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1、(10)申请公布号 CN 104245078 A (43)申请公布日 2014.12.24 C N 1 0 4 2 4 5 0 7 8 A (21)申请号 201380021764.2 (22)申请日 2013.04.22 1250413-0 2012.04.25 SE B01D 15/36(2006.01) B01J 20/26(2006.01) B01J 20/289(2006.01) B01J 39/26(2006.01) G01N 30/96(2006.01) (71)申请人通用电气健康护理生物科学股份公 司 地址瑞典乌普萨拉 (72)发明人 J. 汉斯森 G. 罗德里戈 T. E. 。
2、塞德曼 (74)专利代理机构中国专利代理(香港)有限公 司 72001 代理人初明明 林森 (54) 发明名称 分离方法和分离基质 (57) 摘要 本发明公开将生物分子与液体中的至少一 种其它组分分离的方法，其包括使所述液体与包 含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链 的分离基质接触的步骤。聚合物链包含从结构 CH 2 =CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是 共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或羟基取代 的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。 (30)优先权数据 (85)PCT国际申请进入国家阶段日 2014.10.24 (86)PCT国际申请的申请数据 PCT/SE2013/050。
3、427 2013.04.22 (87)PCT国际申请的公布数据 WO2013/162449 EN 2013.10.31 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书14页 附图9页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书2页 说明书14页 附图9页 (10)申请公布号 CN 104245078 A CN 104245078 A 1/2页 2 1.一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法，所述方法包括使所述液 体与包含固体载体和与所述固体载体结合的聚合物链的分离基质接触的步骤，其中所述聚 合物链包含从结构CH 2 =CH-L-X的第一个单体衍生的单元，。
4、其中L是共价键或包含2-6个碳 原子的烷基醚或羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团。 2.权利要求1的方法，其中所述生物分子是蛋白、肽或核酸。 3.权利要求1或2的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫 球蛋白的蛋白，如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。 4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述至少其它组分是蛋白，例如宿主细胞蛋白； 蛋白A；或免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。 5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液，所 述色谱步骤例如亲和步骤、离子交换步骤、多峰步骤或疏水相互作用步骤。 6.权利要求1。
5、-4中任一项的方法，其中所述液体是来自分离基质的流通液，所述基质 例如离子交换基质、多峰基质或疏水相互作用基质。 7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段 或含免疫球蛋白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白且其中至少1%， 例如至少5%或至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式。 8.前述权利要求中任一项的方法，还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物 分子的步骤。 9.前述权利要求中任一项的方法，还包括用清洗液，例如包含至少0.1 mol/l NaOH或 0.5-2 mol/l NaOH的碱性清洗液，清洗所述分离基质的步骤。 10.前述权。
6、利要求中任一项的方法，其中所述聚合物链是共聚物链且还包含从第二个 非荷电单体衍生的单元。 11.权利要求10的方法，其中第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。 12.权利要求10或11的方法，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、 N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。 13.前述权利要求中任一项的方法，其中L是共价键或-CH 2 -O-L-，其中L是C 2 -C 4 或 C 3 -C 4 亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。 14.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦 酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。 15.权利要求10-14中任一。
7、项的方法，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单 元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。 16.一种分离基质，其包含固体载体和与所述固体载体结合的共聚物链，其中所述共聚 物链包含从以下单体衍生的单元： a) 结构CH 2 =CH-L-X的第一个单体，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或 羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团；和 b) 第二个非荷电单体。 17.权利要求16的分离基质，其中L是共价键或-CH 2 -O-L-，其中L是C 2 -C 4 或C 3 -C 4 亚烷基链，其任选地被至少一个羟基取代。 18.权利要求16或17的。
8、分离基质，其中所述至少一个荷电单体选自乙烯基磺酸盐、乙 权 利 要 求 书CN 104245078 A 2/2页 3 烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基丙基磺酸盐。 19.权利要求16-18中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰 胺。 20.权利要求16-19中任一项的分离基质，其中所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基 吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。 21.权利要求16-20中任一项的分离基质，其中在所述共聚物链中，从第一个单体衍生 的单元与从第二个单体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。 22.权利要求16-21中任一项。
9、的分离基质，其中所述基质的离子容量是20-300微摩尔 /ml，例如20-200或20-80微摩尔/ml。 23.权利要求16-22中任一项的分离基质，其中固体载体包含多羟基聚合物，例如多 糖。 24.权利要求16-23中任一项的分离基质，其中固体载体包含琼脂或琼脂糖。 25.权利要求16-24中任一项的分离基质，其中固体载体是交联的，例如与羟基烷基醚 交联。 26.权利要求16-25中任一项的分离基质，其中固体载体是多孔的，例如呈多孔珠或多 孔膜的形式。 27.权利要求16-26中任一项的分离基质，其中固体载体具有对应于0.5-0.9，例如 0.6-0.8的K D 值的孔径，所述K D 值用。
10、Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。 28.权利要求16-27中任一项的分离基质，其中基质具有对应于0.1-0.8，例如0.2-0.6 的K D 值的孔径，所述K D 值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。 29.一种制备权利要求16-28中任一项的分离基质的方法，包括以下步骤： a) 提供包含具有可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的固体载体； b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触；和 c) 引发基团聚合。 30.权利要求29的方法，其中步骤c)在使得实现以下的条件下进行：形成包含从所述 第一和第二个单体衍生的单元的共聚物链，并通过用所述C=C双。
11、键的共聚合作用或者通过 引发或从易于游离基形成的所述部分的链转移而共价连接至固体载体。 31.权利要求29或30的方法，还包括在步骤a)之前，用包含可共聚的C=C双键的部分 或易于形成游离基的部分衍生所述固体载体的步骤。 32.权利要求29-31中任一项的方法，其中所述包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙 基，例如烯丙基醚基或烯丙基羟基丙基醚基。 33.权利要求29-32中任一项的方法，其中所述易于形成游离基的部分包含i)链转移 基团，例如硫醇基或羟基的位上的氢或ii)引发基团如过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐 或偶氮化合物。 权 利 要 求 书CN 104245078 A 1/14页 4 分离方。
12、法和分离基质 0001 本发明的技术领域 本发明涉及生物分子的分离，和更具体地涉及蛋白的离子交换分离。本发明还涉及适 合于生物分子的分离的分离基质和涉及制备这样的基质的方法。 0002 发明背景 有许多情况需要从液体分离一种化合物，例如污染物或所需的分子。基于电荷-电荷 的相互作用被用于许多领域以捕获并因而分离荷电的或可荷电的化合物。 0003 在化学和生物技术领域，目标化合物如药物或药物候选物通常需要从来源于生产 过程的污染物质中分离。例如，通过重组宿主细胞的表达产生的蛋白药物或药物候选物将 需要例如从宿主细胞和可能的细胞碎片、其它宿主细胞蛋白、DNA、RNA和源自发酵或细胞培 养液的任何其。
13、它化合物中分离。由于其对目标化合物通用性和灵敏性，在许多当前使用的 生物技术纯化方案中，色谱作为至少一个步骤被包括在内。术语色谱包括一系列密切相关 的分离方法，所有这些方法均基于使两个相互不混溶的相接触这一原理。更具体地，目标化 合物被引入流动相，所述流动相与固定相接触。然后目标化合物在其被流动相携带通过系 统时，将经历固定相和流动相之间的一系列相互作用。相互作用利用样品组分的物理或化 学特性的差异。 0004 色谱中的固定相包含配体(其为能够与目标化合物相互作用的官能团)已与之偶 联的固体载体。因此，配体将赋予载体进行分离、鉴定和/或纯化感兴趣的分子的能力。液 相色谱方法通常按照分离化合物所。
14、利用的相互作用原理命名。例如，离子交换色谱是基于 电荷-电荷的相互作用；疏水相互作用色谱(HIC)利用疏水相互作用；和亲和色谱是基于 特异性的生物亲和性。 0005 众所周知，离子交换是基于荷电的目标化合物和相反荷电的色谱基质之间的可逆 相互作用。最常见通过增加盐浓度进行洗脱，但改变pH同样是可能的。离子交换剂分为阳 离子交换剂(其中荷负电的色谱基质用于吸附荷正电的目标化合物)和阴离子交换剂(其 中荷正电的色谱基质用于吸附荷负电的目标化合物)。术语“强“离子交换剂用于在广泛 的pH间隔内荷电的离子交换剂，而“弱“离子交换剂在某些pH值下是可荷电的。一种通 常使用的强阳离子交换剂包括磺酸根(su。
15、lphonate)配体，称为S基团。在某些情况下，这 样的阳离子交换剂按照由官能团及其连接于载体的接头形成的基团命名；例如SP阳离子 交换剂，其中S基团通过丙基连接于载体。 0006 离子交换剂中的荷电基团(通常称为配体)可以不同的方式连接于载体或支持 材料。几篇出版物(US5453186、WO2008145270、US8092682、WO2012015379、EP2412433和 EP2412435)描述了荷电单体如何才能接枝聚合到支持材料上，以形成其中配体存在于与支 持物共价连接的悬挂接枝聚合物链(pendant graft polymer chains)上的离子交换剂。然 而，特别是在生。
16、物加工领域，对分离基质的需求不断增加，因此存在着对进一步开发基质， 特别是关于提供改进的选择性和容量以及在碱性清洗过程中的稳定性的基质的需求。 0007 发明概述 本发明的一个方面是提供一种具有高通量和高选择性的分离方法。这可用如在权利要 说 明 书CN 104245078 A 2/14页 5 求1中定义的方法实现。一个优点是对目标蛋白的高结合容量可与例如单体的和聚集的免 疫球蛋白之间的高选择性一起获得。另外的优点是在升高的离子强度下的高结合容量、快 速的物质传输/结合动力学和高碱稳定性 允许在基质必须被更换之前进行很多次循环 可得以实现。 0008 本发明的另一个方面是提供具有对目标蛋白的高。
17、结合容量和高选择性，以及高碱 稳定性的分离基质。这可使用如在权利要求16中定义的基质实现。 0009 本发明的第三个方面是提供一种制备具有对目标蛋白的高结合容量和高选择性， 以及高碱稳定性的分离基质的方法。这可采用如在权利要求29中描述的方法实现。 0010 本发明的其它合适的实施方案在所附的权利要求书中描述。 0011 附图简述 图1显示用烯丙基缩水甘油醚使载体上的羟基烯丙基化的反应流程。 0012 图2显示用于接枝的以下单体的混合物：a) 乙烯基磺酸(VSA)和乙烯基吡咯烷酮 (VP)、 b) 3-烯丙氧基, 2-羟基-1-丙烷磺酸(APS)和乙烯基吡咯烷酮和 c) 甲基丙烯酸 羟乙基酯(。
18、HEMA)和乙烯基膦酸(VPA)。 0013 图3显示为除去聚集的抗体的理想(实线)选择性曲线和不太理想的(虚线)曲 线。 0014 图4显示对VP-VSA原型S67-G1-A100和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。 0015 图5显示对VP-VSA原型S50-G1-A25和S50-G1-A50与参照物比较的聚集体除去 选择性曲线。 0016 图6显示对VP-VSA原型S50-G2-A25和S50-G3-A25与参照物比较的聚集体除去 选择性曲线。 0017 图7显示对VP-VSA原型S50-G4-A200和S67-G1-A200与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。
19、。初始的聚集体浓度是7%。 0018 图8显示对VP-VSA原型S67-G1-A200、S67-G1-A450和S50-G4-A200与参照物比 较的聚集体除去选择性曲线。初始的聚集体浓度是7%。 0019 图9显示对VP-VSA原型S77-G1-A200和S77-G1-A450与参照物比较的聚集体除 去选择性曲线。 0020 图10显示对VP-VSA原型S80-G1-A200与参照物比较的聚集体除去选择性曲线。 0021 图11显示对基于聚二乙烯基苯的VP-VSA原型P63-G1-A200在pH 5.0下与参照 物比较的聚集体除去选择性曲线。 0022 图12显示对基于聚二乙烯基苯的VP-V。
20、SA原型P63-G1-A200在pH 5.25下与参照 物比较的聚集体除去选择性曲线。 0023 图13显示蛋白混合物和单克隆抗体在 a) 参照基质SP Sepharose HP和b) 本发 明的VPA-接枝基质上的色谱图。 0024 实施方案详述 本发明的一个方面公开一种将生物分子与液体中的至少一种其它组分分离的方法。所 述方法包括使液体与分离基质接触的步骤，所述分离基质包含固体载体和与固体载体结合 的聚合物链，其中聚合物链包含从结构CH 2 =CH-L-X的第一个单体衍生的单元，其中L是 i) 说 明 书CN 104245078 A 3/14页 6 共价键或 ii) 烷基醚或羟基取代的烷基。
21、醚链(其任何一个包含2-6个碳原子)，和X是磺 酸根或膦酸根基团。聚合物链中的这些单元的结构是： 所述生物分子可溶于液体，并且所述其它组分也可溶于液体。接触步骤可例如经输送 液体通过柱、膜吸附剂或用分离基质装填的其它装置发生，但它也可通过例如其中将基质 和液体混合在容器中的分批吸附进行。分离可通过将生物分子或其它组分吸附到基质上而 发生。接触步骤中的pH可例如是4-7，例如4.5-6或4.75-5.5，并且离子强度可以是例如 10-100 mM，例如20-60 mM。液体可以是含水缓冲液并可包含缓冲组分例如乙酸盐、磷酸盐、 柠檬酸盐、琥珀酸盐等和诸如碱金属氯化物、碱金属硫酸盐、硫酸铵等盐。它也。
22、可包含添加 剂如去垢剂、氨基酸、水-可混溶的溶剂、水溶性聚合物、离液剂、cosmotrope等。 0025 在某些实施方案中，生物分子是生物大分子，例如蛋白、肽或核酸。合适的蛋白的 实例包括血浆蛋白、免疫球蛋白和重组蛋白像例如促红细胞生成素、干扰素、凝血因子等， 而肽的实例可以是胰岛素等。生物分子也可以是疫苗抗原，包括病毒颗粒、病毒蛋白、细菌 多糖和细菌蛋白。 0026 在某些实施方案中，生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的 蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白。免疫球蛋白，以及片段和免疫球蛋 白融合蛋白是一类重要的生物药物，本发明的方法特别适合于从这些物质中除去。
23、污染物。 0027 在某些实施方案中，所述至少其它组分是蛋白，例如宿主细胞蛋白、蛋白A或免疫 球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋白的蛋白的聚集体。聚集体的实例可以是例如二聚 体、三聚体和/或更高级的多聚体。本发明的方法特别适合于蛋白-蛋白分离，例如从免疫 球蛋白和相关物质中除去宿主细胞蛋白、蛋白A、聚集体、荷电变体(charge variants)、错 折叠蛋白等。这些污染物的有效清除在生物药物的生产中是必需的，因为它们可引起免疫 原性和其它不需要的副作用。其它组分还可以是例如在细胞培养期间加入的抗生素、内毒 素、病毒或溶剂和为灭活病毒所加入的去垢剂。其它组分还可以是用于形成缀合物的反应 物，。
24、例如，抗体-药物缀合物的药物组分或在PEG-化蛋白的情况下的PEG。 0028 在某些实施方案中，液体是来自先前的色谱步骤的洗脱液，所述色谱步骤例如亲 和步骤、离子交换步骤、多峰(multimodal)步骤或疏水相互作用步骤。本发明的方法特别 适合于除去存在于例如从先前的色谱步骤洗脱的蛋白溶液中残留的污染物。先前的步骤可 以是捕获步骤例如蛋白A或蛋白L色谱步骤，并且残余的污染物可以是例如宿主细胞蛋白、 聚集体、沥出的蛋白A或L或病毒。 0029 在某些实施方案中，液体是来自分离基质的流通液，所述分离基质例如离子交换 基质、多峰基质或疏水相互作用基质。方法可例如在先前的流通色谱步骤，例如在抗体处。
25、理 中的蛋白A步骤后应用的阴离子交换或多峰阴离子交换流通步骤之后应用。 0030 在某些实施方案中，所述生物分子是免疫球蛋白、免疫球蛋白片段或含免疫球蛋 白的蛋白，例如抗体、抗体片段、抗体缀合物或抗体融合蛋白，且其中至少1%，例如至少5% 或至少10%的所述生物分子呈聚集体的形式，例如二聚体、三聚体和更高级的多聚体。方法 特别用于除去聚集体，所述聚集体可在细胞培养期间或者在处理期间产生，例如当免疫球 说 明 书CN 104245078 A 4/14页 7 蛋白在洗脱蛋白A柱期间或在病毒灭活期间暴露于低pH时产生。 0031 在某些实施方案中，该方法还包括用洗脱缓冲液从所述分离基质洗脱所述生物分。
26、 子的步骤。本发明的方法可以结合-洗脱模式进行，在该情况下生物分子被吸附到基质上 和之后用洗脱缓冲液洗脱。其它组分可在流通液中通过基质，或它们可结合至某种程度并 分别地从生物分子中洗脱。可随着缓冲液组成或pH的梯级变化、一系列的梯级变化或者通 过缓冲液组成或pH的梯度进行洗脱。所述方法还可包括使用洗涤缓冲液的洗涤步骤。该 步骤用于除去非结合或松散结合的其它组分的目的，并可例如在接触步骤之后和洗脱步骤 之前应用。洗脱和洗涤缓冲液可包含缓冲物质如乙酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、三羟 甲基氨基甲烷(Tris)、甘氨酸等。它们还可包含中性盐、易溶盐、去垢剂、氨基酸、水-可混 溶的溶剂、水溶性聚合物。
27、、离液剂、cosmotrope和其它添加剂。 0032 该方法也可以流通模式应用，其中其它组分吸附到基质上，而生物分子不吸附或 吸附极弱并可在流通液中以纯化的形式回收。然后可通过应用于基质的剥离缓冲液(strip buffer)除去吸附的其它组分。 0033 在某些实施方案中，该方法还包括用清洗液清洗所述分离基质的步骤。清洗液体 可以是包含至少0.1 mol/l的碱金属氢氧化物如NaOH或KOH的碱性清洗液。它可以是例 如0.5-2 mol/l NaOH或KOH溶液，例如约1 M NaOH的水溶液。除了碱金属氢氧化物外，该 溶液还可包含离液剂、溶剂、去垢剂、盐等以改进清洗效率。本发明方法的特定。
28、优点是可使 用碱性清洗而不引起对基质的降解。包括用碱性清洗液(例如1 M NaOH)清洗步骤的方法 可重复许多次，例如至少10、至少50、10-100或50-100次。这允许在很多次循环中重复使 用基质，这对于良好的处理经济性是重要的。 0034 该方法还可包括另外的后续分离步骤。该方法可例如跟有一个或多个色谱步骤， 例如离子交换、阳离子交换、多峰、羟磷灰石、疏水相互作用或尺寸排阻色谱。该方法还可后 接膜过滤，例如超滤。 0035 在某些实施方案中，聚合物链是共聚物链且还包含从第二个非荷电单体衍生的单 元。共聚物链可以是例如无规共聚物链或它们可具有交替或分段(segmented)结构。在链 中。
29、具有非-荷电单元的一个优点是可控制链的局部电荷密度，其能够改进结合容量和选择 性。通过掺入非-荷电的共聚单体，还可能在基质的生产期间增加缓慢聚合的荷电共聚单 体的掺入。 0036 在某些实施方案中，第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。n-乙烯基酰胺可例如选 自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。这些单 体与CH 2 =CH-L-X单体组合提供有利的链结构，并且聚合物为对碱性降解有高度抗性的。 0037 在某些实施方案中，L是共价键或-CH 2 -O-L-，其中L是C 2 -C 4 或C 3 -C 4 亚烷基链， 其任选地被至少一个羟基取代。当L是共价键时，。
30、X将直接连接于CH 2 =CH基团(并从而连 接于聚合物的主链)，并且当L是-CH 2 -O-L-时，单体将是烯丙基醚。这些结构不含羰基 且赋予聚合物优越的碱稳定性。还显示形成的聚合物有利于提供好的选择性和结合容量。 0038 在某些实施方案中，第一个单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟 基丙基磺酸盐。在某些实施方案中，第一个单体从这组选出，或为乙烯基磺酸盐，并且第二 个单体是N-乙烯基酰胺，例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的组合给出特别的碱稳定聚 合物，以及单体显示出有利的共聚合行为，以致可以制备具有合适量的接枝聚合物和合适 说 明 书CN 104245078 A 5/14页 8 。
31、的离子容量的基质。 0039 在某些实施方案中，在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单 体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。 0040 在某些实施方案中，聚合物或共聚物链通过从烯丙基醚例如烯丙基羟基丙基醚衍 生的接头单元结合至载体。 0041 一方面，本发明公开包含固体载体和与固体载体结合的共聚物链的分离基质，其 中共聚物链包含从以下单体衍生的单元： a) 结构CH 2 =CH-L-X的第一个单体，其中L是共价键或包含2-6个碳原子的烷基醚或 羟基取代的烷基醚链，和X是磺酸根或膦酸根基团，和 b) 第二个非荷电单体。 0042 共聚物链可接枝于固体载。
32、体，对于每条链具有一个或多个与载体的连键。链可例 如基本由第一和第二个单体单元组成，但它们也可包含其它单体单元。共聚物链可具有无 规结构，但它们也可以是交替或分段的。本发明的基质的实施方案适用于上述分离方法。 0043 在某些实施方案中，L是共价键或-CH 2 -O-L-，其中L是C 2 -C 4 或C 3 -C 4 亚烷基链， 其任选地被至少一个羟基取代。如上所述，这些结构提供高的碱抗性并有利于提供高容量 和选择性。 0044 在某些实施方案中，荷电单体选自乙烯基磺酸盐、乙烯基膦酸盐和烯丙氧基羟基 丙基磺酸盐。这些市售可获得的单体适合于接枝并提供好的容量/选择性以及碱稳定性。 0045 在某。
33、些实施方案中，所述第二个非荷电单体是N-乙烯基酰胺。N-乙烯基酰胺与荷 电单体很好地共聚，并得到显著的碱抗性聚合物。这特别适用于环状N-乙烯基酰胺(例如 N-乙烯基内酰胺)。 0046 在某些实施方案中，所述第二个非荷电单体选自N-乙烯基吡咯烷酮、N-乙烯基己 内酰胺、N-乙烯基甲酰胺和N-乙烯基乙酰胺。在某些实施方案中，第一个单体从这组选出， 或为乙烯基磺酸盐，和第二个单体是N-乙烯基酰胺，例如N-乙烯基吡咯烷酮。这些单体的 组合给出特别对碱稳定的聚合物，和所述单体显示出有利的共聚合行为，以致可以制备具 有合适量的接枝聚合物、接枝聚合物的合适组成和合适的离子容量的基质。这些共聚物的 碱稳定性。
34、高于如例如在US20100181254中所描述的丙烯酰胺或(甲基)丙烯酸酯聚合物， 并且虽然单体像乙烯基磺酸盐通常被认为是缓慢聚合或难以聚合的，但发明人的结果表明 接枝聚合的性能是令人吃惊地良好且它们有效地与例如乙烯基吡咯烷酮共聚，以生产具有 高的碱稳定性和好的色谱性质的接枝基质。 0047 在某些实施方案中，在所述共聚物链中，从第一个单体衍生的单元与从第二个单 体衍生的单元的摩尔比是0.05至5，例如0.10至2或0.5至2。摩尔比可通过光谱方法确 定，并且它也可从离子容量和共聚物链的总含量计算出(见下文)。如果硫或磷仅存在于第 一个单体中和氮仅存在于第二个单体中，摩尔比也可从元素分析数据确。
35、定。 0048 在某些实施方案中，基质的(氢)离子容量是15-300或20-300微摩尔/ml，例如 70-300、20-200、20-80或30-70微摩尔/ml。氢离子容量可通过熟知的滴定方法测定。如 果硫或磷仅存在于酸性基团中，离子容量也可从元素分析数据计算。约30-70微摩尔/ml的 离子容量可提供高蛋白容量和高单体-聚集选择性二者，但也可能使用最高可达至少200 微摩尔/ml的离子容量，特别是当需要高蛋白容量时。 说 明 书CN 104245078 A 6/14页 9 0049 基质中(共)聚合物链的总量可以是2-80或2-60 mg/ml，例如4-35、4-20、3-12、 12-。
36、20、20-80或25-75 mg/ml。这可通过光谱方法、通过元素分析(取决于所用的单体)确 定并作为在制备基质期间的重量添加(weight add-on)。相对低的含量(例如2-20 mg/ml) 对于单体-聚合的选择性是有利的，而较高的含量(例如20-80 mg/ml)可提供更高的蛋白 结合容量。 0050 在某些实施方案中，聚合物或共聚物链通过从烯丙基醚例如烯丙基羟基丙基醚衍 生的接头单元结合于载体。链可通过每条链一个或多个这样的接头单元来结合。 0051 在某些实施方案中，固体载体包含多羟基聚合物，例如多糖。多糖的实例包括琼 脂、琼脂糖、角叉菜胶、葡聚糖、纤维素、支链淀粉等，并且其它。
37、多羟基聚合物的实例包括聚 乙烯基醇、聚缩水甘油等。多羟基聚合物载体的优点包括它们的亲水性(其可消除或减少 非特异性相互作用)、它们的碱稳定性和它们形成具有大的表面区域和快速的物质传输的 多孔结构的倾向性。 0052 在某些实施方案中，固体载体包含天然或衍生形式的琼脂或琼脂糖。这些多糖形 成具有良好机械性能和良好物质传输性能的大孔载体以用于生物分离。珠形式的琼脂糖载 体为市售可获得的，例如以Sepharose和Capto的商标名(GE Healthcare Bio-Sciences AB)且它们可例如如在Hjertn等(Biochim Biophys Acta 79, 393-398 (1964。
38、)中所述 制备。载体的孔径可受生产它们所用的琼脂糖溶液浓度控制，并通过交联条件控制至某种 程度。在乳液(或气溶胶)形成期间，通过输入机械能可控制珠的粒度，并且通过筛分制备 多分散性珠材料的部分也是可能的。 0053 在某些实施方案中，固体载体是交联的，例如与羟基烷基醚交联。交联改进刚 性和化学稳定性，因而使用羟基烷基醚交联的优点是它们对碱稳定且不引起与蛋白的 非特异性相互作用。这样的交联可例如通过使用表卤醇(epihalohydrins)、双环氧化 物(diepoxides)和烯丙基卤化物/烯丙基缩水甘油醚作为交联剂产生。例如通过在 US6602990或US7396467中描述的方法制备的高刚。
39、性交联琼脂糖可有利地用作固体载体。 0054 在某些实施方案中，固体载体是多孔的，例如呈多孔珠或多孔膜的形式。 0055 在某些实施方案中，固体载体具有对应于0.5-0.9，例如0.6-0.8的K D 值的孔径， 所述K D 值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。孔径不仅对容量而且对选择性具有 重要性。在溶胀材料如琼脂糖和其它多糖凝胶中，孔径最好通过逆尺寸排阻(inverse size exclusion)色谱方法估算，其中测定探针分子例如Mw 110 kDa的葡聚糖可达到的体积分 数K d 。这种方法在例如L Hagel等: J Chromatogr A 743, 33-42 (。
40、1996)中描述。 0056 在某些实施方案中，分离基质具有对应于0.1-0.8，例如0.2-0.6或0.2-0.4的K d 值的孔径，所述K d 值用Mw 110 kDa的葡聚糖作为探针分子测量。Kd值定义为0和1之间 的值，并且由于所述材料经接枝加入到固体载体中，因此在大多数情况下，基质(含接枝聚 合物)的Kd值将低于在接枝前的固体载体的对应值。0.2和0.6之间或0.2和0.4之间的 Kd值提供良好的聚集体去除并提供高容量。 0057 在一个方面，本发明公开了依据上述任何一个实施方案制备分离基质的方法，该 方法包括以下步骤： a) 提供包含可共聚的C=C双键的部分或易于形成游离基的部分的。
41、固体载体； b) 使固体载体与包含第一和第二个单体的混合物接触；和 说 明 书CN 104245078 A 7/14页 10 c) 引发基团聚合。 0058 载体可固有地包含双键(例如在甲基丙烯酸酯或苯乙烯-二乙烯基苯载体上残留 的双键)或易于形成游离基的部分(例如多羟基聚合物载体中羟基的-氢)或这些部分 的任何一个可如下述引入。基团聚合的引发可通过照射或者通过使用许多已知的引发系统 例如过氧化物引发剂、偶氮引发剂、过硫酸盐、过氧化氢、铈(IV)盐、光引发剂、氧化还原系 统、ATRP等中的一种的热/化学引发来实现。 0059 在某些实施方案中，步骤c)在得以实现以下的条件下进行：形成包含从第一。
42、和第 二个单体衍生的单元的共聚物链，并通过用C=C双键的共聚合作用或者通过引发或从易于 形成游离基的部分的链转移而共价连接于固体载体。 0060 在某些实施方案中，该方法还包括在步骤a)之前用包含可共聚的C=C双键的部分 或易于形成游离基的部分衍生固体载体的步骤。C=C双键可例如由多羟基聚合物中的羟基 与烯丙基化试剂如烯丙基卤化物或烯丙基缩水甘油醚反应而引入。引入C=C双键的方法的 其它实例包括羟基与亲电子试剂如缩水甘油(甲基)丙烯酸酯、乙烯基苄基氯等的反应。易 于形成游离基的部分可以是例如a)引发剂物质，例如氢过氧化物(其通过在氧存在下，经 或E-束照射而形成)或偶氮引发剂(通过与例如偶氮双。
43、氰基戊酸反应而形成)；或b) 链转移基团，例如硫醇基(可例如通过使环氧-活化的载体与二硫醇或硫化物离子反应而 引入)。 0061 在某些实施方案中，包含可共聚的C=C双键的部分是烯丙基，例如烯丙基醚基或 烯丙基羟基丙基醚基。烯丙基在与单体例如乙烯基磺酸或乙烯基膦酸的接枝的组合中，任 选地在与N-乙烯基酰胺单体例如乙烯基吡咯烷酮的组合中是特别有利的，这是因为总的 共聚合率是完全匹配的。 0062 在某些实施方案中，所述易于形成游离基的部分包含：i)链转移基团，例如硫醇 基或羟基的位上的氢；或ii)引发基团如过氧化物、氢过氧化物、过硫酸盐或偶氮化合 物。 0063 如在实施例中所示的，通过在碱性基。
44、质上提供不同浓度的可共聚的双键和通过在 接枝期间提供不同的单体浓度，可控制接枝聚合物的量。通过改变单体组成和通过改变接 枝聚合物的量，可控制离子容量。技术人员应认识到，将需要某些常规实验以用给定的起始 原料达到特定值。 实施例 0064 方法 方法1. 珠的干重 将原型悬浮液的50% (v/v)浆液加入到玻璃滤器中，滤器上带有一个1.00 ml的腔室。 然后通过真空抽吸排干凝胶，和当出现干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排 干的凝胶加入到预称重的用5*20 ml丙酮洗涤的玻璃滤器中。然后将玻璃滤器放入105 的烘箱中经24 h，然后测量干重(4位数)。测量一式两份样品。 006。
45、5 方法2. 离子容量 将约4ml排干的凝胶放入一个小玻璃滤器，然后用总量40ml的0.5M HCl洗涤数次，再 用总量100ml的1mM HC洗涤数次。然后使颗粒达到1ml立方体积，此时经真空抽吸排干凝 说 明 书CN 104245078 A 10 8/14页 11 胶，并当出现干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝胶与20ml蒸馏水一 起加入到40ml烧杯中。然后通过滴定测定1 ml凝胶的氢离子容量。 0066 方法3. 烯丙基含量 将原型悬浮液的50%浆液加入到1ml试管中。然后通过真空抽吸排干凝胶，并当出现 干燥表面时，将凝胶吸干另外30 s。然后将1 ml排干的凝。
46、胶与另外5ml水一起加入到具有 真空配置的250 ml e-烧瓶中。然后在真空抽吸下，用磁力搅拌器搅拌悬浮液，同时加入饱 和的溴水至悬浮液中。然后在真空抽吸下搅拌混合物以除去过量的溴30 min，然后将混合 物加入到30ml滴定杯中。然后使用硝酸银，滴定该混合物中的溴离子。 0067 实施例1. 1-乙烯基-2-吡咯烷酮(VP)和乙烯基磺酸(VSA)的接枝 1 a) 琼脂糖珠载体的烯丙基化 将50g高刚性的排干的琼脂糖珠(依据在US6602990中描述的方法制备)加入到500 ml圆底烧瓶中并通过搅拌在101.4g 50% NaOH水溶液和77.04g蒸馏水中混合。使温度升 高至50达30分钟。
47、。此后，以产生依据表2的AGE/反应物体积比的量加入烯丙基缩水甘 油醚(AGE)，并于50将反应继续过夜17小时。然后过滤出珠并用乙醇(5 x 300 ml)洗 涤，然后用蒸馏水(5 x 300ml)洗涤。 0068 使用4种不同孔径的琼脂糖珠，对应于针对葡聚糖Mw 110 kDa的0.50、0.67、0.77 和0.80的Kd值。使用配备有A-900自动取样器的AKTA TM 探测器进行Kd评价。将Shimadzu RI-检测器(RID-bA)连接于AKTA TM 系统以检测葡聚糖样品。采用以下条件：流速：0.2ml/ min；流动相: 0.2M NaCl；样品体积：100微升。依据本领域熟。
48、知的方法评价葡聚糖峰。然 后将Kd值如下计算为有效孔隙表面的量度：Kd = (Ve - V0)/(Vc - V0 - V凝胶基质) = (Ve - V0)/(Vt - V0)。Ve = 洗脱的葡聚糖的保留体积(ml)，V0 = 空隙体积(原料葡聚 糖空隙标记的保留) (ml), Vc = 计算的柱体积(床高(cm) x 柱表面积(cm 2 ) ) (ml)，Vt = 总液体体积(NaCl的保留体积) (ml)。 0069 还使用相同的方法，相对于葡聚糖Mw 110kD的Kd值，评价一些接枝原型。由于接 枝聚合物链的空隙-填充效果，这些例子中的Kd值一般低于非-接枝载体珠。 0070 1 b) 。
49、接枝 将,偶氮二异丁基脒二盐酸盐(ADBA)引发剂加入到一40 ml玻璃小瓶中，此时 加入17g排干的烯丙基化的珠。然后将蒸馏水、VP和VSA水溶液加入到小瓶中。小瓶用一 个塑料顶部封闭，然后放入一个加热的震摇设备中，其中小瓶于室温下震摇5min，然后将温 度上升至55。聚合反应进行17h过夜，然后将颗粒在玻璃滤器上用8个凝胶体积(GV)的 蒸馏水、8 GV的99.5%乙醇、然后8 GV的水洗涤。 0071 表1. VP-VSA接枝条件 接枝配方浆液浓度w/w% mol/kg浆液mol/kg引发剂浓度%w/w对于单体温度%molVSA/(VP+VSA) G1 45 1,75 0,962 55 62 G2* 45 1,75 0,962 55 62 G3 20 2,55 0,962 55 62 G4 13 2,55 0,962 55 70 *G2：用VSA溶液洗涤凝胶3次，然后将真空排干的凝胶加入到小瓶中 表2. VP-VSA接枝原型 说 明 书CN。