一种汀肝素钠制备工艺.pdf

摘要
申请专利号：	CN201410480869.0	申请日：	2014.09.19
公开号：	CN104262508A	公开日：	2015.01.07
当前法律状态：	实审	有效性：	审中
法律详情：	实质审查的生效IPC(主分类):C08B 37/10申请日:20140919\|\|\|公开
IPC分类号：	C08B37/10	主分类号：	C08B37/10
申请人：	东营天东制药有限公司
发明人：	郭林; 李荣; 李福川; 崔慧斐; 陈少鹏; 于合新
地址：	257000 山东省东营市东营区南二路1236号
优先权：
专利代理机构：	东营双桥专利代理有限责任公司 37107	代理人：	罗文远
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内容摘要

本发明涉及一种汀肝素钠制备工艺。其技术方案是：包括制备肝素钠溶液，制备肝素钠酶溶液，制备肝素钠降解液，制备精制、冻干等步骤，所得产品的重均分子量为5500—7500，分子量小于2000的组分不大于10%，2000~8000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间，抗Ⅹ活性≧110IU/mg。优点是：原料来源丰富、产率高、质量稳定可靠、纯度高、工艺简单、操作方便，无三废排放，产品汀肝素钠具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等功效，疗效显著，可用于预防外科手术后深部静脉血栓形成,预防血液透析和体外循环时静脉血栓的形成,治疗深静脉血栓，使用范围广泛。

权利要求书

权利要求书
1. 一种汀肝素钠制备工艺，其特征是包括以下制备步骤：
（1）、制备肝素钠溶液：
将精品肝素钠溶解为5%~10%浓度的溶液，调节料液pH值7.0~8.0、温度25-30℃；
（2）、制备肝素钠酶解液：
加入上述步骤的精品肝素钠溶液体积的1.0%-3.0%的肝素酶，为液体，酶解时间为1.0~2.0h，间歇搅拌；
反应完成后在线检测其料液232nm的比吸收光度为 0.9~1.2，迅速将料液升温至80.0~95.0℃，0.2~0.5h 终止整个降解反应；
（3）、制备酶解液沉淀物：
将酶解完成的液体制冷，加入酶解液2~3倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；
（4）、制备精品汀肝素钠：
将上述沉淀物溶成10%~15%浓度，用0.22微米的除菌过滤膜进行进一步处理，最终产品进行冷冻干燥得到汀肝素钠。

2. 根据权利要求1所述的汀肝素钠制备工艺，其特征是：步骤3中，通过液相检测主要分子量分布在5500—7500，分子量小于2000的组分不大于10%，2000~8000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间。

说明书

说明书一种汀肝素钠制备工艺
技术领域
本发明涉及一种汀肝素钠制备工艺。
背景技术
    汀肝素钠（Tinzaparin Sodium）低分子钠盐由丹麦利奥公司开发,并于1996年6月上市,商品名Innohep。汀肝素钠1991年在欧洲上市，2000年7月经FDA批准上市。汀肝素钠2013年的全球销售额约6.2亿美元，在低分子肝素类产品中销售额单品种全球前四。与此同时，国内尚无该药品上市，存在极大的市场潜力。
肝素系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。具有六糖或八糖重复单位的线性链条结构，其分子量在3000~37000之间，平均分子量15000左右，肝素具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病毒、抗癌、调节血脂等多种药理活性，但长期使用则可能产生某些不良反应，如出血和诱导血小板减少等。低分子肝素(1owmolecular weight heparin，LMWH) 是肝素分级或降解而得到的分子质量较小的片段。近10 年来。人们对低分子肝素的研究发现，其抗血栓作用优于肝素，具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小，口服易吸收等特点。由于低分子肝素有效性和安全性均优于普通肝素，目前已成为肝素类药物研究的热点。
目前市场上低分子肝素LMWH的制备方法主要是化学裂解法和酶解法，化学裂解法主要是由β-消除法、亚硝酸降解法，过氧化氢降解法、酸降解法和射线降解法等，这些方法操作过程中反应比较剧烈，容易使得肝素末端的基团产生破坏，造成LMWH的生物活性单位或多或少的改变，从而有可能导致整个产品的不稳定。而酶解法就是在比较温和的条件下将肝素降解成所需的低分子肝素产品。
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种汀肝素钠制备工艺，利用肝素酶Ⅰ切断肝素和硫酸乙酰肝素（相对活性约3:1）在葡萄糖胺和○-硫酸艾杜糖醛酸之间的连键，将肝素降解成双糖小分子，从而得到汀肝素这一产品。
其技术方案是包括以下制备步骤：
（1）、制备肝素钠溶液：
将精品肝素钠溶解为5%~10%浓度的溶液，调节料液pH值7.0~8.0、温度25-30℃；
（2）、制备肝素钠酶解液：
加入上述步骤的精品肝素钠溶液体积的1.0%-3.0%的肝素酶，为液体，酶解时间为1.0~2.0h，间歇搅拌；
反应完成后在线检测其料液232nm的比吸收光度为 0.9~1.2，迅速将料液升温至80.0~95.0℃，0.2~0.5h 终止整个降解反应；
（3）、制备酶解液沉淀物：
将酶解完成的液体制冷，加入酶解液2~3倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；
（4）、制备精品汀肝素钠：
将上述沉淀物溶成10%~15%浓度，用0.22微米的除菌过滤膜进行进一步处理，最终产品进行冷冻干燥得到汀肝素钠。
优选的，本发明的步骤3中，通过液相检测主要分子量分布在5500—7500，分子量小于2000的组分不大于10%，2000~8000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间。
本发明与现有工艺相比，本发明工艺的优点和有益效果在于：
1) 利用肝素钠为原料，通过控制降解和紫外吸收在线监控，使降解反应更加可控，有利于减少副产物的生成，实现汀肝素钠的规模化生产；
2）采用本发明工艺，所得产品的重均分子量为5500—7500，分子量小于2000的组分不大于10%，2000~8000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间，抗抗Ⅹ活性≧110IU/mg，抗Ⅹa／抗Ⅱa 为1.5-2.5，本产品抗血栓活性较好，纯度高，杂质少，产品稳定。
具体实施方式
    实施例1：向1kg精品肝素钠（效价175usp/mg）加入900ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至27℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至7.3，精确量取肝素钠溶液体积为1000ml，加入肝素钠溶液体积1%的肝素酶，即10ml，酶解2.0h。反应过程中，间歇搅拌，酶解完毕，在线检测其料液232nm的光吸收为 0.9，迅速将料液升温至87℃，反应0.3h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液2~3倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；
液相检测其分子量为：主要分子量为6150，分子量小于2000的组分为9.0%，2000~8000的组分为67%，大于8000的组分为32%；
将汀肝素钠沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠3.95 Kg。
       实施例2：向3kg精品肝素钠（效价187usp/mg）加入2500ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至25℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至7.5，精确量取肝素钠溶液体积为2690ml，加入肝素钠溶液体积1.5%的肝素酶，即40.35ml，酶解1.5h。反应过程应监控pH、温度，间歇搅拌，酶解完毕，紫外在线检测其料液232nm的比光吸收为 1.0，迅速将料液升温至92℃，反应0.4h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液2~3倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；
液相检测其分子量为：主要分子量为5930，分子量小于2000的组分为8.9%，2000~8000的组分为68%，大于8000的组分为29%；
  将上述沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠4.15 Kg。
       实施例3：向5kg精品肝素钠（效价191usp/mg）加入4800ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至30℃，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至8.0，精确量取肝素钠溶液体积为5000ml，加入肝素钠溶液体积2%的肝素酶，即100.00ml，酶解1.0h。反应过程应监控pH、温度，间歇搅拌，酶解完毕，紫外在线检测其料液232nm的光吸收为1.1，迅速将料液升温至95℃，反应0.4h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液2~3倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；
液相检测其分子量为：主要分子量为6200，分子量小于2000的组分为8.5%，2000~8000的组分为69%，大于8000的组分为31%；
将上述沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠4.21Kg。
本发明的抗Ⅹ活性≧110IU/mg；且原料来源丰富、产率高、质量稳定可靠、纯度高、工艺简单、操作方便，无三废排放。产品汀肝素钠具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等功效，疗效显著。可用于预防外科手术后深部静脉血栓形成,预防血液透析和体外循环时静脉血栓的形成,治疗深静脉血栓。能有效防止不稳定性冠心病，使用范围广泛。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 104262508 A (43)申请公布日 2015.01.07 C N 1 0 4 2 6 2 5 0 8 A (21)申请号 201410480869.0 (22)申请日 2014.09.19 C08B 37/10(2006.01) (71)申请人东营天东制药有限公司地址 257000 山东省东营市东营区南二路 1236号 (72)发明人郭林李荣李福川崔慧斐陈少鹏于合新 (74)专利代理机构东营双桥专利代理有限责任公司 37107 代理人罗文远 (54) 发明名称一种汀肝素钠制备工艺 (57) 摘要本发明涉及一种汀肝素钠制备工艺。其技术方案是：。

2、包括制备肝素钠溶液，制备肝素钠酶溶液，制备肝素钠降解液，制备精制、冻干等步骤，所得产品的重均分子量为55007500，分子量小于 2000的组分不大于10%，20008000的组分在60% 和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间，抗活性110IU/mg。优点是：原料来源丰富、产率高、质量稳定可靠、纯度高、工艺简单、操作方便，无三废排放，产品汀肝素钠具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等功效，疗效显著，可用于预防外科手术后深部静脉血栓形成,预防血液透析和体外循环时静脉血栓的形成,治疗深静脉血栓，使用范围广泛。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书3页。

3、 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书1页说明书3页 (10)申请公布号 CN 104262508 A CN 104262508 A 1/1页 2 1.一种汀肝素钠制备工艺，其特征是包括以下制备步骤：（1）、制备肝素钠溶液：将精品肝素钠溶解为5%10%浓度的溶液，调节料液pH值7.08.0、温度25-30；（2）、制备肝素钠酶解液：加入上述步骤的精品肝素钠溶液体积的1.0%-3.0%的肝素酶，为液体，酶解时间为 1.02.0h，间歇搅拌；反应完成后在线检测其料液232nm的比吸收光度为 0.91.2，迅速将料液升温至 80.095.0，0.20.5。

4、h 终止整个降解反应；（3）、制备酶解液沉淀物：将酶解完成的液体制冷，加入酶解液23倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；（4）、制备精品汀肝素钠：将上述沉淀物溶成10%15%浓度，用0.22微米的除菌过滤膜进行进一步处理，最终产品进行冷冻干燥得到汀肝素钠。 2.根据权利要求1所述的汀肝素钠制备工艺，其特征是：步骤3中，通过液相检测主要分子量分布在55007500，分子量小于2000的组分不大于10%，20008000的组分在60%和 72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间。权利要求书CN 104262508 A 1/3页 3 一种汀肝素钠制备工艺技术领域 000。

5、1 本发明涉及一种汀肝素钠制备工艺。背景技术 0002 汀肝素钠（Tinzaparin Sodium）低分子钠盐由丹麦利奥公司开发,并于1996年 6月上市,商品名Innohep。汀肝素钠1991年在欧洲上市，2000年7月经FDA批准上市。汀肝素钠2013年的全球销售额约6.2亿美元，在低分子肝素类产品中销售额单品种全球前四。与此同时，国内尚无该药品上市，存在极大的市场潜力。 0003 肝素系自猪或牛的肠黏膜中提取的硫酸氨基葡聚糖的钠盐，属黏多糖类物质。具有六糖或八糖重复单位的线性链条结构，其分子量在300037000之间，平均分子量15000 左右，肝素具有抗凝、抗炎、抗过敏、抗病。

6、毒、抗癌、调节血脂等多种药理活性，但长期使用则可能产生某些不良反应，如出血和诱导血小板减少等。低分子肝素(1owmolecular weight heparin，LMWH) 是肝素分级或降解而得到的分子质量较小的片段。近10 年来。人们对低分子肝素的研究发现，其抗血栓作用优于肝素，具有生物利用度高、体内半衰期长、出血倾向小，口服易吸收等特点。由于低分子肝素有效性和安全性均优于普通肝素，目前已成为肝素类药物研究的热点。 0004 目前市场上低分子肝素LMWH的制备方法主要是化学裂解法和酶解法，化学裂解法主要是由-消除法、亚硝酸降解法，过氧化氢降解法、酸降解法和射线降解法等，这些方法操。

7、作过程中反应比较剧烈，容易使得肝素末端的基团产生破坏，造成LMWH的生物活性单位或多或少的改变，从而有可能导致整个产品的不稳定。而酶解法就是在比较温和的条件下将肝素降解成所需的低分子肝素产品。发明内容 0005 本发明的目的就是针对现有技术存在的上述缺陷，提供一种汀肝素钠制备工艺，利用肝素酶切断肝素和硫酸乙酰肝素（相对活性约3:1）在葡萄糖胺和-硫酸艾杜糖醛酸之间的连键，将肝素降解成双糖小分子，从而得到汀肝素这一产品。 0006 其技术方案是包括以下制备步骤：（1）、制备肝素钠溶液：将精品肝素钠溶解为5%10%浓度的溶液，调节料液pH值7.08.0、温度25-30；（2）、制备。

8、肝素钠酶解液：加入上述步骤的精品肝素钠溶液体积的1.0%-3.0%的肝素酶，为液体，酶解时间为 1.02.0h，间歇搅拌；反应完成后在线检测其料液232nm的比吸收光度为 0.91.2，迅速将料液升温至 80.095.0，0.20.5h 终止整个降解反应；（3）、制备酶解液沉淀物：将酶解完成的液体制冷，加入酶解液23倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；说明书CN 104262508 A 2/3页 4 （4）、制备精品汀肝素钠：将上述沉淀物溶成10%15%浓度，用0.22微米的除菌过滤膜进行进一步处理，最终产品进行冷冻干燥得到汀肝素钠。 0007 优选的，本发明的步骤3中，通过液相。

9、检测主要分子量分布在55007500，分子量小于2000的组分不大于10%，20008000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22% 和36%之间。 0008 本发明与现有工艺相比，本发明工艺的优点和有益效果在于： 1) 利用肝素钠为原料，通过控制降解和紫外吸收在线监控，使降解反应更加可控，有利于减少副产物的生成，实现汀肝素钠的规模化生产； 2）采用本发明工艺，所得产品的重均分子量为55007500，分子量小于2000的组分不大于10%，20008000的组分在60%和72%之间，大于8000的组分在22%和36%之间，抗抗活性110IU/mg，抗a抗a 为1.5-2.5。

10、，本产品抗血栓活性较好，纯度高，杂质少，产品稳定。具体实施方式 0009 实施例1：向1kg精品肝素钠（效价175usp/mg）加入900ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至27，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至7.3，精确量取肝素钠溶液体积为1000ml，加入肝素钠溶液体积1%的肝素酶，即10ml，酶解2.0h。反应过程中，间歇搅拌，酶解完毕，在线检测其料液232nm的光吸收为 0.9，迅速将料液升温至87，反应0.3h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液23倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；液相检测其分子量为：主要分子量为6150，分。

11、子量小于2000的组分为9.0%，20008000 的组分为67%，大于8000的组分为32%；将汀肝素钠沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠3.95 Kg。 0010 实施例2：向3kg精品肝素钠（效价187usp/mg）加入2500ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至25，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至7.5，精确量取肝素钠溶液体积为2690ml，加入肝素钠溶液体积1.5%的肝素酶，即40.35ml，酶解 1.5h。反应过程应监控pH、温度，间歇搅拌，酶解完毕，紫外在线检测其料液232nm的比光吸收为 1。

12、.0，迅速将料液升温至92，反应0.4h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液23倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；液相检测其分子量为：主要分子量为5930，分子量小于2000的组分为8.9%，20008000 的组分为68%，大于8000的组分为29%；将上述沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠4.15 Kg。 0011 实施例3：向5kg精品肝素钠（效价191usp/mg）加入4800ml纯化水，待完全溶解后，将料液温度调至30，然后用浓度为6mol/L的氢氧化钠将料液pH值调节至8.0，精确量取肝素钠溶液体积为5。

13、000ml，加入肝素钠溶液体积2%的肝素酶，即100.00ml，酶解1.0h。反应过程应监控pH、温度，间歇搅拌，酶解完毕，紫外在线检测其料液232nm的光吸收为说明书CN 104262508 A 3/3页 5 1.1，迅速将料液升温至95，反应0.4h，终止整个降解反应。将酶解完成的液体制冷，加入酶解液23倍药用乙醇，充分搅拌得其沉淀物；液相检测其分子量为：主要分子量为6200，分子量小于2000的组分为8.5%，20008000 的组分为69%，大于8000的组分为31%；将上述沉淀物溶成10%的浓度，料液通过0.22um滤膜进行除菌过滤，滤液冷冻干燥，得汀肝素钠4.21Kg。 0012 本发明的抗活性110IU/mg；且原料来源丰富、产率高、质量稳定可靠、纯度高、工艺简单、操作方便，无三废排放。产品汀肝素钠具有抗凝血、抗血栓、抗肿瘤、抗炎、抗过敏等功效，疗效显著。可用于预防外科手术后深部静脉血栓形成,预防血液透析和体外循环时静脉血栓的形成,治疗深静脉血栓。能有效防止不稳定性冠心病，使用范围广泛。说明书CN 104262508 A 。

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