形磷酸钙具有与其它酸性或碱性磷酸钙的高度反应性。另外，本发明的无定形磷酸钙可以认为是活性的，它可以与多种通常被人们认为是对ACP呈惰性的含钙或含磷化合物如CaO、CaCO3和乙酸钙在室温下起反应。常规结晶磷酸钙的酸-碱反应导致反应较差的固体，其反应产物过分结晶以至于不能充分溶解于活组织中。现有技术的反应通常是不完全的并且反应产物是不均匀的。与其相反，本发明的无定形磷酸钙能够与多种磷酸钙和其它含钙或含磷材料快速、完全地起反应，产生均匀的产品。
高活性的来源尚不完全清楚；但是可以认为与无定形(缺少结晶)以及在某些情况下与由本发明的方法产生的材料中的空位有关。这些空位为后面的反应提供了反应位置。这些观点将在下文中作详细讨论。
本发明的方法可以在一开始形成颗粒小于1000埃，优选地为200-500埃，最优选地为300埃的无定形磷酸钙颗粒，这些颗粒的进一步生长受到产物由溶液中快速沉淀的抑制。在钙与磷酸根离子源反应形成无定形磷酸钙的过程中，可以向该溶液中引入第三种离子，从而使这些离子进入无定形沉淀物结构中以代替三价PO43-基团。由于某些PO43-被第三种离子代替，总PO43-下降，从而增加了无定形沉淀物的钙磷比(与标准无定形磷酸钙相比)并改变了磷酸钙的价态或电荷状态。然后，将该无定形固体快速冻干以保存该材料的化学和物理性能。可以将该无定形固体在特定的用来促使至少部分除去第三种离子的条件下进行处理。对于碳酸盐，特定的温度和压力条件会导致碳总量的下降，可能是作为气体二氧化碳和氧气由该无定形固体中逃走，但仍保持其无定形。
所获得的材料是一种无定形的固体，其钙磷比高于通常在无定形磷酸钙中所发现的值，该值在过去一般为1.50。此外，由该材料中除去碳将会在该无定形固体中在其内部结构中产生空位，使之成为高度活性的固体。它可能有几种空位。该材料具有多孔，它们通过多种方式如增加表面积来提高活性。该材料在除去第三种离子后还使化学计量平衡受到改变。这种化学计量变化会导致电荷失衡，这使得该无定形磷酸钙的活性增加。
在整个工艺过程中需要将该材料的无定形性能保持住。如果在该工艺或在最终的产物中在整个区域(单晶区)或者甚至局部区域(微晶区域)中导入结晶，则发现该固体会失去其活性。所获得的高度活性的磷酸钙是无定形的并且其钙磷比为1.55-1.65。在优选的实施方案中，该无定形磷酸钙的钙磷比约为1.58。
通过控制沉淀过程的速度和时间可以引发无定形状态。本发明的无定形羟基磷灰石在起始沉淀快速进行的条件下由溶液中析出。快速沉降会导致形成许多极小的磷酸钙核。另外，快速晶体或晶粒生长会导致在每一个晶粒中产生较多的缺陷，从而增加了溶解度。在光谱的顶端，晶体或晶粒的生长快速而且缺陷密度明显，以至于形成了一种无定形磷酸钙。无定形磷酸钙是凝胶状的并且包括成分不同的固溶体。这些凝胶不具有长程结构，但在以微米刻度测量时它是均匀的。在生理条件下，这些无定形化合物具有较高的溶解度、较高的成型速度和较高的转变成结晶很少的羟基磷灰石的速度。
通过这种方法获得的无定形磷酸钙固体保持其无定形足够长的时间以作为基本上无定形的固体而导入最后的反应中。它们还可以与其它含有磷酸根的固体或溶液混合或反应，从而获得含有均匀分布的纳米大小的晶体的固体。此外，在优选的实施方案中，由于无定形磷酸钙与其它的固体完全反应，因此，所得到的固体的钙磷比由来自该反应的全部的钙和磷组成，即发生了基本上完全的反应。当来自该溶液或固体的适当摩尔浓度的磷酸根与新型无定形磷酸钙材料反应时，可以获得一种结晶很少的羟基磷灰石材料(钙磷比为1.1-1.9)。因此，本发明可以设计并改变最终产物的化学成分，从而提供了一种控制用来作为骨移植材料的最终产物的生物活性的方式。
在本发明的一种实施方案中，制备一种含有钙和磷酸根离子以及第三种离子的溶液，其浓度、pH值和温度可以促使磷酸钙的快速核化和沉淀。当沉淀过程充分快速时，可以形成一种无定形类似凝胶的磷酸钙。由于通过降低反应速度可以提高羟基磷灰石的在热力学上有力的晶体形式，所以可以采取某些增加反应速度的工艺步骤以确保获得无定形的化合物。在设计用于快速沉淀本发明的无定形磷酸钙的溶液时，需要考虑下面几个因素。
优选的条件：钙和磷酸根源的快速混合以增加反应速度。增加反应速度有以利于作为产品的不稳定的相。让每一种离子有更多的反应时间以正确地排列形成一种固体将会导致在热力学上更加有利的结晶和稳定的结构。
优选的钙和磷酸根源：采用高浓度的或接近饱和的溶液可以确保发生更快的反应。
优选的温度：虽然该反应可以在室温下进行，但是，接近沸点的温度以增加一种试剂的浓度可以增加反应速度。
在一种实施方案中，可以将钙离子、磷酸根离子和碳酸根离子的水溶液快速混合，以获得含有碳酸根的无定形磷酸钙固体。离子的相对浓度选择成能够产生具有合适的钙磷比的沉淀物。碳酸根离子取代了无定形磷酸钙中的磷酸根离子。碳酸化的无定形磷酸钙可以通过由碳酸盐水溶液沉淀而获得。适用的碳酸盐水溶液包括，仅是举例，碳酸氢盐溶液、碳酸钠溶液、碳酸钾溶液。采用无水溶液也应认为是在本发明的范围内。
由于通过用CO32-取代PO43-可以改变钙磷比，因此采用含有碳酸根的材料是合适的。另外，CO32-的存在可以阻碍无定形磷酸钙中晶体的发展。但是，应当认为除了碳酸根以外还可以采用其它的离子或离子混合物来代替碳酸根离子，从而改变钙磷比，并且将活性空位导入无定形磷酸钙中，例如采用硝酸根、亚硝酸根、乙酸根、Mg+2和P2O74-离子。
在活化之前可以收集并过滤无定形磷酸钙沉淀物。优选地是在室温或低于室温的温度下进行该步骤，从而保存所收集沉淀物的无定形状态。收集过程典型地可以通过任何一种常规的手段来进行，包括但不限于重力过滤、真空过滤或离心法。所涉及的沉淀物是胶状的并且用蒸馏水洗涤多次。
然后将经过冲洗的沉淀物在任何一种可以保持该材料的无定形特性的条件下干燥。真空冷冻干燥是一种合适的但不是唯一的技术。在冷冻时，该沉淀物在保持冷冻的同时被干燥以除去所包含的水液体。这种方法可以通过将冷冻的沉淀物放入真空室中达一定的时间而实现。冷冻干燥通常在液氮温度下进行12-78小时，优选地为约24小时，其真空范围为10-1-10-4，优选地为10-2托。优选的方法包括真空冷冻干燥，这是因为在真空冷冻干燥中采用的低温可以抑制该材料的进行一步结晶。结果由此获得的无定形磷酸钙是极细的可以自由流动的粉末。
然后可以将经过干燥的ACP活化。在优选的实施方案中，当在ACP中存在碳酸根时，可以将ACP粉末加热以赶走残留的游离水、水合水并除去碳，后者可能是通过将CO32-分解成CO2和氧气而实现的。该加热步骤在低于500℃但高于425℃的温度下进行，从而防止无定形磷酸钙转化成结晶羟基磷灰石。优选地在450-460℃的温度下进行加热。在优选的实施方案中在真空下加热经过冷冻干燥的无定形磷酸钙粉末。在真空环境下，该温度可以稍微低一点，例如在175-225℃范围内，以获得相同的结果。较低的温度也是合适的，这是因为它们可以降低无定形粉末发生结晶的危险。
低结晶和空位(多孔和/或化学计量变化)导致了本发明的无定形磷酸钙具有较高的活性。这一点可以通过下列观察结果来说明。加热到525℃的含有碳酸根的无定形磷酸钙其结晶羟基磷灰石的形成量增加并且相应的其活性下降了。仅仅加热到400℃的无定形磷酸钙保持其无定形特性但是具有较低的活性。这种活性的降低有可能与碳酸根含量较高(以及较少的空位)有关，这一点可以通过对在低温下处理过的样品的IR而看出。这说明无定形和较低的碳含量(空反应位置)均是影响活性的因素。这并不是说在任何情况下它是活性的唯一基础。所看到的活性的其它基础被认为是在本发明的范围内。所得到的无定形磷酸钙粉末是高度活性的无定形磷酸钙材料，其钙磷比在1.1-1.9之间，优选地为约1.55-1.65，最优选地为约1.58。该粉末可以通过多种分析技术来表征。
在图1中表示了高分辩率透射电子显微图，它描述了本发明的优选的活性无定形磷酸钙的形态特征和埃尺寸性能。优选的颗粒尺寸为1000埃以下，更优选地为300-400埃。可以看到与结晶材料不同的是，它有不清晰的边缘，将球状群分开，并且缺少清晰的边缘和表面。图2a和2b表示在真空冷冻干燥(a)以后和在450℃下热处理1小时(b)以后无定形磷酸钙的红外光谱。表示在该材料中存在局部化学基团的红外峰表明在热处理以后H-O-H(在约3400cm-1和1640cm-1处)和CO32-基团(在1420-1450cm-1处)的存在明显减少了。但是，类似材料在图3中的X-射线衍射图表明在真空干燥处理(a)之后的无定形状态在热处理(b)之后基本上未改变。本发明的材料的无定形特性的特征在于具有宽广的吸收峰和不确定的背景，其中在对应于已知的结晶磷酸钙的衍射角的任何位置均没有陡峭的吸收峰。在热处理之后的相同材料上用电子显微探针进行波长分散型X-射线分析，对钙磷比进行测定，结果得到1.58的钙磷比(图4)。
这些特点证明虽然在该无定形磷酸钙固体中某些基团的局部部分发生了变化，但是在该过程中，整个无定形性保持住了。因此，可以说该材料在该无定形结构中含有局部空位或“孔洞”，它们可以使ACP活化。
在另一个优选的实施方案中，可以将高度活性的无定形磷酸钙与一种酸性或碱性磷酸钙反应，从而获得结晶很少的羟基磷灰石。如上所说，羟基磷灰石是热力学上优选的反应产物，它可以很容易结晶产生生物不相容的产物，这是因为其在生理条件下不可溶解。采用可以快速并完全地反应形成没有大量结晶的羟基磷灰石产品的无定形磷酸钙提供了一种获得结晶很少的羟基磷灰石的新方法，这种羟基磷灰石可以在生理条件下被吸收。
本发明的无定形磷酸钙粉末可以与多种第二种成分混合，从而反应形成结晶很少的羟基磷灰石。在将该粉末与多种酸性和碱性磷酸钙在一种流体，例如但不限于水、盐水、缓冲溶液、血清或组织培养介质的存在下混合时该反应可以在室温下发生。根据加入的流体量，本发明的无定形磷酸钙和酸性磷酸钙的混合物导致了一种高度可成型的和/或高度可注射的浆料，其浆料稠度可以变化。
合适的磷酸钙包括酸性和碱性磷酸钙，它们为反应提供了合适的化学计量，从而获得羟基磷灰石磷酸钙。在优选的实施方案中，可以采用一种酸性(pH5-7)磷酸钙。合适的酸性磷酸钙包括但不限于焦磷酸钙、磷酸二钙二水合物、磷酸七钙、磷酸三钙、偏磷酸钙二水合物、结晶很少的HA、偏磷酸钙和磷酸八钙。合适的碱性的磷酸钙包括其它的ACP。可以将其它的固体混合形成最终的产物，从而产生与天然骨头相近的钙磷比，所说的其它固体可以提供磷酸根或钙源，例如CaO、CaCO3、乙酸钙和H3PO4。可以提供无定形或结晶很少状态的第二种成分。
羟基磷灰石是磷酸钙的在热力学上有利的形式。因此，通过加入促进ACP转化成HA的成分而不经过化学反应来促进活性ACP转化成结晶很少的HA属于本发明的范围。合适的促进剂包括但不限于水和热量。
第二种磷酸钙通常是结晶的，正如在X-射线衍射图(图6a)中存在陡峭的磷酸钙常见的吸收峰所看到的那样。与其相反，活性ACP是无定形的并且通过X-射线衍射(图6b)没有看到可以识别的衍射峰。尽管其高度结晶，二磷酸二钙在与活性ACP的反应中被消耗掉并且产物HA具有极低的结晶性。
由于至少一种反应试剂是无定形的并且是高度活性的，该反应在室温下进行，由此提供一种磷灰石材料，该材料具有很少的结晶或微晶结构。该反应基本上是完全的，因此可以确保该混合物中的所有钙和磷酸根被所产生的羟基磷灰石产物消耗掉。这样可以仅仅通过选择起始无定形和第二种磷酸钙的相对比率而可靠地生产羟基磷灰石产品。要求将钙磷比保持在约1.2-1.68下，优选地为低于1.5，最优选的为约1.38。
产物羟基磷灰石材料含有天然骨易变的环境特点。在天然存在的骨头中，矿物的特征在于纳米大小的结构，具有较高的表面积以与周围的组织环境起反应，导致组织的吸收和再成型。本发明采用纳米大小的晶体作为产物，与天然存在的骨矿物质极其相似。此外，在本发明中严格设计了性能如结晶性和钙磷比，以模拟在骨头活组织中发现的矿物性能。
在另一个优选的实施方案中，可以制备一种可以注射的浆料，它可以导入到骨修补位置中。该浆料通常是通过本发明的无定形磷酸钙与第二种成分在数量足以产生注射所需的稠度的水或缓冲液中的混合物而制备的。最常见的是尽可能地稠同时又能通过16-18刻度注射器。由于该浆料中固体成分的无定形性，该材料比现有的组合物明显改进了流动特性。所获得的浆料的流动特性是牙膏状的，而现有的材料具有颗粒或油膏状稠度。如果保持在室温下并且蒸发极小，该浆料可以在使用前几小时制备，通过将该浆料在冰箱中1-10℃的低温下保存，可以延长保存时间，前提是要采取一些步骤使蒸发降至最少。
通过选择适当数量的液体加入到反应试剂中，可以根据需要对骨替代材料浆料的粘度进行控制。该浆料可以以可注射的稠度也可以以可成型的稠度制备。可注射的稠度是指尽可能地稠同时能够通过16-18刻度的针眼。最为常见的是一种象“牙膏”那样的稠度。可成型的稠度是指可以使该材料保持其形状的稠度。在可成型稠度的极端状态下，该浆料具有抹灰或填缝化合物的稠度。该浆料还可以用足够的可以注射和成型的液体来制备。
在某些优选的实施方案(例如下面实施例9-14)中，该反应可以在室温下慢慢发生，但是在体温下将大大加速。这一点特别适用于外科手术情况下，这是因为通过将试剂与水混合而形成的浆料在保持在室温下时保持可注射性达相当长的一段时间(可达几小时)。因此，在室温(如22℃)下，该浆料在1小时以上的时间以后硬化并且保持可成型和/或可注射长达10分钟以上，优选地长达1小时以上，最优选地为长达3小时以上。在注射到植入位置以后(为37℃)，该浆料在约1小时以内，优选地在约10-30分钟硬化。
在本发明的另一个实施方案中，可以将骨再生蛋白(BRP)导入该无定形磷酸钙和酸性磷酸钙混合物中。BRP已经证明可以增加骨生长速度并加快骨愈合。包括纳米晶体或结晶很少的羟基磷灰石和BRP在内的骨移植物甚至可以比单独采用本发明的羟基磷灰石的骨移植物更快地促进骨愈合。通过控制纳米结晶或结晶很少的羟基磷灰石的溶解度从而使其以一定的速度溶解以便以骨生长最佳剂量输送BRP、钙和磷，可以进一步增强BRP的作用。这种导入BRP的方法包括但不限于将含有BRP的缓冲溶液代替蒸馏水混合，该混合液具有最佳的pH值，它可以使蛋白质保持活性。BRP的例子包括但不限于转移生长因子-β、细胞连接因子、内皮的长生因子和骨形成蛋白。这种BRP目前是由马萨诸塞州剑桥的基因研究所，加利福尼亚州帕洛阿尔托的遗传技术研究公司以及马萨诸塞州霍普金顿的创新生物分子研制。
在本发明另一个实施方案中，可以将抗生素或其试剂导入到无定形磷酸钙及其混合物中。从临床上看，由骨移植外科手术产生的一种主要应用是需要控制手术后的发炎或感染。包括结晶很少的羟基磷灰石和抗生素的骨移植物可以降低在手术位置的局部感染机会，从而不会发生感染，由此加快骨愈合过程。通过控制结晶很少的羟基磷灰石的释放从而使其以一定速度溶解从而将抗生肽或其活性成分以最有效的剂量输送到组织修复位置，可以进一步增强抗生素的作用。抗生素例子包括但不限于青霉素、盐酸氯四环(金霉素)、氯霉素和土霉素(土霉素)。抗生素，最常见的是多肽以及骨再生蛋白可以与本发明的结晶很少的羟基磷灰石材料混合，从而以促进骨组织修复的最佳条件局部输送所有或绝大多数必需的成分。
实施例
下面将参照实施例对本发明作进一步描述，这些实施例仅仅是用来进行说明的而不是要对本发明进行限制。实施例1
该实施例描述了将相当惰性的无定形磷酸钙固体转变成本发明的高度活性的无定形磷酸钙的制备过程及方法。
通过在1.3升蒸馏水中快速溶解55克Na2HPO4·7H2O(磷酸钠)、50克氢氧化钠、30克碳酸氢钠，在室温下制备溶液A。也可以采用0.7-1.3毫升的水体积。通过在0.5升蒸馏水中快速溶解43克Ca(NO3)2·4H2O，在室温下制备溶液B。
然后通过将溶液B快速加入到快速搅拌的溶液A中，在室温下制备惰性含有碳酸根的无定形磷酸钙。立即用过滤纸(0.05平方米)以中等过滤速度、约10-2托的真空压力将由此形成的类似凝胶的无定形磷酸钙沉淀物过滤。该材料形成一种薄滤饼。将水加入到过滤漏斗中，用约4升蒸馏水进行冲洗。然后将经过冲洗的材料用刮铲收集并浸入位于2.5升容器中的液氮中。在形成硬的冷冻料块以后，将该容器转移到真空室中达24小时(10-1-10-2托)，直到获得细干粉末。
虽然上述方法可以在室温下进行，但优选地整个方法在低于环境温度(4-5℃)的温度下进行，从而进一步防止无定形状态转变成更加稳定的结晶形式。另外，可以向该溶液中加入痕量已知的作为结晶羟基磷灰石形成抑制剂的成分或离子。举例来说，可以是以MgCl2·6H2O形式低于1.0克的镁离子、以Na4P2O7·10H2O(偏磷酸钠)形式低于2克的偏磷酸根离子。
图2a表示了惰性无定形材料在此时的红外光谱。该光谱含有P-O基团(600和1000cm-1)、CO32-基团(1420-1450cm-1)的特征峰，以及O-H基团(～3550cm-1)相当大的峰。相同材料的X-射线衍射图(图3a)表明该材料是无定形状态的，这一点是通过在用本身的衍射峰与背景的比率来测定结晶性时不存在任何衍射峰而证实的。
上述惰性无定形材料随后通过在450℃(±3℃)下加热60分钟而变成活性形式。经过加热的材料的IR示于图2b中。该光谱表明特定的O-H和CO32-基团减少了，这说明H2O和CO32-作为CO2和O2而明显减少。在类似地制备的样品中，可以看到碳含量下降了约60％，总碳酸根比例由1.56％下降到0.5％。但是可以看到该材料的无定形性能在该过程中没有失去，这一点可以通过如图3(b)所示的X-射线衍射图来证实。在加热处理以后，该材料的钙磷比为1.575，该测定过程采用定量电子显微分析技术(图4)。图1表示无定形材料的总形态和结构性能，它是在透射电子显微镜下观察到的。可以看到该材料具有“无定形”外观，它没有尖锐的边缘将每一个颗粒分开，一部分材料具有无形形状(箭头)。在该材料中可以看到极高的比表面积，120平方米/克，其平均孔尺寸约为130埃。实施例2
如上面实施例1所说进行制备，其不同之处在于溶液A和B的制备用下列反应代替。通过在1.2升含有碳酸根的蒸馏水中快速溶解90.68克Ca(NO3)2·4H2O，在室温下制备溶液A。通过在1.53升含有24ml45％(体积)的KOH溶液的蒸馏水中溶解40.57克K2HPO4，制备溶液B。由该方法获得的产物无定形磷酸钙的化学和物理性能与根据实施例1制得的材料相似。实施例3
如上面实施例1所说进行制备，其不同之处在于溶液A和B的制备用下列反应代替。通过在0.15升含有碳酸根的蒸馏水中快速溶解10.58克Ca(NO3)2·6H2O，在室温下制备溶液A，其pH值为9.0以上，用氢氧化钠进行调整。通过在0.35升蒸馏水中溶解7.8克(NH4)2HPO4，制备溶液B。由该方法获得的产品无定形磷酸钙的化学和物理性能与根据实施例1和2制得的材料相似。实施例4
该实施例描述了本发明的骨替代材料的制备。
以下列方式制备用于该实施例中的磷酸二钙二水合物(DCPD)。通过在500毫升蒸馏水中快速溶解10克H9N2O4P(磷酸氢二氨)，在室温下制备溶液A，其pH值为4.6-4.8。通过在250毫升蒸馏水中溶解17.1克Ca(NO3)2·4H2O，制备溶液B。通过将溶液B快速加入搅拌的溶液A中而在室温下制备磷酸二钙二水合物。此后立即用过滤纸(0.05平方米)以中等过滤速度、约10-2托的真空压力将试样过滤。该材料形成一种薄滤饼，而后用约2升蒸馏水进行冲洗并在室温下干燥24-72小时。
将由实施例1、2或3制得的活性无定形磷酸钙材料与磷酸二钙二水合物以50：50％重量用杵和臼物理干混3-5分钟。然后将水(1毫升/克混合材料)加入到粉末混合物中，以产生象浆糊那样的稠度。水的加入量可以根据需要稠或稀的浆料而变化。然后将该浆料材料放入潮湿的组织环境中，在达到体温(37℃)时，该材料会硬化成固体而不会释放出热量。该硬化过程可以通过将其放入4℃冷藏温度中而延迟几小时。该硬化材料由纳米大小的结晶很少的羟基磷灰石组成，其本身的溶解性超过人造羟基磷灰石材料所报道的溶解性。这一点可以在图5中得到证实，在该图中，在37℃下、24小时以内由本发明的结晶很少的HA材料释放到受控pH缓冲溶液中的钙离子的浓度明显地超过标准的结晶羟基磷灰石材料(曲线52)。实施例5
该实施例说明采用具有选定的颗粒尺寸的材料制备骨替代材料的过程。
将由实施例1、2或3制得的活性无定形磷酸钙材料与颗粒尺寸小于100微米的磷酸二钙二水合物以50∶50％重量物理干混2分钟，采用8505氧化铝陶瓷研磨时，采用SPEX8510实验磨，而后将其筛选成小于100微米的尺寸。将水(1毫升/克混合材料)加入到该粉末混合物中，以产生类似浆料的稠度。实施例6
根据实施例4所说的方法，将由实施例1、2或3制得的活性无定形磷酸钙材料与其它的磷酸钙化合物干混。这些化合物包括但不限于焦磷酸钙、磷酸七钙、偏磷酸钙、磷酸三钙。根据与该活性无定形钙混合的化合物的钙磷摩尔比，对该干混合物的比例进行计算以使钙磷比为1.5-1.70。所得到的材料是结晶很少的羟基磷灰石固体，其溶解性与图5中所表示的相同。实施例7
该实施例描述了用于形成结晶很少的羟基磷灰石固体的可注射浆料的制备过程。
将根据实施例4或6制得的干混材料与蒸馏水(2.3毫升/克)混合。形成一种浆料，该浆料可以很容易地用手成型或通过内径为0.5毫升的喷嘴注射成型。在将该浆料在4℃下冷藏2-3小时以后，其流动性增加。
该材料可以在气封容器中在4℃下以浆料形式贮藏约12小时，不会硬化。实施例8
通过X-射线衍射和IR光谱对产品骨替代材料的晶体含量进行监测。
图7a-d是在DCPT之间的反应产物和如实施例4中所说的活性无定形磷酸钙的X-射线衍射图。将该反应混合物在37℃下放置在潮湿环境中，并在不同的时间通过X-射线衍射光谱进行检测。X-射线扫描条件为(a)铜阴极，(b)λ＝1.4540598埃，以及(c)在0.02度步骤和2秒钟步骤间隔下的扫描范围为20-35度。图8表示磷酸二钙二水合物(a)、本发明的活性ACP(b)和本发明的结晶很少的HA(c)的红外光谱。
图7a-7d的样品分别培养0、20分钟、70分钟和5小时。在所说的时间将样品取出并真空冷冻干燥以保存其化学特性。图7a是在反应开始时获得的，它表示由于起始ACP和二磷酸二钙而引起的衍射峰的结合情况(参见图6，用于组份XRD图)。对结晶二磷酸二钙，可以很容易地看到在20.25度、23.5度、29.5度、30.75度和34.2度有陡峭的衍射峰。当反应时间增加时，陡峭的结晶峰消退并且在26度、28.5度、32.0度和33.0度中心出现宽衍射峰(无定形)。可以看到在反应75分钟以后光谱没有发生变化，这表明该反应在一小时稍多一点的时间里基本上完成。本发明的骨替代材料的X-射线衍射图(图7d)可以与在图9中表示的天然存在的骨头相比较。这两个光谱几乎是相同的，这表明本发明的骨替代材料具有紧密的生物模拟性。实施例9-14
这些实施例证实了流体体积对用于形成骨替代材料的可注射浆料的稠度和活性的影响。每一种浆料的制备如上面实施例7中所说，在室温和37℃下的稠度和反应速度均被测定。其观察结果在表2中报道。
表2用不同水体积制备的1克骨替代材料的成型性能、可注射性和活性实施例水体积(毫升)成型性能可注射性硬化时间(分钟)(4℃/RT/37℃)90.7 - 破碎 - -/-/-100.8* +++易形成浆料 + ＞60/＞60/30110.9* ++ 牙膏 ++ ＞60/＞60/30121.0 + 液体 牙膏 +++ ＞60/＞60/30在某些情况(例如蒸发)下，这些样品在室温下在1小时时间内会干透。在某些情况下，可加入一些水以恢复原来的稠度。实施例13
该研究的目的在于评价模型，以分析在植入新西兰白兔的胫骨上通过外科手术产生的切口中时本发明的结晶很少的羟基磷灰石钙骨替代材料磷酸盐陶瓷材料的效果。I.试验制品和动物
试验制品：所用的试验制品其制备如实施例7所说，其不同之处在于采用对于蛋白质或肽生物活性来说具有最佳的pH(盐水)范围的缓冲溶液。
动物：在该研究中采用切割雄性和雌性成年新西兰白兔(2.5-3.0公斤)。由Pine Acres Rabbitry/Farm获得动物。在开始研究之前将这些动物检疫并驯化至少十天。在从检疫释放之前通过兽医对这些白兔的一般健康情况进行评价。将这些动物单个放在悬空的不锈钢笼中。在笼子的下方在下垂的盘子中采用木屑。采用编号的耳朵标签或刺花以及相应的笼子卡片对这些动物加以识别。所有的动物接受相同的处理，在其一个胫骨中放入一个缺口，评价的时间为0、2、4和8周。
外科手术过程：在获得适当的麻醉以后，采用无菌技术在临近的胫骨上产生一个切口。将软组织翻开，露出骨头。采用低速牙科手钻中的5毫米环钻，如果需要可以冲水(0.9％生理盐水)，将骨片破开并形成植入位置。将骨替代材料浆料(用盐水与α-BSM混合)放入切口中采用该方法向每只动物施加一个样品。采用3-0缝合材料将软组织封闭在料层中。对这些动物进行监视并且在其苏醒时让其服用duprenorphine(0.02-0.05毫克/公斤)和头孢菌素(20毫克/公斤)。在手术以后每天两次服用止痛药和抗生素，服药5-7天。II.试验观察
临床观察和放射图：至少每周对动物的一般健康和行为，特别是其行动进行临床观察。在规定的时间里对胫骨进行拍片，包括在手术以后以及在尸体解剖时。
使这些动物在规定的时间内愈合。将这些动物麻醉以进行胫骨拍片，在整个研究过程中每两周进行一次拍片。采用照片来确定研究时间的长短。大约每两周杀死两只动物并取出试验位置以进行病史研究。每天对这些动物进行监视以察看其饮食或行为是否发生变化。在研究结束时，通过注射过量的安乐死溶液(盐酸开它敏和Xylazine，而后是饱和氯化钾)，将这些动物安乐死。
显微病理学：将植入位置作为未脱钙和脱钙的切片来制备。脱钙的载玻片作为埋入塑料的淡绿色碱性fucsin90微米载玻片而制得；未脱钙的载玻片采用苏木精和曙红和Masson三色进行染色。通过委员会确定的在实验动物病理具有经验的兽医来对载玻片进行显微评价。III.结果
临床观察和放射图：胫骨切口的放射图表明放射密度随着时间而增加。
尸体解剖：胫骨切口位置似乎是随时间而变小。总的来说没有看到在任何外科手术中看到的大量发炎。
显微病理学：在两周时，在切口位置仍可以看到骨替代材料磷酸钙，在该位置和局部噬菌体中均是晶体。在缺口边缘和在缺口位置可以看到小梁骨的一些小刺。4周时，如果能看到装置的晶体，在整个缺口位置可以看到较厚的小梁骨。在6和8周时的样品没有看见装置；在缺口位置看到的骨头是带皮骨头的非常厚的小梁骨。实施例16
该实施例将根据实施例制得的结晶和无定形母物与通过将相同的母物进行反应而制得的最终的结晶很少的HA的红外光谱进行比较。图8a表示按照实施例4所说制备的透钙磷石的IR光谱；图8b表示热处理以后ACP的光谱，它是如实施例1中所说制得的；图8c是如实施例4中所说制得的结晶很少的HA的IR光谱。
应当明白，可以由上面所说的内容中明显看出的目的可以有效地实现并且由于在不脱离本发明的精神和范围的基础上可以在实施上述方法的过程中进行一些变化，因此包含在前面的描述和表示在附图中的所有内容均应认为是用来说明的而不是要进行限定。
还应当明白的是下面的权利要求用来覆盖所说的本发明的一般和特定特征，并且本发明的范围落在这些权利要求中。