一种诱导丝孢真菌产孢的方法.pdf

本发明公开了一种诱导丝孢真菌产孢的方法，包括以下步骤：(1)取圆形滤纸，均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水浸湿，高温高压灭菌后取出滤纸。(2)配制琼胶培养基并灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。(3)将经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上。(4)挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。(5)盖上培养皿盖密封，于室温、自然光线下培养10～30天。本发明方法操作简单，培养条件温和，诱导丝孢真菌产孢效果显著，对多数丝孢真菌有效，分生孢子在滤纸上分布均匀，便于观察产孢表型。

1.  一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加蒸馏水将所述滤纸浸湿，进行高温高压灭菌后，取出滤纸；
(2)配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基灭菌，加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板；
(3)将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡；
(4)然后挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上；
(5)盖上培养皿盖密封，然后于室温、自然光线下培养10～30天，滤纸上密集产生大量的分生孢子。

2.  如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于所述琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀。

3.  如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于：步骤(1)中，在所述滤纸上均匀剪出4～6个滤纸孔。

4.  如权利要求2所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于：所述滤纸直径为65～75mm，所述滤纸孔的直径为12～18mm。

5.  如权利要求1所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述未产孢丝孢真菌菌种的接种量为每孔接种直径2～5mm菌饼。

6.  如权利要求1至5任一权利要求所述的一种诱导丝孢真菌产孢的方法，其特征在于：所述的高温高压灭菌是在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟。

一种诱导丝孢真菌产孢的方法
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种诱导丝孢真菌产孢的方法。
背景技术
长期以来，丝孢真菌的分类鉴定主要以菌体形态特点为主，而分生孢子的特征(形态、大小、隔膜数量、表面纹饰及附属物等)是丝孢真菌主要的种级分类标准，分生孢子连续产生的外观形态(产孢表型)亦是丝孢真菌种类鉴定的重要依据。
但是在现有培养技术下，丝孢真菌在分离、培养过程中，人工培养时易出现不产生分生孢子或难产生分生孢子现象，导致无法顺利开展丝孢真菌的鉴定研究。同时，产孢表型观察无法与分生孢子产生同时开展，往往需要多次再培养进行产孢表型观察，耗费大量时间和实验成本。
目前促进丝孢真菌产孢的主要方法有菌落划伤法、紫外光照射法、冷冻刺激法、黑暗/光照交替培养法等，但这些方法均存在以下几个缺点：(1)促进产孢的效果不明显，产孢量少，产孢表型难于观察；(2)难以准确掌握处理时间，处理时间不当会抑制丝孢真菌产孢或致死；(3)培养周期长，往往经过长时间的培养才会产孢；(4)产生的分生孢子特征不稳定，不同培养条件下产生的分生孢子特征存在较大差异。
因此，寻求一种操作方便、易于获得特征稳定的分生孢子并可以同时进行产孢表型观察的丝孢真菌培养方法，对于丝孢真菌的物种鉴定具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种诱导丝孢真菌产孢的方法，相比现有技术培养条件容易控制，培养时间短，能够获得特征稳定的分生孢子，且易于观察产孢表型，以便更加准确的进行丝孢真菌的物种鉴定。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
一种诱导丝孢真菌产孢的方法，包括以下步骤：
(1)取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个以上的滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，进行高温高压灭菌后，取出滤纸。
(2)配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基灭菌，加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为15～20ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
(3)用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
(4)然后用无菌针挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
(5)盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养10～30天，滤纸上即可密集产生大量的分生孢子。
根据不同真菌的生长周期，在培养第10天、第15天、第20天和第30天于体视镜下观察滤纸表面产生的分生孢子及产孢表型。
上述各步骤均在超净工作台中完成。
作为一种改进的技术方案，所述琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀得到所述琼胶培养基。
作为一种优选的技术方案，步骤(1)中，在所述滤纸上均匀剪出4～6个滤纸孔。
作为进一步优选的技术方案，所述滤纸直径为65～75mm，所述滤纸孔的直径为12～18mm。
作为一种优选的技术方案，步骤(4)中，所述未产孢丝孢真菌菌种的接种量为每孔接种直径2～5mm菌饼。
作为一种优选的技术方案，所述的高温高压灭菌是在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟。
由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明方法通过采用在一个培养皿中4个以上位点接种，实现菌落多发，能够在较短时间内诱导大多数丝孢真菌快速大量产孢，效果显著，分生孢子在滤纸上分布均匀，相比传统的每皿只接种一个位点、接种多皿的操作方法，大大减少工作量，并且在产生分生孢子后，同时进行丝孢真菌不同时期产孢表型的连续观察，避免多次重复培养，节省时间，节约成本。
本发明琼胶培养基的制备方法为：在1000ml水中加入10～20g琼脂粉、5～10g葡萄糖、5～10g淀粉、3～5g羧甲基纤维素钠、5～10g蛋白胨、2～5g硫酸镁、2～5g磷酸二氢钾、2～5g硫酸亚铁和50～80mg维生素B₁，搅拌均匀得到，本发明使用的改良琼胶培养基含有的营养成分及微量元素，满足了丝孢真菌前期菌丝生长及后期孢子产生所需营养物质，并在室温、自然光线下培养，接近丝孢真菌在自然环境中的生长条件(自然光照、温度、寡营养)，诱导产生的分生孢子特征稳定，能够充分表现出自身的种级特征。
本发明方法操作简单，培养条件温和，无需特殊设备，一般微生物实验室均可进行，所用改良琼胶培养基可培养诱导绝大多数丝孢真菌产孢，不需要根据丝孢真菌种类选择培养基类型，且诱导丝孢真菌产孢效果显著，对多数丝孢真菌有效，分生孢子在滤纸上分布均匀，便于观察产孢表型。且培养结束后，无需进行繁琐的干制标本制作，只需将带有大量丝孢真菌培养物的培养滤纸取出，经过简单熏蒸、干燥就可作为菌种干制标本进行干燥保存，便于其他真菌工作者的后续研究。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
图1是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在PDA培养基上不同培养时间的菌落形态；
图2是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在PDA培养基上不同培养时间的产孢形态；
图3是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的改良琼胶培养基上不同培养时间的菌落形态；
图4是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的改良琼胶培养基上不同培养时间的产孢形态；
图5是丝孢真菌菌株(菌株编号为YC1407)在本发明的改良琼胶培养基上不同培养时间的产孢表型。
具体实施方式
下面结合附图和具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
取圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出4个滤纸孔，平放于培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。
配制琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为16ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
然后用无菌针挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面开始产生分孢子，培养10～30天，滤纸上形成密集的分生孢子。
实施例2
取直径为70mm的圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出直径为15mm的5个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。
在1000ml水中加入15g琼脂粉、8g葡萄糖、8g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、 8g蛋白胨、3g硫酸镁、3g磷酸二氢钾、4g硫酸亚铁和75mg维生素B₁，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为18ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
然后用无菌针挑取适量未产孢丝孢真菌菌种，接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面开始产生分孢子，培养10～30天，滤纸上形成密集的分生孢子。
根据真菌的生长周期，在培养第10天、第15天、第20天和第30天于体视镜下观察滤纸表面产生的分生孢子及产孢表型。
实施例3
取直径为70mm的圆形滤纸，在所述滤纸上均匀剪出直径为12mm的6个滤纸孔，平放于直径为90mm的培养皿中，加适量蒸馏水将所述滤纸浸湿，在温度121℃、压力120kPa条件下保持灭菌20分钟后，取出滤纸。
在1000ml水中加入18g琼脂粉、6g葡萄糖、6g淀粉、4g羧甲基纤维素钠、7g蛋白胨、4g硫酸镁、4g磷酸二氢钾、3g硫酸亚铁和70mg维生素B₁，搅拌均匀，配制成琼胶培养基，将配制好的琼胶培养基在温度121℃、压力120kPa条件下灭菌，然后加入到灭菌后的培养皿中，每培养皿加入量为16ml，待琼胶培养基凝固后制成琼胶培养平板。
用无菌镊子将所述经过灭菌的滤纸平铺在琼胶培养平板表面上，使所述滤纸与所述琼胶培养平板之间无空隙，无气泡。
然后用无菌针挑取未产孢丝孢真菌菌种，按照每孔直径5mm的菌饼的接种量接种于所述滤纸上的各个滤纸孔中心位置的改良琼胶培养平板上。
盖上培养皿盖，用封口膜密封，然后于室温、自然光线下培养，第10天开始滤纸表面开始产生分孢子，培养10～20天，滤纸上形成密集的分生孢子。
对比实验例
以一株分离自人工盐池的丝孢真菌(菌株编号为YC1407)为例，培养条件为：
实验例按照实施例2的培养条件进行培养，对比例与之不同的是，使用的培养基为PDA培养基，而非本发明的改良琼胶培养基。
对比例：丝孢真菌YC1407在PDA培养基上培养产生大量菌丝。如附图图1所示，分别在培养第10天、15天、20天观察菌落形态，可见培养基表面产生大量菌丝，菌丝灰白色，呈絮状。在体视镜下观察产孢情况(附图2)，虽然经过长时间培养但未见产孢结构及分生孢子产生，仅可见灰白色细丝状菌丝。
实验例：利用本发明实施例2的培养方法进行丝孢真菌YC1407培养，经过20天连续培养，分别在第10天、15天、20天观察菌落形态，其菌落形态如附图3所示。由图3可见，菌株YC1407在改良琼胶培养基表面的菌丝厚度明显小于其在PDA培养基上产生的菌丝厚度，随着培养时间延长，其菌落颜色逐渐加深。将上述培养菌落在体视镜下观察(如附图4所示)，菌株YC1407在培养第10天时，滤纸表面开始形成产孢结构和分生孢子，随着培养时间延长，滤纸表面形成的典型产孢结构及分生孢子逐渐增加，培养第20天时可见在滤纸表面密集产生大量分生孢子。
利用本实验例培养方法，进行菌株YC1407产孢表型的连续观察(如附图5所示)。菌株YC1407培养第10天，在体视镜下可见已分化产生分生孢子梗，并开始产生分生孢子；培养第15天观察，可见其分生孢子梗端部产生的分生孢子呈链状排列，孢子链较短，可形成具有分枝的分生孢子链；培养第20天观察，可见较长的分生孢子链并且孢子链分枝明显。
对比试验结论：
利用本发明方法，能成功的快速诱导菌株YC1407产生大量典型的产孢结构和分生孢子，并可根据实验需要同时进行不同时期的产孢表型观察。通过制作菌体玻片观察其产孢结构和分生孢子特征，结合产孢表型特点，经查阅文献资料，鉴定菌株YC1407为Alternaria alternata，属半知菌门，丝孢纲 (Hyphomycetes)，丝孢目(Hyphomycetales)，暗色孢科(Dematiaceae)。