一种高效表达外源蛋白的方法.pdf

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1、(10)申请公布号 CN 102816758 A (43)申请公布日 2012.12.12 C N 1 0 2 8 1 6 7 5 8 A *CN102816758A* (21)申请号 201110155281.4 (22)申请日 2011.06.10 C12N 15/11(2006.01) C12N 15/82(2006.01) C07K 14/00(2006.01) C07K 1/22(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人清华大学 地址 100084 北京市海淀区清华大学人环楼 407室 (72)发明人李海鸥 闫建斌 姚瑞枫 谢道昕 李素华 白志燕 彭文 。

2、(74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人关畅 (54) 发明名称 一种高效表达外源蛋白的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种高效表达外源蛋白的方 法。本发明将外源蛋白基因克隆到pMYC2载体上， 使其与pMYC2载体上的6个MYC标签的编码基因 形成融合基因，然后利用农杆菌侵染转化法，在烟 草叶片中瞬时高效的表达外源蛋白。然后，根据重 组蛋白所带有的MYC亲和标签，利用带有相应标 签抗体的亲和介质将烟草表达蛋白高效纯化，最 后再竞争洗脱亲和介质最终获得纯化后的目的蛋 白。纯化后蛋白可用于进一步的生物学功能研究。 本发明可实现一步法纯化蛋白，简单快捷，而且蛋 白纯。

3、度较高。利用该方法所获得的外源重组蛋白 可用于生物安全评价和生物功能研究。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书9页 序列表6页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 9 页 序列表 6 页 附图 2 页 1/1页 2 1.一种表达外源蛋白的方法，包括如下步骤： (1)将所述外源蛋白的编码基因插入pMYC2载体的多克隆位点，使所述外源蛋白的编 码基因和pMYC2载体上的6个MYC标签的编码基因形成融合基因，得到重组质粒； (2)将步骤(1)的重组质粒转化农杆菌，得到重组农杆菌； (3)将步骤(2)的重组农杆菌菌液注射烟草植株。

4、的叶片后继续培育烟草植株； (4)取注射了重组农杆菌菌液的烟草叶片，提取蛋白并进行MYC亲和纯化，得到纯化的 外源蛋白。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述叶片为新叶；所述新叶为 生长30-35天的叶片，优选为生长32天的叶片。 3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中，所述培育烟草植株的时间 为24至69小时，优选为69小时。 4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述提取蛋白的方 法包括如下步骤：将所述烟草叶片进行液氮研磨，然后用蛋白提取液进行提取，得到蛋白粗 提液。 5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述蛋白提取液为。

5、RB溶液；所述RB溶液的 pH为7.8，由溶质和水组成；所述溶质及其浓度如下：50mM Tris，50mM NaCl，10(体积百 分含量)甘油，0.1(体积百分含量)Tween-20，0.15(体积百分含量)-巯基乙醇， 25mM咪唑。 6.如权利要求5所述的方法，其特征在于：步骤(4)中，所述MYC亲和纯化包括如下步 骤： 在MYC亲和介质中加入所述蛋白粗提液，4孵育1h； 清洗步骤的MYC亲和介质； 在步骤的MYC亲和介质中加入MYC肽溶液，4孵育10小时，然后离心取上清，即 为含有纯化的外源蛋白的溶液。 7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：步骤中，用所述RB溶液进行所述清洗；步 骤。

6、中，所述MYC肽溶液由MYC肽和所述RB溶液组成，所述MYC肽的浓度为10-100g/ml， 优选为50g/ml。 8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述农杆菌为农杆菌菌株 GV3101。 9.如权利要求1至8中任一所述的方法，其特征在于：所述烟草为本生烟。 10.如权利要求1至9中任一所述的方法，其特征在于：所述外源蛋白为序列表的序列 2所示的蛋白质；所述外源蛋白的编码基因优选为序列表的序列3所示的基因。 权 利 要 求 书CN 102816758 A 1/9页 3 一种高效表达外源蛋白的方法 技术领域 0001 本发明涉及一种高效表达外源蛋白的方法。 背景技术 0002 利。

7、用转基因技术在生物反应器中生产高附加值蛋白质具有重要的理论意义和应 用价值。生物反应器经历了细菌基因工程、细胞基因工程、转基因动物生物反应器及转基因 植物生物反应器等四个阶段。 0003 细菌基因工程产物往往不具备生物活性，必须经过糖基化、羟基化等一系列修饰 加工后，才能成为有效的药物，而细胞基因工程又因为哺乳动物细胞的培养条件要求相当 苛刻，成本太高，限制了规模生产。 0004 动物生物反应器具有产品质量高，容易提纯的特点，弥补了其它各类基因表达系 统的缺陷，但是其技术本身涉及道德伦理等问题，也限制了其大规模生产。 0005 转基因植物生物反应器不仅弥补了上述反应器的缺陷，而且更易于推广，获。

8、得稳 定遗传的转基因植物种系后，比较容易建立低成本的大规模生产系统，因而具有巨大的应 用前景。但是，在转基因植物反应器中，常常发生外源基因插入位点的不确定性和基因之间 复杂的相互作用，从而导致转基因作物发生代谢、发育、遗传等方面的一系列变化，产生所 谓的转基因作物的非预期效应。该效应是转基因作物安全性评价的重要内容之一，但是常 规的分析检测手段却往往难以准确评价。 发明内容 0006 本发明的目的是提供一种高效表达外源蛋白的方法。 0007 本发明提供的表达外源蛋白的方法，包括如下步骤： 0008 (1)将所述外源蛋白的编码基因插入pMYC2载体的多克隆位点，使所述外源蛋白 的编码基因和pMY。

9、C2载体上的6个MYC标签的编码基因形成融合基因，得到重组质粒； 0009 (2)将步骤(1)的重组质粒转化农杆菌，得到重组农杆菌； 0010 (3)将步骤(2)的重组农杆菌菌液注射烟草植株的叶片后继续培育烟草植株； 0011 (4)取注射了重组农杆菌菌液的烟草叶片，提取蛋白并进行MYC亲和纯化，得到纯 化的外源蛋白。 0012 步骤(3)中，所述叶片可为新叶；所述新叶为生长30-35天的叶片。所述新叶优选 为生长32天的叶片。 0013 步骤(3)中，所述培育烟草植株的时间可为24至69小时，优选为69小时。 0014 步骤(4)中，所述提取蛋白的方法可包括如下步骤：将所述烟草叶片进行液氮研。

10、 磨，然后用蛋白提取液进行提取，得到蛋白粗提液。 0015 所述蛋白提取液具体可为RB溶液；所述RB溶液的pH为7.8，由溶质和水组成；所 述溶质及其浓度如下：50mM Tris，50mM NaCl，10(体积百分含量)甘油，0.1(体积百 分含量)Tween-20，0.15(体积百分含量)-巯基乙醇，25mM咪唑。 说 明 书CN 102816758 A 2/9页 4 0016 步骤(4)中，所述MYC亲和纯化具体可包括如下步骤： 0017 在MYC亲和介质中加入所述蛋白粗提液，4孵育1h； 0018 清洗步骤的MYC亲和介质； 0019 在步骤的MYC亲和介质中加入MYC肽溶液，4孵育10。

11、小时，然后离心取上 清，即为含有纯化的外源蛋白的溶液。 0020 步骤中，可用所述RB溶液进行所述清洗。 0021 步骤中，所述MYC肽溶液具体由MYC肽和所述RB溶液组成。所述MYC肽的在所 述MYC肽溶液中的浓度可为10-100g/ml，优选为50g/ml。 0022 所述农杆菌具体可为农杆菌菌株GV3101。 0023 所述烟草具体可为本生烟。 0024 所述外源蛋白具体可为序列表的序列2所示的蛋白质。 0025 所述外源蛋白的编码基因优选为序列表的序列3所示的基因。 0026 本发明将外源蛋白基因克隆到pMYC2载体上，使其与pMYC2载体上的6个MYC标 签的编码基因形成融合基因，然。

12、后以烟草叶片为反应器，利用农杆菌侵染转化法在烟草叶 片中瞬时高效的表达外源蛋白。然后，根据重组蛋白所带有的MYC亲和标签，利用带有相应 标签抗体的亲和介质将烟草表达蛋白高效纯化，最后再竞争洗脱亲和介质最终获得纯化后 的目的蛋白。纯化后蛋白具有生物活性，可用于进一步的生物学功能研究。本发明可实现 一步法纯化蛋白，简单快捷，而且蛋白纯度较高。利用该方法所获得的外源重组蛋白可用于 生物安全评价和生物功能研究。 附图说明 0027 图1为MYC-COI1表达检测；1：注射对照农杆菌(空载体)的叶片；2：注射侵染液 的叶片3：注射重组农杆菌(pMYC-COI1)的叶片。 0028 图2为转化需要的最佳叶。

13、片状态；1：注射侵染液后的叶片(阴性对照)；2：老叶中 表达的蛋白；3：中叶中表达的蛋白；4：新叶中表达的蛋白。 0029 图3为转化后蛋白表达的最佳时间；1：注射侵染液的叶片(阴性对照)；2：转染重 组农杆菌24小时后叶片表达的蛋白；3：转染重组农杆菌32小时后叶片表达的蛋白；4：转 染重组农杆菌42小时后叶片表达的蛋白；5：转染重组农杆菌52小时后叶片表达的蛋白； 6：转染重组农杆菌62小时后叶片表达的蛋白；7：转染重组农杆菌69小时后叶片表达的蛋 白。 0030 图4为最适蛋白提取缓冲液的确定；1：缓冲液A提取的蛋白；2：缓冲液B提取的 蛋白；3：缓冲液C提取的蛋白；4：RB缓冲液提取的。

14、蛋白；5：缓冲液D提取的蛋白；6：缓冲液 E提取的蛋白；7：TBS缓冲液提取的蛋白；8：PBS缓冲液提取的蛋白。 0031 图5为最适MYC肽竞争洗脱浓度的确定；110g/ml MYC肽洗脱的蛋白； 250g/ml MYC肽洗脱的蛋白；3100g/ml MYC肽洗脱的蛋白。 0032 图6为JAZ1-HIS蛋白洗脱图谱；图中的洗脱峰即为Ni柱亲和层析中得到的 JAZ1-HIS蛋白。 0033 图7为MYC-COI1活性检测；1：蛋白粗提液(加入冠菌素的处理)；2：MYC-COI1蛋 白液(不加入冠菌素的处理)；3：MYC-COI1蛋白液(加入冠菌素的处理)。 说 明 书CN 102816758。

15、 A 3/9页 5 具体实施方式 0034 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平 均值。 0035 COI1蛋白的氨基酸序列如序列表的序列2所示，其编码基因如序列表的序列3所 示。在模式植物拟南芥生长发育的过程中，F-box蛋白COI1具有非常重要的调控作用。但 是研究中发现，COI1蛋白无法通过原核表达大量获得纯化蛋白。而通过本发明，我们能够 高效获得纯化的并具有生物活性的COI1蛋白，并进行其。

16、功能研究。 0036 实施例中所用的拟南芥是购自ABRC(Arabidopsis Biological Resource Center)的哥伦比亚生态型拟南芥，货号为CS28166。 0037 大肠杆菌DH5：购自NEB公司，货号为C2987H。 0038 农杆菌菌株GV3101：公众可以从清华大学获得；参考文献：R.Berres et al.Transformation of vitis tissue by different strains of agrobacterium tumefaciens containing the T-6b gene，Plant Cell Reports 11。

17、：192-195。 0039 本生烟(Nicotiana benthamiana)：公众可以从清华大学获得；参考文献： Gianinna Brignet et al.Viral pathogenicity determinants are suppressors of transgene silencing in Nicotiana benthamiana，The EMBO Journal 17：6739-6746。 0040 pMYC2载体：公众可以从清华大学获得；参考文献：Linghui Xu et al.The SCF COI1 Ubiquitin-Ligase Complexes ar。

18、e Required for Jasmonate Response in arabidopsis，Plant Cell 14：1919-1939，2002；pMYC2载体是将六个拷贝的MYC片段的编 码DNA(如序列表中序列1所示)，通过BamHI和SmaI酶切位点克隆到pBIN-pROK2载体中 得到的。 0041 MYC亲和介质：Sigma-aldrich，货号a7470。 0042 MYC肽：Sigma-aldrich，货号M2435。 0043 RB缓冲液(pH7.8)：由溶质和水组成；溶质及其浓度如下：50mM Tris，50mM NaCl， 10(体积百分含量)甘油，0.1(体积百。

19、分含量)Tween-20，0.15(体积百分含量) -巯基乙醇，25mM咪唑。 0044 缓冲液A：由50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度如下： 100mM NaCl，10mM MgCl 2 ，5mM KCl，1mM DTT。 0045 缓冲液B：由50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度如下： 100mM NaCl，10mM MgCl 2 ，5mM KCl，1mM DTT，0.1(体积百分含量)Tween-20。 0046 缓冲液C：由50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度如下： 100mM Na。

20、Cl，1mM DTT，0.1(体积百分含量)Tween-20。 0047 缓冲液D：由50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度如下： 100mM NaCl，5mM KCl，1mM DTT。 0048 缓冲液E(pH7.8)：由溶质和水组成；溶质及其浓度如下：50mM Tris，50mM NaCl， 0.1(体积百分含量)Tween-20，0.15(体积百分含量)-巯基乙醇。 说 明 书CN 102816758 A 4/9页 6 0049 TBS缓冲液：由50mM Tris-HCl(pH7.4)缓冲液和溶质组成；溶质及其浓度如下： 150mM NaCl。 0050 。

21、PBS缓冲液：136mM NaCl，4.3mM Na 2 HPO 4 ，2.7mM KCl，1.4mM KH 2 PO 4 ，pH7.4。 0051 缓冲液50：由50mM PBS缓冲液(pH7.4)和溶质组成；溶质及其浓度如下：0.5M NaCl，50mM咪唑。 0052 缓冲液400：50mM PBS缓冲液(pH7.4)和溶质组成；溶质及其浓度如下：0.5M NaCl，400mM咪唑。 0053 实施例1、重组表达载体和重组农杆菌的构建 0054 一、重组表达载体的构建 0055 1、以拟南芥cDNA为模板，用F1和R1组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增 产物。 0056 F1：5。

22、-TCCCCCGGGATGGAGGATCCTGATATCAAGA-3； 0057 R1：5-GGCGAGCTCTCATATTGGCTCCTTCAGGACTC-3。 0058 PCR扩增程序：95预变性5min；95变性30s，60退火30s，72延伸2min，共 25个循环；72再延伸10min。 0059 2、用限制性内切酶SmalI和SacI双酶切步骤1的PCR扩增产物，回收酶切产物。 0060 3、用限制性内切酶SmalI和SacI双酶切步骤2的pMYC2载体，回收线性化的载体 骨架(约11kbp)。 0061 4、将步骤2的酶切产物和步骤3的载体骨架在T4连接酶的作用下16连接16h，。

23、 得到连接产物。 0062 5、将步骤4的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，在含有50g/ml卡那霉 素的平板上筛选阳性克隆。 0063 6、将步骤5的阳性克隆提取质粒并测序，测序结果表明得到了重组质粒 pMYC2-COI1。根据测序结果，对重组质粒pMYC2-COI1进行结构描述如下：在pMYC2载体的 SmalI和SacI酶切位点之间插入了序列表的序列3所示DNA得到的重组质粒(序列表的 序列3所示的DNA编码序列表的序列2所示的COI1蛋白)。重组质粒pMYC2-COI1中COI1 蛋白的编码基因和骨架载体上的6个MYC标签的编码基因形成融合基因。 0064 二、重组农杆菌的构建 0。

24、065 1、将重组质粒pMYC2-COI1载体电激转化入农杆菌菌株GV3101，28培养2-3天， 得到重组农杆菌。 0066 2、将重组农杆菌划线培养于LB培养基(含50g/ml卡那霉素、50g/ml庆大霉 素和10g/ml利福平)平板上，28倒置培养2-3天。 0067 3、挑取单克隆至2-3ml液体LB培养基(含50g/ml卡那霉素，50g/ml庆大霉 素和10g/ml利福平)中，28、240rpm培养20-24h。 0068 4、转接100-200l菌液至10ml液体LB培养基(含50g/ml卡那霉素，50g/ ml庆大霉素和10g/ml利福平)中，28、240rpm培养20-24h，。

25、至OD 600 值为0.6-0.8。 0069 实施例2、COI1蛋白的制备和纯化(蛋白表达确定) 0070 一、转化前烟草的培育 0071 1、将本生烟种子铺于MS培养基上，4黑暗春化3天后，放置于植物房中培养 说 明 书CN 102816758 A 5/9页 7 (22；16小时光照，8小时黑暗)至幼苗长出两片叶子(7-10天)。 0072 2、将幼苗移植于混合土(蛭石黑土为11；质量比)中，浇足水，继续培养 (28；16小时光照，8小时黑暗)3周(2-3周均可)。 0073 二、转化前重组农杆菌的培养 0074 1、将1ml实施例1的步骤二得到的重组农杆菌菌液装于1.5ml EP管中，2。

26、0、 4000g离心5min，收集菌体。 0075 2、用500l侵染注射液(由溶质和水组成；溶质及其含量为：10mM MgCl 2 ， 10mMMES，0.2mM乙酰丁香酮)悬浮菌体，室温放置4小时(3-5h均可)。 0076 三、用重组农杆菌瞬时转化烟草 0077 在步骤一得到的生长了32天的烟草幼苗叶片上注射步骤二得到的重组农杆菌菌 液，每个叶片注射300l，注射菌液后开始计时，69小时后分别取各个进行了注射处理的 叶片。 0078 四、COI1蛋白的提取 0079 取1.5g叶片，液氮充分研磨，加入4.5ml RB缓冲液，混匀；4、13000g离心 15min，取上清；0.22M滤器过。

27、滤，得到约4.5ml蛋白粗提液。 0080 五、对照液的制备 0081 1、转化前烟草的培育 0082 同步骤一。 0083 2、对照农杆菌的制备 0084 用pMYC2载体转化入农杆菌菌株GV3101，采用实施例1的步骤二的方法制备得到 对照农杆菌菌液。 0085 3、转化前对照农杆菌的培养 0086 用对照农杆菌代替重组农杆菌，其它同步骤二。 0087 4、用对照农杆菌转化烟草 0088 用对照农杆菌的菌液代替重组农杆菌的菌液，其它同步骤三。 0089 5、蛋白的提取 0090 (1)取1.5g叶片，液氮充分研磨，加入4.5ml RB缓冲液，混匀；4、13000g离心 15min，取上清；。

28、0.22M滤器过滤，得到约4.5ml对照粗提液。 0091 六、蛋白量的比较 0092 将步骤四得到的蛋白粗提液和步骤五得到的对照液进行western blot鉴定。所 用的一抗为抗MYC抗体(Roche，货号11667149001)，所有的二抗为羊抗鼠抗体(Abcam，货号 Ab6789)。 0093 结果见图1(各泳道均含有总蛋白25g)。步骤五得到的对照蛋白液没有显示杂 交信号，而步骤四得到的蛋白粗提液有信号，表明COI1表达正常。 0094 实施例3、COI1蛋白的制备和纯化(叶片的最佳转化时间的确定) 0095 一、转化前烟草的培育 0096 同实施例2的步骤一。 0097 二、转化。

29、前重组农杆菌的培养 0098 同实施例2的步骤二。 说 明 书CN 102816758 A 6/9页 8 0099 三、用重组农杆菌转化烟草 0100 在步骤一得到的同一烟草幼苗的不同叶片(老叶为生长44天的叶片；中叶为生长 38天的叶片；新叶为生长32天的叶片)上分别注射步骤二得到的重组农杆菌菌液，每个叶 片注射300l，注射菌液后开始计时，69小时后分别取各个进行了注射处理的叶片。 0101 四、COI1蛋白的提取 0102 同实施例2的步骤四。 0103 五、蛋白量的比较 0104 将各个叶片得到的蛋白粗提液进行western blot鉴定，同实施例2的步骤六。 0105 结果见图2(各。

30、泳道均含有总蛋白25g)。不同叶片中COI1蛋白表达的情况不 同，在幼嫩的新叶中蛋白表达量最高。 0106 实施例4、COI1蛋白的制备和纯化(蛋白表达的最佳时间的确定) 0107 一、转化前烟草的培育 0108 同实施例2的步骤一。 0109 二、转化前重组农杆菌的培养 0110 同实施例2的步骤二。 0111 三、用重组农杆菌转化烟草 0112 在步骤一得到的生长了32天的烟草幼苗叶片上注射步骤二得到的重组农杆菌菌 液，每个叶片注射300l，注射菌液后开始计时，分别于24小时、32小时、42小时、52小时、 62小时和69小时后取各个进行了注射处理的叶片。 0113 四、COI1蛋白的提取。

31、 0114 同实施例2的步骤四。 0115 五、蛋白量的比较 0116 将各个叶片得到的蛋白粗提液进行western blot鉴定，同实施例2的步骤六。 0117 结果见图3(各泳道均含有总蛋白25g)。不同表达时间的叶片COI1蛋白表达的 情况不同，注射重组农杆菌后40-70小时COI1蛋白表达量达到最高值。 0118 实施例5、COI1蛋白的制备和纯化(最佳蛋白提取缓冲液的确定) 0119 一、转化前烟草的培育 0120 同实施例2的步骤一。 0121 二、转化前重组农杆菌的培养 0122 同实施例2的步骤二。 0123 三、用重组农杆菌转化烟草 0124 在步骤一得到的生长了32天的烟草。

32、幼苗的叶片上注射步骤二得到的重组农杆菌 菌液，每个叶片注射300l，注射菌液后开始计时，69小时后取各个进行了注射处理的叶 片。 0125 四、COI1蛋白的提取 0126 取1.5g叶片，液氮充分研磨，加入4.5ml缓冲液(RB缓冲液、缓冲液A、缓冲液B、 缓冲液C、缓冲液D、缓冲液E、TBS缓冲液或PBS缓冲液)，混匀；4、13000g离心15min，取 上清；0.22M滤器过滤，得到约4.5ml蛋白粗提液。 0127 五、蛋白量的比较 说 明 书CN 102816758 A 7/9页 9 0128 将各个蛋白粗提液进行western blot鉴定，同实施例2的步骤六。 0129 结果见图。

33、4(各泳道均含有总蛋白25g)。RB缓冲液提取的蛋白状态最好。 0130 实施例6、COI1蛋白的制备和纯化(最适的MYC肽竞争洗脱浓度的确定) 0131 一、转化前烟草的培育 0132 同实施例2的步骤一。 0133 二、转化前重组农杆菌的培养 0134 同实施例2的步骤二。 0135 三、用重组农杆菌转化烟草 0136 同实施例4的步骤三。 0137 四、COI1蛋白的提取和纯化 0138 将步骤三得到的叶片进行COI1蛋白的提取和纯化，步骤如下： 0139 1、COI1蛋白的提取 0140 取1.5g叶片，液氮充分研磨，加入4.5ml RB缓冲液，混匀；4、13000g离心 15min，。

34、取上清；0.22M滤器过滤，得到约4.5ml蛋白粗提液。 0141 2、COI1蛋白的纯化 0142 (1)取100l MYC亲和介质用RB缓冲液洗5次(每次1ml)进行平衡。 0143 (2)在步骤(1)的MYC亲和介质中加入1.5ml蛋白粗提液，4、360度翻转孵育 1h。 0144 (3)用RB缓冲液清洗步骤(2)的亲和介质5次(每次1ml)，往亲和介质中加入 600l MYC肽溶液(由MYC肽和RB缓冲液组成，MYC肽的浓度分别为10g/ml、50g/ml或 100g/ml)，在4、360度翻转孵育10小时，离心(4、6000g、30s)取上清，即为MYC-COI1 蛋白液。 0145。

35、 五、蛋白量的比较 0146 将采用不同MYC肽竞争浓度得到的各个MYC-COI1蛋白液进行western blot鉴定， 同实施例2的步骤六。 0147 结果见图5。50g/ml MYC肽即可达到最大竞争洗脱效果。 0148 实施例7、COI1蛋白生物活性的检测 0149 在已知的茉莉素信号通路中，COI1蛋白在JA-Ile或冠菌素存在的情况下能与JAZ 蛋白相互作用，因此可利用COI1蛋白这一生物学功能检测纯化后的蛋白是否具有生物活 性。 0150 一、MYC-COI1蛋白液的制备 0151 1、转化前烟草的培育 0152 同实施例2的步骤一。 0153 2、转化前重组农杆菌的培养 015。

36、4 同实施例2的步骤二。 0155 3、用重组农杆菌转化烟草 0156 同实施例4的步骤三。 0157 4、COI1蛋白的提取和纯化 0158 (1)取1.5g叶片，液氮充分研磨，加入4.5ml RB缓冲液，混匀；4、13000g离心 说 明 书CN 102816758 A 8/9页 10 15min，取上清；0.22M滤器过滤，得到约4.5ml蛋白粗提液。 0159 (2)COI1蛋白的纯化 0160 取100l MYC亲和介质用RB缓冲液洗5次(每次1ml)进行平衡。 0161 在步骤的MYC亲和介质中加入1.5ml蛋白粗提液，4、360度翻转孵育1h；然 后再加入1.5ml蛋白粗提液，4。

37、、360度翻转孵育1h；然后再加入1.5ml蛋白粗提液，4、 360度翻转孵育1h。 0162 用RB缓冲液清洗步骤的亲和介质5次(每次1ml)，往亲和介质中加入600l MYC肽溶液(由MYC肽和RB缓冲液组成，MYC肽的浓度为50g/ml)，在4、360度翻转孵 育10小时，离心(4、6000g、30s)取上清，即为MYC-COI1蛋白液(蛋白浓度约350g/ml)。 0163 二、JAZ1-His蛋白液的制备 0164 1、载体构建 0165 (1)以拟南芥的cDNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩 增产物。 0166 F2：5-AAAAGAATTCATGTC。

38、GAGTTCTATGGAATG-3； 0167 R2：5-AAACTGCAGTTACATCATCATCATCATCACTATTTCAGCTGCTAAAC-3。 0168 PCR扩增程序：95预变性5min；95变性30s，60退火30s，72延伸1min，共 25个循环；72再延伸10min。 0169 (2)用限制性内切酶Ecor I和Pst I双酶切步骤(1)的PCR扩增产物，回收酶切 产物。 0170 (3)用限制性内切酶Ecor I和Pst I双酶切pMAL-c2x载体(NEB，货号#N8076S)， 回收线性化的载体骨架(约7kb)。 0171 (4)将步骤(2)的酶切产物和步骤(3。

39、)的载体骨架在T4连接酶的作用下16连 接16h，得到连接产物。 0172 (5)将步骤(4)的连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细胞，在含有100g/ml氨 苄青霉素的平板上筛选阳性克隆。 0173 (6)将步骤(5)的阳性克隆提取质粒并测序，测序结果表明得到了重组质粒 pMAL-c2x-JAZ1-HIS。根据测序结果，对重组质粒pMAL-c2x-JAZ1-HIS进行结构描述如下： 在pMAL-c2x载体的Ecor I和Pst I酶切位点之间插入了序列表的序列4所示DNA得到的 重组质粒(序列表的序列4所示的DNA编码JAZ1-His融合蛋白)。 0174 2、重组菌的构建 0175 将重组质。

40、粒pMAL-c2x-JAZ1-HIS热击转化大肠杆菌TB1菌株(NEB，货号E4122S) 感受态细胞中，得到重组菌。 0176 3、蛋白表达： 0177 (1)挑取步骤2得到的重组菌的单克隆于20ml LB液体培养基(含100g/ml氨 苄青霉素)，37 220rpm培养约16h。 0178 (2)以1100的体积比转接步骤(1)的菌液于LBG液体培养基(1胰蛋白胨， 0.5酵母提取物，0.5 NaCl，0.2葡萄糖；含100g/ml氨苄青霉素)，37 245rpm培 养约2h 30min，至OD 600 约为0.5。 0179 (3)在步骤(2)的菌液中加入1M IPTG溶液(每升菌液加入。

41、300u IPTG溶液1)， 说 明 书CN 102816758 A 10 9/9页 11 16 220rpm培养约16h。 0180 (4)取步骤(3)的菌液，离心(4，5000g，5min)，收集菌体。 0181 4、蛋白纯化 0182 (1)将步骤3收集的菌体加入100ml缓冲液50，充分悬浮。 0183 (2)超声(功率400，超声2s，停2s，超声10min)破碎菌体，离心(12000g，4， 15min)收集上清，0.22m过滤。 0184 (3)将步骤(2)的滤液以0.5ml/min的流速上样于Ni-NTA层析柱(GE healthcare，货号17-5318-02)。 0185。

42、 (4)用缓冲液50以1ml/min的流速洗脱步骤(3)的层析柱至基线。 0186 (5)用缓冲液400以1ml/min的流速对步骤(4)的层析柱进行竞争洗脱(见图6)， 收集洗脱峰(整个洗脱过程除了穿过峰仅存在一个明显的洗脱峰)。 0187 (6)用30kd超滤管将步骤(5)的洗脱液浓缩至1ml以下，使用离心(4，5000g， 30min)，收集上清。 0188 (7)将步骤(6)的上清以1ml/min的流速上样于HiPrep26/10 Desalting柱(GE healthcare，货号17508701)，用RB缓冲液以5ml/min的流速洗脱，收集洗脱峰。 0189 (8)收集的洗脱液。

43、即为JAZ1-His蛋白液，进行420l分装，-80保存。 0190 三、COI1蛋白生物学活性检测 0191 (1)将200l步骤二得到的JAZ1-His蛋白液、100l镍亲和介质(QiAgen，货号 30210)和400l RB缓冲液，在4下，360度翻转孵育1h。 0192 (2)用RB缓冲液清洗步骤(1)的亲和介质5次(每次1ml)，往亲和介质中 加入200l步骤一得到的MYC-COI1蛋白液，再加入或不加入0.5l 0.1mM冠菌素 (SigmA-Aldrich，货号C8115)和300l RB缓冲液，4下，360度翻转孵育1h；不加入冠菌 素的样品即可作为活性的阴性对照样。 019。

44、3 (3)用RB缓冲液清洗步骤(2)的亲和介质5次(每次1ml)，离心(4、6000g、30s) 收集沉淀。 0194 (4)将沉淀进行western blot鉴定，同实施例2的步骤六。 0195 结果见图7，纯化得到的MYC-COI1具有生物学活性。 说 明 书CN 102816758 A 11 1/6页 12 0001 序 列 表CN 102816758 A 12 2/6页 13 0002 0003 序 列 表CN 102816758 A 13 3/6页 14 0004 序 列 表CN 102816758 A 14 4/6页 15 0005 序 列 表CN 102816758 A 15 5/6页 16 0006 序 列 表CN 102816758 A 16 6/6页 17 序 列 表CN 102816758 A 17 1/2页 18 图1图2 图3 图4 图5 说 明 书 附 图CN 102816758 A 18 2/2页 19 图6 图7 说 明 书 附 图CN 102816758 A 19 。