在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法相关申请的交叉引用
本申请要求2010年3月31日递交的美国临时申请61/319,763的
优先权。
技术领域
本发明涉及在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法。
背景技术
体细胞克隆是自植物组织而非雌雄配子产生遗传均一植株的方
法。在一个体细胞克隆方法中，植物组织在包含激素，例如生长素和/
或细胞分裂素的起始培养基中培养，以起始能发育成体细胞胚的胚发
生组织，例如胚性胚柄团的形成。然后将胚发生组织在促进胚发生组
织定殖和增殖的增殖培养基中进一步培养以形成前子叶胚(即，未形
成子叶的胚)。然后将前子叶胚在促进子叶体细胞胚发育和成熟的发
育培养基中培养，可以将所述子叶体细胞胚，例如置于萌发培养基中
以生成萌芽(germinant)，随后转移到土壤中进一步生长，或者，将
其置于人工种子中并播种入土壤中，在土壤中其萌发产生幼苗。
在实验室中，植物组织体细胞克隆的增殖(维持)阶段通常采用
分批法(也称作分裂法(splitting))在摇瓶中进行液体悬浮培养。在
分批培养法的实施中，将胚发生组织在液体增殖培养基中培养一段时
间；将胚发生组织自增殖培养基中分离(例如，通过使胚发生组织自
培养基中沉淀)；而后，胚发生组织的等分试样被移出并接入单独体
积的新鲜增殖培养基中进一步培养。根据需要重复多次该方法以产生
多重各包括分批的胚发生组织培养物的容器。除了容器容积小且数量
多以外，该方法还难以控制摇瓶内的生长条件，且不同摇瓶间存在培
养物变异性。
尽管分批培养法可用于实验室规模，但将分批法用于体细胞胚的
商业规模的生产是不切实际的。生物反应器更适合于大规模生产并且
与摇瓶、分批法相比具有若干优点，包括自动化以及更紧密的监测和
控制培养环境，例如pH值、糖浓度、溶解氧、和二氧化碳的能力，从
而与摇瓶法相比，能获得更均一的培养物和更高产量的高品质体细胞
胚。
用于植物胚发生组织增殖的商业规模的液体生物反应器的成功操
作需要生物质浓度的自动化调节。在生产环境下，通过快速增殖有活
力的胚发生组织而获得成功。用于增殖植物胚发生组织的生产友好型
方法是在补料分批生物反应器中进行，其中将少量植物胚发生组织和
增殖培养基接种到所述生物反应器中，且随时间添加补加的增殖培养
基直到达到足够体积的植物胚发生组织(生物质)或达到生物反应器
的最大体积。
生物质浓度的调节是重要的，因为生物反应器中的生物质浓度与
培养基组分和细胞外产物的浓度之间密切相关。有两大类细胞外组分：
一类诱导体细胞胚发生以及一类抑制体细胞胚发生。众所周知，需要
最低的生物质浓度以诱导体细胞胚发生，同时也已显示，在高的生物
质浓度下体细胞胚发生被抑制。与生物质浓度成反比的关键的培养基
组分是糖和植物激素。在高的生物质浓度下，上述两类培养基组分可
能被耗尽。糖浓度是重要的，因为其在液体增殖培养基中是首要的渗
透剂。
为了调节生物质浓度，应当以与生物质生长最匹配的速度添加增
殖培养基。可是，这很困难，因为生物质的实际生长速度可能显著偏
离先验的估计，且在指数增加的生物质生长条件下，生物质浓度可能
失控。另一个困难是可能会向补料分批反应器中接种少量的培养物，
并在一段较长的时间，例如，数周，补料培养基，其可能导致生物反
应器中生物质严重供料不足或供料过多。
本发明提供了在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法。
发明内容
本内容用于以简化的方式介绍在详述中被进一步描述的那些概
念。本内容的目的既不在于明确要求保护的主题的关键性特征，也不
在于辅助确定要求保护的主题的范围。
本发明提供了在生物反应器中增殖植物胚发生组织的方法。本发
明的方法各包括以下步骤：(a)将植物胚发生组织和增殖培养基接种
到生物反应器中；(b)测量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接
测量参数，或与所述浓度相关的参数；(c)使用步骤(b)中获得的测
量结果计算补加的增殖培养基的流速；(d)基于步骤(c)中计算的流
速向生物反应器中输送补加的增殖培养基；以及(e)定期重复步骤(b)
到(d)。生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量参数或与所述
浓度相关的参数包括干重浓度、糖浓度(按白利糖度(Brix)测量)和
电容。也可以测量其他参数，例如鲜重浓度、pH值、不透明度、电导
和红外吸收。
本发明的方法可用于增殖任意属/种的植物胚发生组织，包括针叶
树，例如松科(Pinacea)植物，包括松属(Pinus)的成员(例如，火
炬松(Pinus taeda))，或黄杉属的成员(例如，花旗松(Pseudotsuga
menziesii))。
附图说明
参考附图可以更容易地意识到本发明前述的各方面及与之相随的
优点，就像通过参考随后的详述可以更好地理解一样，其中：
图1是生物反应器中培养基的按百分比白利糖度测量的糖浓度与
反应器中生物质浓度之间的相关性的图解；
图2是生物反应器中培养基的电容与反应器中生物质浓度之间的
相关性的图解；
图3是一段时间的生物反应器中按白利糖度测量的培养基的糖浓
度的图解，其中添加到培养物的增殖培养基的量是估计的而非用比例
积分控制器计算的；以及
图4是当添加到培养物的增殖培养基的量是用比例-积分控制器计
算时，一段时间的生物反应器中按白利糖度测量的培养基的糖浓度的
图解。
发明详述
在此使用时，术语“生物质”是指植物胚发生组织。
在此使用时，术语“植物胚发生组织”指形成胚性胚柄团的几十个
到几百个细胞的集合。
在此使用时，术语“胚性胚柄团”(ESM)指在通过出芽或卵裂的
增殖过程中的早期胚。
在此使用时，术语“补料分批过程”指组织培养分批过程，其中将
少量植物胚发生组织和增殖培养基接种入生物反应器，并且随时间添
加补加的增殖培养基直到达到足够的生物质的量或达到生物反应器的
最大容积。
体细胞胚发生过程是植物胚的体外发育过程，包括以下步骤：(1)
起始，以引发胚发生组织(例如胚性胚柄团(ESM))的形成；(2)
增殖，有时称作维持，以建立和增殖胚发生组织以形成前子叶胚；(3)
发育，以发育和形成成熟子叶体细胞胚；和(4)后发育步骤，例如分
层处理、萌发、置于人工种子中和为进一步生长和发育向土壤中转移。
本发明涉及体细胞胚发生过程的增殖阶段。
本发明提供了一种在生物反应器中增殖植物胚性组织的方法，包
括下列步骤：(a)将植物胚发生组织和增殖培养基接种到生物反应器
中；(b)测量生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量参数，或
与所述浓度相关的参数；(c)使用步骤(b)中获得的测量结果计算补
加的增殖培养基的流速；(d)基于步骤(c)中计算的流速向生物反应
器中输送补加的增殖培养基；以及(e)定期重复步骤(b)到(d)。
在本发明中，植物胚发生组织(例如ESM)和增殖培养基被接种
到生物反应器中。向生物反应器中添加植物胚发生组织和增殖培养基
的顺序无关紧要。举例来说，胚发生组织和增殖培养基可以作为一个
样品一起加入生物反应器；或者，先向生物反应器中加入组织，随后
加入培养基；或者先向生物反应器中加入培养基，随后加入胚发生组
织。
配制增殖培养基以促进胚性胚柄团的生长和增殖。培养基可以包
括激素。可以包括在培养基中的激素的实例是生长素(例如，2，4-二氯
苯氧基乙酸(2，4-D))和细胞分裂素(例如，6-苄基氨基嘌呤(BAP))。
生长素可以，例如，1mg/L到200mg/L的浓度使用。细胞分裂素可以，
例如，0.1mg/L到50mg/L的浓度使用。增殖培养基包括维持胚发生组
织的营养物质。尽管不是必须的，但通常需要的是，在增殖培养基中
包含麦芽糖作为单一的、或主要的可代谢糖源。有用的麦芽糖浓度的
实例是在大约2.5％到大约6.0％的范围内。增殖培养基的摩尔渗透压浓
度通常在100-250mM/kg的范围内。增殖培养基的组成是本领域内公知
的。可以在例如，Gupta等人，U.S.7,625,754中找到适用的增殖培养基。
在实施本发明时适用的生物反应器是WAVE Biotch 20/50 EH系
统振荡器(WAVE Biotch 20/50 EH system rocker)和WAVE Biotech
CELLBAGS。也可以使用其他振荡器系统，例如ARMA/rock摇床
(ARMA/rock shakers)，或Sartorius BIOSTAT生物反应器。
在一个实施方案中，所述植物胚发生组织是胚性胚柄团。在一个
实施方案中，所述植物胚发生组织是火炬松。在一个实施方案中，所
述植物胚发生组织是花旗松。
生物反应器中植物胚发生组织生物质浓度的直接测量参数、或与
所述浓度相关的参数包括干重浓度、糖浓度(按白利糖度测量)和电
容。在本发明的一个实施方案中，测量的参数是干重浓度。在一个实
施方案中，测量的参数是糖浓度。在一个实施方案中，以百分比白利
糖度或白利糖度为单位测量糖浓度。在一个实施方案中，测量的参数
是电容。也可以测量其他参数，例如鲜重浓度、pH值、不透明度、电
导和红外吸收。
干重浓度是生物反应器中植物胚发生组织浓度的直接测量参数。
糖浓度和电容是生物反应器中植物胚发生组织浓度的替代变量，因为
两种测量都与生物反应器中植物胚发生组织的浓度相关，但并不直接
地测量植物胚发生组织的浓度。白利糖度与植物胚发生组织浓度之间
的相关性；以及电容与植物胚发生组织浓度之间的相关性分别显示在
图1和图2。
在一个实施方案中，使用了基于模型的方式，其中使用近期的生
长历史记录和胚发生组织生物质的接种物计算补加的增殖培养基的流
速。
在一个实施方案中，使用非线性的、离散的、比例-积分反馈控制
器来计算补加的增殖培养基的流速。将基于模型的反馈方法用于调谐
控制器的响应并考虑胚发生组织的标称生长速度，从而允许以系统的
方式改变控制器的响应以配合不同的无性培养系的特定的生长特点。
指数地增加加入生物反应器的补加的增殖培养基的流速以配合胚发生
组织的生长速度，因此采用非线性反馈控制是很自然的。
基于计算的流速向生物反应器输送补加的增殖培养基。在一个实
施方案中，大约每天一次向生物反应器中输送补加的增殖培养基。在
一个实施方案中，大约每小时一次向生物反应器中输送补加的增殖培
养基。在一个实施方案中，持续地向生物反应器中输送补加的增殖培
养基。
加入生物反应器的补加的增殖培养基的组成可以与生物培养器的
起始接种中使用的增殖培养基的组成相同。加入生物反应器的补加的
增殖培养基的组成可以与生物培养器的起始接种中使用的增殖培养基
的组成不同。加入生物反应器的补加的增殖培养基的组成可以在整个
过程中保持一样，也可以有所改变。
干重浓度。在本发明的一个实施方案中，测量的参数是干重浓度。
干重浓度的测量提供了直接地确定生物反应器中植物胚发生组织浓度
的方法。干重浓度可以通过下述方式确定：从生物反应器中移出培养
样品；用真空过滤自组织中移除培养基；漂洗组织；在烘箱中干燥组
织，例如，在60℃下干燥24小时；以及之后对干燥样品进行称重。
当测量的参数是干重浓度时，补加的增殖培养基的流速可以使用
下述公式确定：
f = - 100 Δ B t arg et x o k eff Y x / s exp ( k eff t ) - - - ( 1 ) ]]>
其中ΔBtarget是目标培养物上清液白利糖度和加入的新鲜培养基白
利糖度之间的差值，即Bsp-Bm。Yx/s是生物质的产生量除以糖消耗量。
补料分批开始时Time(t)＝0，以及补料分批结束时t＝tf。可以设定补加
的增殖培养基的流速以达到导致培养物生物质的目标浓度的目标ΔB。
在每一批次的开始和结束时测量培养物体积和生物质浓度以确定
xo和keff。生物质使用下述公式确定：
x＝V·X (2)
其中V是培养物体积和X是干重生物质浓度。
使用下述公式确定有效生长速度的估计值：
k eff = 1 t f ln ( V f X f V o X o ) - - - ( 3 ) ]]>
其中Vo和Vf分别是最初和最后的培养物体积；以及Xo和Xf分别
是最初和最后的生物质干重浓度；以及tf是以天计的批次开始和结束之
间的时间。为每一系列的补料分批重复上述方法。
糖浓度。在本发明的一个实施方案中，与生物反应器中植物胚发
生组织浓度相关的测量的参数是糖浓度。糖浓度可以用以白利糖度为
单位的百分比表示，白利糖度是每100克溶质中糖的克数。白利糖度
量度与生物质浓度成反比。低的白利糖度读数反映了低的糖浓度且表
明了高的生物质；相反地，高的白利糖度读数反映了高的糖浓度且表
明了低的生物质。控制生物反应器中培养基内的糖浓度以便将生物质
浓度维持在较窄范围内，从而优化生物反应器中的条件，以最终提高
生物质的产量和质量是需要的。
通过使用补料分批的过程控制生物反应器中培养基内的糖浓度。
一开始，将植物胚发生组织和增殖培养基接种到生物反应器中。当胚
发生组织增殖时，必须向反应器添加增殖培养基，否则生物质将浓缩。
在生物反应器操作的补料分批阶段，加入生物反应器的增殖培养基的
量是受控的，从而控制生物质浓度。在本发明的一个实施方案中，通
过使用非线性离散的、比例积分反馈控制器控制加入生物反应器的补
加的增殖培养基的流速。
定期测量培养基的糖浓度。例如可以每日、每半周或每周测量糖
浓度。测量糖浓度的一个方法是自生物反应器吸取上清液样品并使用
台式折射仪测量白利糖度。测量糖浓度的另一个方法是在生物反应器
中置入原位折射仪探头。预先确定最佳白利糖度值或设定值。如果白
利糖度趋向超过设定值，减少加入培养物的增殖培养基的量。如果白
利糖度趋向低于设定值，增加添加的增殖培养基的量。通过控制加入
生物反应器的培养基的流速控制添加的培养基的量。
当测量的参数是白利糖度时，补加的培养基的流速可以使用下述
公式确定：
f＝Vo·kf exp(kft) (4)
其中f是以毫升/天表示的流速；Vo是t＝0时以毫升表示的生物反
应器容积；kf是流速系数(每天)；t是当前时长；且t以天为单位。
流速系数kf用下述公式确定：
k f n = k f n - 1 + K c [ ( B n - 1 - B n ) + Δt τ I ( B sp - B n ) ] - - - ( 5 ) ]]>
其中，n是当前样品时长，n-1是在前样品时长，kf是流速系数(每
日)；Kc是控制器增益，每百分比天；B当前样品的白利糖度值；Bsp
是目标白利糖度值；Δt是白利糖度样品之间的时长(以天表示)；以
及τI是控制器复位(reset)，天。
当前样品的白利糖度值以及白利糖度设定值或目标值是控制器的
输入信息，而流速系数是控制器的输出信息。
控制器包括一些其他计算以指导操作者/工程师调谐所述反馈控
制器。推荐下述的控制器调谐，它是基于模型的方式：
K c = 1 ( B m - B sp ) λ - - - ( 6 ) ]]>
τ I = 1 k eff - - - ( 7 ) ]]>
其中λ是所需的闭合回路时间常量和keff是标称有效生长速度。推
荐的λ是1/keff≤λ≤3/keff。
上述公式(5)是用于所要求保护的发明的实施中的、离散比例-
积分控制器的线性部分的一个实例。也可以使用其他形式的比例-积分-
微分控制器。
前述公式(4)是用于所要求保护的发明的实施中的、离散比例-
积分控制器的非线性部分的一个实例。控制器的非线性部分基于一级
生长动力学；即，流速随时间指数增长。不过也可以修改流速公式，
假定其他的生长动力学。
公式(4)以毫升/天计算补加的增殖培养基的流速。在实际中，
所计算的每日添加的培养基的量可以作为单一剂量每日投料一次，或
者可以定时，例如，每小时添加部分的量，或者，持续地将培养基加
入生物反应器。
测量和控制培养物白利糖度的优点包括：只需要少量的培养物上
清液(少到毫升的程度)，以及可以快速获取白利糖度量度。调整白
利糖度的额外的好处是直接地控制了糖浓度，以及因此直接地控制了
生物反应器中的培养基渗透势。
电容。在本发明的一个实施例中，与生物反应器中植物胚发生组
织浓度相关的测量的参数是在低无线电频率下的培养物的电容。电容
直接与有健全细胞膜的活的生物质的浓度相关。通常使用可商业购买
的设备在100kHz和20Mhz之间的低无线电频率下用交流电测量悬浮
培养物的电容。与用于白利糖度反馈控制器的方法相似，使用公式(4)
计算补加的培养基的流速，其中使用下述公式确定流速系数kf:
k f n = k f n - 1 - K c [ ( C n - 1 - C n ) + Δt τ I ( C sp - C n ) ] - - - ( 8 ) ]]>
其中，n是当前样品的时长，n-1是在前样品时长，kf是流速系数
(每天)；Kc是控制器增益，每pF天；C是以皮法为单位的当前样品
的电容值；Csp是目标电容值；Δt是电容样品之间的时长(以天表示)；
以及τI是控制器复位，天。
公式(4)以毫升/天计算补加的增殖培养基的流速。在实际中，
所计算的每日添加的培养基的量可以作为单一剂量每日投料一次，或
者可以定时，例如，每小时添加部分的量，或者，持续地将培养基加
入生物反应器。
实施例
下述实施例提供对发明的说明，而非限制。
实施例1
本实施例提供了当测量的参数是干重浓度时可以用于确定培养基
流速的计算实例。
f = - 100 Δ B t arg et x o k eff Y x / s exp ( k eff t ) - - - ( 1 ) ]]>
x＝V·X (2)
k eff = 1 t f ln ( V f X f V o X o ) - - - ( 3 ) ]]>
1.通过实验确定Yx/s或通过参考文献预测Yx/s。
2.选择ΔBtarget。
3.使用公式(3)以及来自前一补料分批(被用于接种当前的补
料分批的样品)的Vo、Vf、Xo、Xf以及tf确定keff。
4.设置Xo(针对当前补料分批)＝Xf(来自前一补料分批)。
5.用Vi接种并设置Vo(针对当前补料分批)＝Vi。
6.使用公式(2)以及分别来自步骤4和5的Xo和Vo确定xo。
7.设置t＝0以及启动计时器，t。
8.使用公式(1)持续地或定期地确定并实施f直到补料分批结束，
即，直到t＝tf。
9.测量Vf和Xf。
10.对随后各个补料分批，重复步骤3-9。
实施例2
本实施例提供当测量的参数是糖浓度(白利糖度)时可以用于确
定培养基流速的计算实例。
k f n = k f n - 1 + K c [ ( B n - 1 - B n ) + Δt τ I ( B sp - B n ) ] - - - ( 5 ) ]]>
K c = 1 ( B m - B sp ) λ - - - ( 6 ) ]]>
τ I = 1 k eff - - - ( 7 ) ]]>
1.通过实验确定keff或通过参考文献预测keff。
2.选择Bsp。
3.选择或确定Kc和τI。
a.如果使用公式6和7确定Kc和τI，
i.使用分别来自步骤1和2的keff和Bsp，
ii.测量Bm，
iii.选择λ。
4.选择Δt。
5.当n＝1时(第一白利糖度样品)：
a.设置 k f 0 = k eff , ]]>
b.测量B，
c.设置B1＝B，
d.设置B0＝B，
e.使用公式5确定
f.设置V0＝V，
g.设置t＝0以及启动计时器，t，
h.使用公式(4)、来自步骤5f的V0和来自步骤5e的持续
地或定期地确定并实施f，直到获得下一次的白利糖度量度。
6.当n≥2时(全部后续的白利糖度量度)：
a.测量B，
b.设置Bn＝B，
c.使用公式5确定
d.设置V0＝V，
e.设置t＝0以及启动计时器，t，
f.使用公式(4)、来自步骤6d的V0和来自步骤6c的持续
地或定期地确定并实施f，直到获得下一次的白利糖度量度。
7.重复步骤6。
实施例3
本实施例提供当测量的参数是电容时可用于确定培养基流速的计
算实例。
k f n = k f n - 1 - K c [ ( C n - 1 - C n ) + Δt τ I ( C sp - C n ) ] - - - ( 8 ) ]]>
1.通过实验确定keff或通过参考文献预测keff。
2.选择Bsp，KcτI和Δt。
3.当n＝1时(第一电容量度)：
a.设置 k f 0 = k eff , ]]>
b.测量C，
c.设置C1＝C，
d.设置C0＝C，
e.使用公式(8)确定
f.设置V0＝V，
g.设置t＝0以及启动计时器，t，
h.如实施例2中一样，使用公式(4)、来自步骤3f的V0和来自
步骤3e的持续地或定期地确定并实施f，直到获得下一次的电容
测量。
4.当n≥2时(全部后续的白利糖度量度)：
a.测量C，
b.设置Cn＝C，
c.使用公式9确定
d.设置V0＝V，
e.设置t＝0以及启动计时器，t，
f.使用公式(4)、来自步骤4d的V0和来自步骤4c的持续
地或定期地确定并实施f，直到获得下一次的电容测量。
5.重复步骤4。
实施例4
本实施例显示了当不使用比例积分控制器计算补加的培养基的流
速时，生物反应器中培养基内糖浓度的控制。
在本实施例中，使用WAVE Biotch 20/50 EH系统振荡器和WAVE
CELLBAGS(可以自GE Healthcare购买获得)。在2升CELLBAG中
分别增殖两种基因型：基因型A和基因型B的火炬松的胚性胚柄团。
对于基因型A，将20ml沉积的细胞体积(SCV)和80ml新鲜培
养基接种到2L的CELLBAG中。对于基因型B，将40ml SCV和160ml
新鲜培养基接种到2L的CELLBAG中。使用同样的增殖培养基培养上
述两种基因型3周。在一种处理T2中，CELLBAGS保持在20℃；在
另一种处理T3中，CELLBAGS保持在25℃。
第0-5天时不向生物反应器中添加任何培养基。第5-7天时，向生
物反应器中添加培养基的速度为每小时1.2mL；第7-14天，速度为每
小时1.9mL；第14-21天，速度为每小时4.2mL。培养基的添加速度基
于对生物反应器中存在的生物质的量的估计，整周时间添加的培养基
的总量是生物反应器中存在的生物质的估计量的4倍。
在第0、2、5、7、14和21天自生物反应器中取出上清液样品，
并测量白利糖度。整个培养期的按白利糖度测量的培养基的糖浓度显
示在图3。如在图3中所见的，从大约第5天开始，即开始添加培养基
时，两种基因型的白利糖度量度都趋于下降。结果表明，在添加的培
养基的量成倍于生物反应器中生物质的估计量的试验中，没有很好的
控制糖浓度。
实施例5
本实施例显示了当使用比例积分控制器计算补加的培养基的流速
时，生物反应器中培养基内糖浓度的控制。
在本实施例中，使用离散的PI(比例-积分)反馈控制器控制培养
物上清液的白利糖度。在培养周期频繁地测量白利糖度且使用公式(4)
和(5)在每次测量后调整培养基添加速度以驱使白利糖度达到目标值。
基于目标培养物生物质浓度确定目标白利糖度值。
在本实施例中，在2升WAVE CELLABG中增殖火炬松的基因型
C的胚性胚柄团，使用WAVE Biotch 20/50 EH系统振荡器。
将300ml基因型C的培养物接种到CELLABGS中。目标白利糖
度值如下所述：处理1-2.77％；处理2-2.50％；和处理3-3.03％。
每种处理设2个重复。在整个培养期的培养基按白利糖度测量的糖浓
度显示在图4中。如在图4中所见，PI控制器在达到和维持目标白利
糖度值方面相当成功。大约第21天时白利糖度值的急剧减少是因为培
养基系统故障，其中未能向一个区的处理添加培养基。另一区的处理
未受影响且按所编程的收到培养基。恢复受影响的处理，在第35天和
42天两组重复的样品全部接近目标白利糖度值。在生产环境中，由设
备故障、操作错误和改变培养基给料原液引起的过程干扰比较常见。
如本实施例所示，过程干扰后生物反应器能快速地返回到目标操作条
件。
虽然阐明和描述了本发明，但将理解，在不脱离本发明精神和范
围的情况下可以在其中有多种改变。