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1、(10)申请公布号 CN 102943090 A (43)申请公布日 2013.02.27 C N 1 0 2 9 4 3 0 9 0 A *CN102943090A* (21)申请号 201210403168.8 (22)申请日 2012.10.19 C12N 15/84(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人湖北省农业科学院 地址 430064 湖北省武汉市洪山区南湖瑶苑 特1号 (72)发明人向发云 李三和 游艾青 顾玉成 韩光明 陈志军 周雷 刘凯 杨国才 (74)专利代理机构武汉宇晨专利事务所 42001 代理人王。
2、敏锋 (54) 发明名称 一种籼稻高效再生及遗传转化的方法 (57) 摘要 本发明公开了一种籼稻高效再生及遗传转化 的方法，步骤:（1）愈伤组织的诱导：以籼稻成熟 胚或幼胚为外植体；（2）愈伤组织的继代增殖：挑 选淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养基培 养；（3）愈伤组织的预培养；（4）农杆菌介导的胚 性愈伤转化：将预培养的愈伤组织转移到农杆菌 工作菌液中，室温浸泡；（5）愈伤组织与农杆菌的 共培养；（6）抗性愈伤组织的筛选：将共培养后的 愈伤组织进行筛选，长出新的抗性愈伤组织；（7） 抗性愈伤组织的分化：将筛选后的抗性愈伤组织 接入分化培养基；（8）再生苗的生根：获得生根转 基因植株。筛选。
3、简便，效率高。提高了籼稻遗传转 化的效率，对3个籼稻代表性品种进行了转化，转 化率均在25%以上。 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书6页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 6 页 附图 4 页 1/2页 2 1.一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其步骤是: （1）愈伤组织的诱导： 以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡，再用0.1%质量比的氯化 汞浸泡1012min，无菌水洗涤45次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在32 34下暗培养2030天，诱导愈伤组织； 2）愈伤组织的继代增殖： 从上述得。
4、到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖培养 基，置于3234暗培养条件下，继代培养1015天； （3）愈伤组织的预培养： 将生长旺盛、颗粒直径23mm的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培养培 养基上，3234暗培养35天； （4）农杆菌介导的胚性愈伤转化： 将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的农杆菌的悬浮培养基里，在菌液吸 光度为OD600 = 0.10.5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组 织转移到农杆菌工作菌液中，室温浸泡1020min； （5）愈伤组织与农杆菌的共培养： 将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上。
5、晾干3060min， 然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26下暗培养23 天； （6）抗性愈伤组织的筛选： 将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300500mg/L特美汀的无菌水溶液浸 泡1020min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26下暗培 养1015天；第二次筛选为3234下暗培养1520天，直到长出的抗性愈伤组织； （7）抗性愈伤组织的分化： 将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于3234下2000Lux光照培养 1530天，再生绿苗； （8）再生苗的生根： 将4cm以上的再生苗转入生根培养基，3234 , 2000Lux光照。
6、培养1530天，获 得完整的生根转基因植株。 2.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述的 诱导培养基组分为：MS +2.5mg/L 2，4-D+800mg/L水解酪蛋白+500mg/L谷氨酰胺+500mg/ L脯氨酸+30g/L蔗糖+2.5g/L植物凝胶、PH为5.86.0。 3.根据权利要求1的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述的继代 增殖培养基的组分如下：以MS 为基本培养基，添加2.03.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/ L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，300500mg/L脯氨酸，30。
7、g/L 蔗糖，2.5g/L植物凝胶，PH为5.86.0。 4.根据权利要求I所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述的 籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下：以1/2 MS为基本培养基，添加2.03.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，300 权 利 要 求 书CN 102943090 A 2/2页 3 500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100200uM的乙酰丁香酮， PH为5.6。 5.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：。
8、所述的 农杆菌的悬菌培养基的组分如下：以1/2 MS为基本培养基，添加2.03.5mg/L 2，4-D， 0.050.30mg/L KT，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100200uM的乙酰丁香酮，PH为5.6。 6.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述的 籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下：以1/2 MS为基本培养基，添加2.0 3.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰 胺，300500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，10020。
9、0uM的乙 酰丁香酮，PH为5.6。 7.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述 的筛选培养基的组分如下：以MS 为培养基，添加2.03.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/ L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，300500mg/L脯氨酸，30g/ L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，2560mg/L 潮霉素，300500mg/L 特美汀，PH为5.86.0； 第一次筛选培养基的潮霉素浓度为2540mg/L，第二次筛选培养基的潮霉素浓度为40 60mg/L。 8.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征。
10、在于：所述的 分化培养基的组分如下：以MS 为培养基，添加1.52.5mg/L BA，0.51.5 mg/L KT， 0.30.8 mg/L NAA，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，30g/L蔗糖， 2.5g/L植物凝胶，PH5.8-6.0。 9.根据权利要求1所述的一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，其特征在于：所述的 生根培养基的组分如下：以1/2 MS为培养基，添加1.0mg/L NAA，0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖， 0.2g/L 活性炭，6.0g/L琼脂，pH6.0。 权 利 要 求 书CN 102943090 A 1/6页 4 一种籼稻高效再生。
11、及遗传转化的方法 技术领域 0001 本发明属于植物组织培养及基因工程技术领域，具体而言，涉及一种籼稻高效再 生及遗传转化的方法。本发明适用于籼稻成熟胚或幼胚的愈伤组织诱导与再生，以及通过 农杆菌介导外源基因的转化。 背景技术 0002 水稻是全球最重要的粮食作物之一，籼稻是我国主要的栽培类型。农杆菌介导的 遗传转化，稳定性好，且载体容纳的外源DNA片段较大，成为水稻转基因的最优选择。该方 法通过将目的基因片段插入农杆菌质粒上，然后让愈伤组织与农杆菌共培养，从而由载体 将目的基因转移并整合到水稻基因组中。其基本程序包括构建转化载体，建立受体再生体 系，导入目的基因，筛选抗性愈伤组织及获得分化的。
12、再生转基因植株等。 0003 通过转基因技术改良水稻品种已有二十多年的历史，但转化成功的报道主要集中 在粳稻上，籼稻的再生及遗传转化难度相对较大。在最新的相关研究中(Lin YJ,Zhang Q 等，Optimizing the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，PlantCell Rep.,2005,23:540547；Sivakumar P.等，High frequency plant regeneration frommature seed of elite,recalc。
13、itrant Malaysian Indica rice(Oryza sativa L.)CV.MR219,ActaBiological Hungarica,2010,61(3):313321； Wani S.H.等，An efficient and reproduciblemethod for regeneration of whole plants from mature seeds of a high yielding Indica rice(Oryza sativa L.)variety PAU201,New Biotechnol.,2011,28(4):418422)，籼稻遗传转化仍。
14、然存在转化频率低和 基因型限制的技术瓶颈。 0004 目前，有关籼稻的转基因研究中，只有部分籼稻品种能够成功获得转基因植株。大 部分籼稻较难分化，其转化周期较长，转化效率较低，甚至有些籼稻品种无法转化成功。其 原因主要是缺乏籼稻通用的高效再生体系与遗传转化方法。针对籼稻再生及遗传转化的现 状，我们详细研究了培养基的有机物成分、培养温度、激素配比、抑菌抗生素的种类与浓度 等对籼稻愈伤组织诱导、继代增殖和外源基因转化的影响，通过转化方法的改进获得本发 明，建立了一种籼稻高效再生及遗传转化的新方法。 发明内容 0005 本发明针对籼稻现有遗传转化技术的不足，是在于提供了一种籼稻高效再生及遗 传转化 。
15、的方法，建立了籼稻再生与转化的操作流程，筛选简便，效率较高。提高了籼稻遗传 转化的效率，对3个籼稻代表性品种如9311、M5274（籼型两系恢复系）、E09-2076（籼型三 系保持系）进行了转化，转化率均在25%以上。转化过程中的培养条件除了共培养、第一次 筛选阶段为26外，其余均为3234高温条件。 0006 本发明通过以下技术方案实现： 0007 一种籼稻高效再生及遗传转化的方法，它包括以下步骤： 说 明 书CN 102943090 A 2/6页 5 0008 （1）愈伤组织的诱导： 0009 以籼稻成熟胚或幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1%质量 比的氯化汞浸。
16、泡1012min，无菌水洗涤45次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养 基，在32-34下暗培养20-30天，诱导愈伤组织； 0010 （2）愈伤组织的继代增殖： 0011 从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代增殖 培养基，置于3234暗培养条件下，继代培养1015天； 0012 （3）愈伤组织的预培养： 0013 将生长旺盛、颗粒直径23mm的淡黄色愈伤组织块接种于籼稻愈伤组织的预培 养培养基上，3234暗培养35天； 0014 （4）农杆菌介导的胚性愈伤转化： 0015 将YEB平板上生长的农杆菌刮到含有乙酰丁香酮的悬菌培养基里，在菌液吸光度 为OD 600 =0。
17、.10.5的范围内进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到 农杆菌工作菌液中，室温（2025，下同）浸泡1020min； 0016 （5）愈伤组织与农杆菌的共培养： 0017 将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干30 60min，然后将愈伤组织颗粒挑到籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基上，26下暗培养 23天； 0018 （6）抗性愈伤组织的筛选： 0019 将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含300500mg/L特美汀的无菌水溶 液浸泡1020min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26下 暗培养1015天；第二次筛选为32。
18、34下暗培养1520天，直到长出所需的抗性愈 伤组织； 0020 （7）抗性愈伤组织的分化： 0021 将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于3234下2000Lux光照培养 1530天，再生绿苗； 0022 （8）再生苗的生根： 0023 将4cm以上的再生苗转入生根培养基，3234,2000Lux光照培养1530天， 获得完整的生根转基因植株。 0024 在本发明中，所述的诱导培养基组分为：以MS为基本培养基，添加2.5mg/L 2， 4-D，800mg/L水解酪蛋白，500mg/L谷氨酰胺，500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝 胶，PH为5.86.0。 0025。
19、 所述的愈伤继代增殖培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加2.03.5mg/ L 2，4-D，0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，300 500mg/L脯氨酸，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，PH为5.86.0。 0026 所述的籼稻愈伤组织的预培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加 2.03.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷 氨酰胺，300500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5g/L植物凝胶，100200uM 。
20、的乙酰丁香酮，PH为5.6。 说 明 书CN 102943090 A 3/6页 6 0027 所述的农杆菌的悬菌培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加2.0 3.5mg/L2，4-D，0.050.30mg/L KT，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，100200uM的乙酰丁香 酮，PH为5.6。 0028 所述的籼稻愈伤组织与农杆菌的共培养培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养 基，添加2.03.5mg/L 2，4-D，0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300 500mg/L谷氨酰胺，300500mg/L脯氨酸，20g/L蔗糖，10g/L葡萄糖，3.5。
21、g/L植物凝胶， 100200uM的乙酰丁香酮，PH为5.6。 0029 所述的筛选培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加2.03.5mg/L 2，4-D， 0.050.30mg/L KT，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨酰胺，300500mg/ L脯氨酸，30g/L蔗糖，3.0g/L植物凝胶，2560mg/L潮霉素，300500mg/L特美汀，PH为 5.86.0；第一次筛选培养基的潮霉素浓度为2540mg/L，第二次筛选培养基的潮霉素 浓度为4060mg/L。 0030 所述的分化培养基的组分如下：以MS为基本培养基，添加1.52.5mg/L BA， 0.51.。
22、5mg/L KT，0.30.8mg/L NAA，500800mg/L水解酪蛋白，300500mg/L谷氨 酰胺，30g/L蔗糖，2.5g/L植物凝胶，PH5.8-6.0。 0031 所述的再生苗的生根培养基的组分如下：以1/2MS为基本培养基，添加1.0mg/L NAA，0.2mg/L IBA，30g/L蔗糖，0.2g/L活性炭，6.0g/L琼脂，pH6.0。 0032 本发明的优点在于： 0033 本发明具用具有广泛代表性，对3个籼稻代表性品种如9311、M5274（籼型两系恢 复系）、E09-2076（籼型三系保持系）进行了转化，效率较高，均在25%以上。转化过程中的 培养条件除了共培养、。
23、第一次筛选阶段为26外，其余均为3234高温条件，愈伤组织 生长速度快，转化周期短（见表1）。以特美汀作为抑菌剂，抑菌效果好，避免了共培养过程中 农杆菌的过度生长对愈伤组织的负面影响（见表2）。优化后的激素配比利于愈伤组织的分 化成苗，提高了转化效率（见表3）。本发明方法在籼稻转基因研究和分子育种中具有较好的 实用性和高效性。 0034 表1不同培养温度对籼稻M5274愈伤继代的影响 0035 0036 表2不同抗生素对籼稻M5274转化愈伤的抑菌效果比较 0037 说 明 书CN 102943090 A 4/6页 7 0038 表3不同籼稻品种的再生和转化效率 0039 附图说明 0040 。
24、图1为一种M5274成熟胚诱导愈伤示意图。 0041 诱导率高，愈伤呈淡黄色球状。 0042 图2为一种M5274胚性愈伤增殖示意图。 0043 愈伤生长速度快，呈黄色，无褐化。 0044 图3为一种M5274胚性愈伤分化示意图。 0045 愈伤分化率较高。 0046 图4为一种M5274愈伤预培养示意图。 0047 愈伤呈黄色，坚硬，轻微褐化。 0048 图5为一种M5274转化愈伤初次筛选示意图。 0049 部分呈淡黄色的愈伤生长正常，部分愈伤在筛选的压力下完全褐化。 0050 图6为一种M5274转化愈伤二次筛选示意图。 0051 初次筛选中生长正常的淡黄色愈伤在二次筛选时，抗性愈伤生长。
25、迅速，其余愈伤 几乎不生长。 0052 图7为一种M5274抗性愈伤分化示意图。 0053 愈伤分化出较多绿色芽点。 0054 图8为一种M5274再生阳性植株示意图。 0055 植株生长健壮，生根良好。 具体实施方式 0056 实施例1： 说 明 书CN 102943090 A 5/6页 8 0057 1愈伤组织的诱导： 0058 以籼稻品种M5274成熟胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1% 质量比的氯化汞浸泡12min，无菌水洗涤5次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在 33下暗培养25天，诱导愈伤组织。 0059 2愈伤组织的继代增殖： 0060 从上述得到的。
26、愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代培养 基，置于33暗培养条件下，继代培养12天。 0061 3愈伤组织的预培养： 0062 将生长旺盛、颗粒直径23mm的淡黄色愈伤组织块接种于预培养培养基上，33 暗培养4天。 0063 4农杆菌介导的胚性愈伤转化： 0064 所用菌株为根癌农杆菌菌株EHA105、质粒P CAMBIA1301 ，含潮霉素抗性基因。将YEB 平板上生长的农杆菌刮到含有100uM的乙酰丁香酮的农杆菌悬浮培养基里，取吸光度为 OD 600 =0.3的工作菌液进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌 工作菌液中，室温浸泡15min。 0065 。
27、5愈伤组织与农杆菌的共培养： 0066 将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干45min， 然后将愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，26下暗培养2天。 0067 6抗性愈伤组织的筛选： 0068 将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含400mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡 15min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26下暗培养12天； 第二次筛选为33下暗培养20天，长出所需的抗性愈伤组织。 0069 7抗性愈伤组织的分化： 0070 将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于33下2000Lux光照培养25 天，再生绿苗。 0071 8再生苗。
28、的生根： 0072 将4cm以上的再生苗转入生根培养基，33,2000Lux光照培养25天，获得完整的 生根转基因植株。(参见附图h) 0073 在实施例1中，本发明人对M5274愈伤组织进行转化，将458个转化愈伤进行潮霉 素抗性筛选，并对再生植株进行PCR、Southern等分子检测，最终得到了161个阳性转化植 株，其转化效率达到了35.2%。 0074 实施例2： 0075 1愈伤组织的诱导： 0076 以籼稻品种E09-2076幼胚为外植体，先用75%体积比的酒精浸泡1min，再用0.1% 质量比的氯化汞浸泡10min，无菌水洗涤4次，最后将灭过菌的外植体接入诱导培养基，在 33下暗。
29、培养22天，诱导愈伤组织。 0077 2愈伤组织的继代增殖： 0078 从上述得到的愈伤组织中挑选生长旺盛的淡黄色颗粒状愈伤组织转入继代培养 基，置于 33暗培养条件下，继代培养14天。 说 明 书CN 102943090 A 6/6页 9 0079 3愈伤组织的预培养： 0080 将生长旺盛、颗粒直径23mm的淡黄色愈伤组织块接种于预培养培养基上，33 暗培养5天。 0081 4农杆菌介导的胚性愈伤转化： 0082 所用菌株为根癌农杆菌菌株EHA105、质粒P CAMBIA1301 ，含潮霉素抗性基因。将YEB 平板上生长的农杆菌刮到含有200uM的乙酰丁香酮的农杆菌悬浮培养基里，取吸光度为。
30、 OD 600 =0.4的工作菌液进行农杆菌介导的胚性愈伤转化，将预培养的愈伤组织转移到农杆菌 工作菌液中，室温浸泡12min。 0083 5愈伤组织与农杆菌的共培养： 0084 将侵染后的愈伤组织沥干农杆菌菌液，转入无菌滤纸上，在超净台上晾干50min， 然后将愈伤组织颗粒挑到共培养培养基上，26下暗培养3天。 0085 6抗性愈伤组织的筛选： 0086 将共培养后的愈伤组织用无菌水洗净，加入含400mg/L特美汀的无菌水溶液浸泡 15min，用无菌滤纸吸干后接入筛选培养基上筛选2次；第一次筛选为26下暗培养15天； 第二次筛选为33下暗培养22天，长出所需的抗性愈伤组织。 0087 7抗性。
31、愈伤组织的分化： 0088 将筛选后得到的抗性愈伤组织接入分化培养基，于33下2000Lux光照培养30 天，再生绿苗。 0089 8再生苗的生根： 0090 将4cm以上的再生苗转入生根培养基，33，2000Lux光照培养20天，获得完整的 生根转基因植株。 0091 在实施例2中，本发明人对E09-2076愈伤组织进行转化，将375个转化愈伤进行 潮霉素抗性筛选，并对再生植株进行PCR、Southern等分子检测，最终得到了124个阳性转 化植株，其转化效率达到了33.1%。 0092 除了以上籼稻两系恢复系M5274、籼稻保持系E09-2076外，本发明人还采用本发 明方法对其它籼稻品种如9311等进行了转化实验，均得到了阳性转基因植株，而且转化效 率在25%以上。这些研究结果更进一步证明了本发明方法的可靠性和稳定性。 说 明 书CN 102943090 A 1/4页 10 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102943090 A 10 2/4页 11 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102943090 A 11 3/4页 12 图5 图6 说 明 书 附 图CN 102943090 A 12 4/4页 13 图7 图8 说 明 书 附 图CN 102943090 A 13 。