改性硅纳米颗粒.pdf

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摘要
申请专利号:

CN02113904.0

申请日:

2002.01.04

公开号:

CN1356259A

公开日:

2002.07.03

当前法律状态:

终止

有效性:

无权

法律详情:

未缴年费专利权终止IPC(主分类):C01B 21/068申请日:20020104授权公告日:20041117终止日期:20150104|||授权|||公开|||实质审查的生效

IPC分类号:

C01B21/068; C12N15/11; C12P19/34; C07H21/04; A61K48/00; A61K47/04

主分类号:

C01B21/068; C12N15/11; C12P19/34; C07H21/04; A61K48/00; A61K47/04

申请人:

中南大学;

发明人:

李桂源; 朱诗国; 吕红斌; 向娟娟; 李小玲; 唐珂; 张必成; 周鸣; 谭琛

地址:

410083湖南省长沙市左家垅

优先权:

专利代理机构:

中南工业大学专利事务所

代理人:

龚灿凡

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内容摘要

本发明涉及改性硅纳米颗粒的制备方法及将其作为基因转运体的使用方法。本发明运用OP-10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(SiNP)的合成,并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用,制备改性硅纳米颗粒,作为基因转运体。DNA结合分析及DNase I消化试验发现,改性硅纳米颗粒能有效结合、浓缩和保护DNA;细胞转染试验发现它能有效传递pEGFPC-2质粒DNA进入HNE1细胞,产生高水平的GFP表达。

权利要求书

1: 一种改性硅纳米颗粒的制备方法,其特征在于:本发明运用OP-10/ 环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(SiNP)的合成,并利用硅纳 米颗粒的表面能和离子静电作用,制备改性硅纳米颗粒,主要工艺过程为: 1 将OP-10、环己烷和氨水混合,室温搅拌均匀后加入TEOS,继续搅拌 至聚合完成,加入等体积丙酮,超声分散,离心,双蒸水洗涤三次,离心收 集沉淀于80℃干燥,研细得SiNP,其中,H 2 O与OP-10及H 2 O与正硅酸异酯 (TEOS)的摩尔比为2-10、氨水浓度为1.6-28.0%、TEOS在环己烷中的摩尔 浓度为0.1-3mol/L。 2 将SiNP按0.1-10mg/mL重悬于0.6 M Na 2 CO 3 溶液中,超声分散,离 心,弃上清,再将沉淀物按0.1-10mg/mL重悬于pH为7.4的PBS中,超声 分散,加多聚赖氨酸或十六烷基三甲溴化铵,充分混匀,离心,弃上清,得 改性SiNP,其中,多聚赖氨酸的终浓度为4-15nmol/mL,十六烷基三甲溴 化铵的终浓度为100-450цM。
2: 一种改性硅纳米颗粒的使用方法,其特征在于:本发明将改性硅纳米 颗粒作为基因转运体,具体使用方法为:将改性硅纳米颗粒超声分散,按质 量比5-30∶1与DNA混合,室温静置使其结合,加无血清培基后覆盖在经 D-Hank’s液洗涤的转染细胞上,于37℃,5%CO 2 孵箱中培育4小时后换含 15%小牛血清的完全培基。

说明书


改性硅纳米颗粒

    [技术领域]本发明属于基因转移与药物传递领域。

    [背景技术]硅纳米颗粒的制备方法有物理法和化学法。物理法一般指机械粉碎法,该法工艺虽简单,但颗粒特性难以控制,且粒径分布较宽。化学法主要有以四氯化硅为原料的气相法,以硅酸钠和无机酸为原料的沉淀法和以硅酸酯等为原料的溶胶-凝胶法(sol-gel)。气相法能源消耗大,成本高;沉淀法颗粒直径分布宽,形状难以控制;sol-gel法工艺简单,粒子形状和粒径可以控制,但调控精度有限。

    [发明内容]本发明的目的是提供一种改性硅纳米颗粒的制备方法及将改性硅纳米颗粒作为基因转运体。

    本发明运用OP-10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(SiNP)的合成,并利用硅纳米颗粒的表面能和通过离子静电作用,制备改性硅纳米颗粒,作为基因转运体。主要工艺过程为:

    1>将OP-10、环己烷和氨水混合,室温搅拌均匀后加入TEOS,继续搅拌至聚合完成,加入等体积丙酮,超声分散,离心,双蒸水洗涤三次,离心收集沉淀于80℃干燥,研细得SiNP。其中,H2O与OP-10及H2O与正硅酸异酯(TEOS)的摩尔比为2-10、氨水浓度为1.6-28.0%、TEOS在环己烷中的摩尔浓度为0.1-3mol/L。

    2>将SiNP按0.1-10mg/mL重悬于0.6 M Na2CO3溶液中,超声分散,离心,弃上清,再将沉淀物按0.1-10mg/mL重悬于PBS(pH7.4)中,超声分散,加多聚赖氨酸(终浓度为4-15nmol/mL)或十六烷基三甲溴化铵(终浓度为100-450цM),充分混匀,室温混摇;离心,弃上清,沉淀重悬于双蒸水中,得改性SiNP。多聚赖氨酸的终浓度为4-15nmol/mL,十六烷基三甲溴化铵的终浓度为100-450цM。

    3>将改性硅纳米颗粒超声分散,按质量比5-30∶1与DNA混合,室温静置使其结合,加无血清培基后覆盖在经D-Hank’s液洗涤的转染细胞上,于37℃,5%CO2孵箱中培育4小时后换含15%小牛血清的完全培基。

    利用本发明,可合成粒径小、分布均匀、形态规则的改性硅纳米颗粒,使用改性硅纳米颗粒作为转运体不仅能结合、浓缩、保护和高效传递DNA分子,而且可用于携带RNA和药物分子,为实现安全、高效、靶向性基因和药物治疗提供了工具和手段。本发明在硅纳米颗粒的改性修饰方面,避免了复杂化学反应和有毒化学物质的涉入,直接运用纳米颗粒表面能和离子静电作用,成功将多聚赖氨酸和十六烷基三甲溴化铵等阳性物质修饰到硅纳米颗粒表面,从而获得了能结合、浓缩、保护和高效传递DNA、RNA分子的改性硅纳米颗粒转运体。

    [附图说明]图1:改性硅纳米颗粒电镜图(50 000倍);

    图2:改性硅纳米颗粒介导的HNE1转染(100倍)。

    [具体实施方式]实施例1:

    (1)SiNP的制备。取OP-10 11g、环己烷125mL、双蒸水1.8mL混合,室温1000rpm搅拌2小时,边搅拌边加入正硅酸异酯5.7mL,25.28%的氨水0.6mL,继续搅拌24小时,加入等体积丙酮,超声分离2小时,8000rpm离心10分钟,双蒸水洗涤数次,离心收集沉淀,80℃干燥,研细得SiNP,室温存贮备用。

    (2)改性SiNP的制备。电子天平准确称取1mg硅纳米颗粒,重悬于1mL0.6mol/L Na2CO3溶液中,超声分散15min;离心,弃上清,重悬于1mL PBS(pH7.4)中,超声分散20min;加10nmol多聚赖氨酸,充分混匀,室温混摇24h;离心,弃上清,沉淀重悬于适量双蒸水中,得改性SiNP,其电镜图如图1所示。4℃贮存备用。

    (3)改性SiNP的DNA结合试验。将改性硅纳米颗粒与绿色荧光蛋白表达载体PEGFPC-2质粒DNA按(质量比)1∶1,10∶1、30∶1,50∶1,100∶1的比例混合,其中DNA浓度恒定为1ug/100ul,室温静置1h:①1%琼脂糖凝胶60V电泳2h;②12000r/min离心10min,取上清液,紫外分光光度计检测DNA含量。

    (4)改性SiNP的DNase I保护试验。将改性硅纳米颗粒与绿色荧光蛋白表达载体PEGFPC-2质粒DNA按(质量比)0∶1、1∶1、30∶1、50∶1的比例混合,室温静置1h后各加0.5 U DNase I,37℃水浴1h;1%琼脂糖凝胶电泳。

    (5)改性SiNP的细胞转染试验。将消毒地盖玻片置六孔培养板中,接种HNE1细胞,37℃,5%CO2孵箱培育至细胞覆盖率达50~70%后转染PEGFPC-2质粒DNA。改性硅纳米颗粒细胞转染基本程序为:改性硅纳米颗粒超声分散30分钟,按20∶1与DNA混合,室温置50分钟;加无血清培基后覆盖在经D-Hank’s液洗涤的HNE1细胞上;37℃,5%CO2孵箱中培育4小时后换含15%小牛血清的完全培基;48小时后荧光显微镜观察,结果如图2所示。

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本发明涉及改性硅纳米颗粒的制备方法及将其作为基因转运体的使用方法。本发明运用OP10/环己烷/氨水微乳液自组装技术进行硅纳米颗粒(SiNP)的合成,并利用硅纳米颗粒的表面能和离子静电作用,制备改性硅纳米颗粒,作为基因转运体。DNA结合分析及DNase I消化试验发现,改性硅纳米颗粒能有效结合、浓缩和保护DNA;细胞转染试验发现它能有效传递pEGFPC2质粒DNA进入HNE1细胞,产生高水平的GFP。

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