一种小麦遗传转化方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201210505827.9	申请日：	2012.11.30
公开号：	CN102952823A	公开日：	2013.03.06
当前法律状态：	授权	有效性：	有权
法律详情：	授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):C12N 15/82申请日:20121130\|\|\|公开
IPC分类号：	C12N15/82; A01H4/00; A01H5/00	主分类号：	C12N15/82
申请人：	中国科学院植物研究所
发明人：	种康; 牛遇达; 李春华; 张景昱
地址：	100093 北京市海淀区香山南辛村20号中国科学院植物研究所发育楼218室
优先权：
专利代理机构：	北京纪凯知识产权代理有限公司 11245	代理人：	关畅
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内容摘要

本发明公开了一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法，包括如下步骤：（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；（2）将含有目的基因和潮霉素抗性基因的表达载体通过基因枪法导入胚性愈伤组织；（3）恢复培养；（4）在筛选培养基上培养35-55天；所述筛选培养基中含有35-45mg·L-1的潮霉素；（5）在含有35-45mg·L-1潮霉素的分化培养基上培养10-20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织；（6）在含有15-25mg·L-1潮霉素的分化培养基上培养30-60天，得到小苗；（7）在生根培养基上培养至生根。本发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。

权利要求书

权利要求书一种小麦遗传转化方法，包括如下步骤：（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；（2）将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤（1）的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因；（3）将完成步骤（2）的胚性愈伤组织进行恢复培养；（4）取完成步骤（3）的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35‑55天；所述筛选培养基中含有35‑45mg·L‑1的潮霉素；（5）取步骤（4）得到的胚性愈伤组织，在含有35‑45mg·L‑1W潮霉素的分化培养基上培养10‑20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织；（6）取步骤（5）得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15‑25mg·L‑1潮霉素的分化培养基上培养30‑60天，得到小苗；（7）取步骤（6）得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述预培养采用的培养基为高渗培养基。如权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的培养基。如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）和/或所述步骤（6）中，所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。权利要求1至5中任一所述的方法在小麦育种中的应用。

说明书

说明书一种小麦遗传转化方法
技术领域
本发明涉及一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。
背景技术
小麦是世界上最重要的粮食作物之一，是仅次于水稻的第二大粮食作物，在世界各地都被广泛种植。小麦是我国人民赖以为生的农作物，随着我国人口的增加和人民生活水平的提高，对小麦的产量和品质也提出了越来越高的要求。传统的常规育种已经不能满足对小麦的品种和品质的要求，转基因技术的发展打破了常规育种的限制，已经成功地在棉花、玉米、大豆、油菜等作物中培育出高产新品种，创造了良好的经济效益和社会效益。小麦由于转化效率较低，转基因株系较难获得，因而与其它作物相比分子育种相对落后。
目前小麦的转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法、农杆菌法、电激转化法和PEG法。由于小麦原生质体再生困难,所以限制了电激转化法和PEG转化法的应用。
花粉管通道介导的遗传转化是在植物授粉后将外源DNA片段通过花粉管通道导入胚囊，从而整合到受精卵基因组中，然后发育成种子。花粉管通道法简单易行，但转化后代性状变异复杂，后期筛选工作很困难，因而一直没有被广泛使用。农杆菌介导的小麦遗传转化一直是植物界研究的一道难题。人们对影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素作了深入广泛的研究，包括小麦基因型、外植体源、预培养时间、侵染和共培养时间、乙酰丁香酮、农杆菌菌株、载体以及筛选剂等都会影响转化率。农杆菌法具有转基因低拷贝、遗传稳定、能够转化相对较大片段DNA以及成本低廉等优点，但存在受基因型限制、对组织培养技术依赖性强、转化频率不高以及起始外植体单一等问题，因而应用受到一定的限制。
基因枪法是小麦转化中应用较为广泛的一种转化方法。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁,释放出的DNA分子，并且随机整合到植物基因组中,然后通过组织培养技术再生出植株。
发明内容
本发明的目的是提供一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。
本发明提供的小麦遗传转化方法，包括如下步骤：
（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；
（2）将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤（1）的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因；
（3）将完成步骤（2）的胚性愈伤组织进行恢复培养；
（4）取完成步骤（3）的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35‑55天（可为35‑45天、45‑55天、35天、45天或55天）；所述筛选培养基中含有35‑45mg·L‑1（可为37‑43mg·L‑1、37‑40mg·L‑1、40‑43mg·L‑1、37mg·L‑1、40mg·L‑1或43mg·L‑1）的潮霉素；
（5）取步骤（4）得到的胚性愈伤组织，在含有35‑45mg·L‑1（可为37‑43mg·L‑1、37‑40mg·L‑1、40‑43mg·L‑1、37mg·L‑1、40mg·L‑1或43mg·L‑1）潮霉素的分化培养基上培养10‑20天（可为10‑15天、15‑20天、10天、15天或20天），得到产生芽点的胚性愈伤组织；
（6）取步骤（5）得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15‑25mg·L‑1（可为17‑23mg·L‑1、17‑20mg·L‑1、20‑23mg·L‑1、17mg·L‑1、20mg·L‑1或23mg·L‑1）潮霉素的分化培养基上培养30‑60天（可为30‑47天、47‑60天、30天、47天或60天），得到小苗；
（7）取步骤（6）得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。
所述步骤（1）中，所述预培养采用的培养基可为高渗培养基。
所述步骤（1）中，所述预培养的条件为：25℃黑暗培养4小时。
所述步骤（2）中，所述表达载体可为植物表达载体。所述表达载体具体可为pUN1301载体、以pUN1301载体为骨架的载体、在pUN1301载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体、pCAMBIA1301载体、以pCAMBIA1301载体为骨架的载体或在pCAMBIA1301载体载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体。所述步骤（2）中，所述目的基因可为GUS基因。所述步骤（2）中，所述基因枪法的参数可为：所述表达载体的浓度为1ug/ul，采用1.0μm金粉和1100psi可裂膜。
所述pUN1301载体的构建方法如下：以pCAMBIA1301载体为骨架载体，在其多克隆位点插入序列表的序列1所示的UbiPro（启动子）和序列表的序列2所示的Noster（终止子）。
所述pUN1301载体的构建方法具体如下：以pCAMBIA1301载体为骨架载体，将BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列1所示的UbiPro（启动子），将SacI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2所示的Noster（终止子）。
所述步骤（3）中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。
所述步骤（3）中，所述恢复培养的条件为：25℃黑暗培养12小时。
所述步骤（4）中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的培养基。
所述步骤（4）中，所述培养的条件为：25℃黑暗培养，每10‑15天更换新的筛选培养基并继代。
所述步骤（5）中：所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。
所述步骤（5）中，所述培养的条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
所述步骤（6）中：所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。
所述步骤（6）中，所述培养的条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
所述步骤（7）中，所述培养的条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
所述小麦可为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料，具体可为小麦品种“京冬1号”或小麦品种“京花9号”。
所述步骤（1）中，所述小麦胚性愈伤组织可为扩繁得到的小麦胚性愈伤组织；所述扩繁的方法如下：将小麦胚性愈伤组织在胚性愈伤诱导培养基上25℃黑暗培养4‑5个月，每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基。
以上任一所述胚性愈伤诱导培养基的制备方法如下：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1‑2mg·L‑1（如1.5‑2mg·L‑1、1.5mg·L‑1或2mg·L‑1）、谷氨酰胺的浓度为200‑700mg·L‑1（如300‑700mg·L‑1、300‑500mg·L‑1、500‑700mg·L‑1、500mg·L‑1、300mg·L‑1或700mg·L‑1）、水解酪蛋白的浓度为500‑700mg·L‑1（如300‑700mg·L‑1、300‑500mg·L‑1、500‑700mg·L‑1、500mg·L‑1、300mg·L‑1或700mg·L‑1）。
以上任一所述胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1‑2mg·L‑1（如1‑1.5mg·L‑1、1.5‑2mg·L‑1、如1mg·L‑1、1.5mg·L‑1或2mg·L‑1）、谷氨酰胺的浓度为200‑700mg·L‑1（如300‑700mg·L‑1、300‑500mg·L‑1、500‑700mg·L‑1、500mg·L‑1、300mg·L‑1或700mg·L‑1）、水解酪蛋白的浓度为500‑700mg·L‑1（如300‑700mg·L‑1、300‑500mg·L‑1、500‑700mg·L‑1、500mg·L‑1、300mg·L‑1或700mg·L‑1）。
以上任一所述高渗培养基的制备方法：在所述胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.3‑0.8mol·L‑1（如0.3‑0.4mol·L‑1、0.4‑0.8mol·L‑1、0.3mol·L‑1、0.4mol·L‑1或0.8mol·L‑1）。
以上任一所述筛选培养基的制备方法：在所述胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为35‑45mg·L‑1（可为37‑43mg·L‑1、37‑40mg·L‑1、40‑43mg·L‑1、37mg·L‑1、40mg·L‑1或43mg·L‑1）。
以上任一所述胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6‑糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6‑糖基氨基嘌呤的浓度为0.5‑4mg·L‑1（如1.5‑3mg·L‑1、1.5‑2mg·L‑1、2‑3mg·L‑1、1.5mg·L‑1、2mg·L‑1或3mg·L‑1、）、水解酪蛋白的浓度为500‑700mg·L‑1（如200‑500mg·L‑1、500‑700mg·L‑1、500mg·L‑1、200mg·L‑1或700mg·L‑1）。
以上任一所述生根培养基的制备方法在MS培养基中加入α‑萘乙酸，使得α‑萘乙酸的浓度为0.5‑1.0mg·L‑1（如0.5mg·L‑1）。
以上任一所述的方法均可用于小麦育种。
以上任一所述MS培养基的制备方法具体为：按照表1的加入量将各个组分溶于水并用水定容至1L。
本发明提供的是一种利用梯度筛选法提高基因枪法转化小麦的转化效率的方法。发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到转基因小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。
附图说明
图1为胚性愈伤诱导培养基上培养4‑5个月后得到的愈伤组织的照片；A为照片；B为局部放大的照片。
图2为高渗培养基上培养4小时后愈伤组织的照片。
图3为筛选培养基上培养45天后抗性愈伤组织的照片。
图4为培养基甲上培养15天后产生芽点的胚性愈伤组织的照片；A为照片；B为局部放大的照片。
图5为培养基乙上培养47天时愈伤组织的照片。
图6为生根过程中的小苗的照片。
图7为移栽至花盆后植株生长过程中的照片。
图8为移栽至花盆后结实植株的照片。
图9为培养基乙或培养基甲上培养3‑4周时愈伤组织的照片。
图10为GUS染色后的照片。
图11为实施例5的照片。
图12为pCAMBIA1301载体的结构示意图。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，具体步骤可参见：《Molecular Cloning:ALaboratory Manual》(Smabrook,J.,Ressule L.,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
小麦品种“京冬1号”：参考文献：《新农业》；题目：冬小麦新品种——京冬1号；作者：翟惠，期卷：2003年09期：44页。
小麦品种“京花9号”：参考文献：《麦类作物学报》，题目：高产优质早熟冬小麦新品种—京花9号；作者：刘建平张立全田立平苏青赵克勇单福华张立平赵昌平；期卷：2008年，28期5卷：921页。
实施例1、培养基的制备
本实施例的各个培养基的pH值均为5.8，配制完成后120℃高压灭菌20分钟。
一、MS培养基的制备
每升MS培养基加入的各个组分及其加入量见表1。
表1每升MS培养基中各个溶质的含量
加入量(g) 硝酸钾(KNO3) 1.90 硝酸铵(NH4NO3) 1.65 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.17 七水硫酸镁(MgSO4·7H2O) 0.37 二水氯化钙(CaCl2·2H2O) 0.44 碘化钾(KI) 0.00083 硼酸(H3BO3) 0.0062 四水硫酸锰(MnSO4·4H2O) 0.0223 七水硫酸锌(ZnSO4·7H2O) 0.0086 二水钼酸钠(Na2MoO4·2H2O) 0.00025 五水硫酸铜(CuSO4·5H2O) 0.000025 六水氯化钴(CoCl2·6H2O) 0.000025 乙二胺四乙酸二钠(Na2·EDTA) 0.0373 七水硫酸亚铁(FeSO4·7H2O) 0.0278 甘氨酸(Glycine) 0.002 盐酸硫胺素(VB1) 0.0001 盐酸吡哆醇(VB6) 0.0005 烟酸(VB5) 0.0005 麦芽糖（Maltose） 30 植物凝胶Gelzan（Sigma公司） 2.5
MS培养基的制备方法：按照表1的加入量将各个组分溶于水并用水定容至1L，调pH值至5.8，120℃高压灭菌20分钟。
用步骤一制备的MS培养基作为基础培养基，配制步骤二中的其它培养基。
二、其它培养基的制备
胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸（俗称2，4‑D）、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为2mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为500mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为500mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
高渗培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.4mol·L‑1。
筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为40mg·L‑1。
胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6‑糖基氨基嘌呤（俗称激动素KT）和水解酪蛋白，使得6‑糖基氨基嘌呤的浓度为2mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
生根培养基的制备方法在MS培养基中加入α‑萘乙酸（俗称生长素NAA），使得α‑萘乙酸的浓度为0.5mg·L‑1。
实施例2、重组质粒的构建
一、pUN1301载体的构建
以pCAMBIA1301载体（如序列表的序列4所示；结构示意图见图12；购自上海迪奥生物科技有限公司，产品目录号BDRH209）为骨架载体，将BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列1所示的UbiPro（启动子），将SacI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2所示的Noster（终止子）。
二、TaCYP‑pUN1301载体的构建
将pUN1301载体KpnI和SacI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列3所示的TaCYP基因（TaCYP基因是与小麦株型相关的基因，超表达会使植株矮化）。
实施例3、小麦的遗传转化
采用实施例1制备的培养基进行实施例3。
一、小麦愈伤的准备
1、取小麦品种“京冬1号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4‑5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养4‑5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织（照片见图1）。
2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25℃黑暗培养4小时（照片见图2）。
二、基因枪转化小麦愈伤
将pUN1301载体通过基因枪轰击步骤一得到的愈伤组织。轰击条件：pUN1301载体的浓度为1μg/μl；采用直径为1.0μm的金粉，1100psi的可裂膜；靶材料至可裂膜的距离为9厘米。
三、转化后小麦愈伤的梯度筛选
1、第一组处理
（1）将完成步骤二的愈伤组织置于高渗培养基上，25℃黑暗培养12小时。
（2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于筛选培养基上，25℃黑暗培养45天，每15天更换新的筛选培养基并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织（照片见图3），颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。
（3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于培养基甲（培养基甲的制备方法：在胚性愈伤分化培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为40mg·L‑1）上，培养15天，得到产生芽点的胚性愈伤组织（照片见图4）。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
（4）将步骤（3）得到的产生芽点的胚性愈伤组织置于培养基乙（培养基乙的制备方法：在胚性愈伤分化培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为20mg·L‑1）上，培养47天，每15天更换新的培养基乙并继代，芽点发育成小苗。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。培养3‑4周时的照片见图9A，多数芽点能够正常发育成小苗。培养结束时的照片见图5。
（5）将步骤（4）得到的2厘米左右的小苗置于生根培养基上，培养至小苗生根且根长为10厘米左右(生根过程中的小苗见图6)，打开容器封口膜，炼苗2‑3天。培养条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
共得到149株成活的植株。成苗率为49%。成苗率=步骤（5）得到的成活植株的个数/用于步骤（4）的产生芽点的胚性愈伤组织个数×100%。
（6）将步骤（5）得到的植株移栽到花盆中（装有等质量混合的营养土和蛭石），于人工气候室中培养。培养条件为：21℃±5℃，光暗周期为16小时/8小时。植株生长过程中的照片见图7，植株结实的照片见图8。小麦植株均能正常生长，开花结实，顺利繁育下一代。
（7）通过GUS染色鉴定遗传转化效率
GUS染液（pH 7.0）由水和溶质组成；溶质及其在GUS染液中的浓度如下：100mM磷酸钠、10mM EDTA、0.5%（体积比）Triton X‑100、0.5mM亚铁氰化钾、0.5mM铁氰化钾和1mM X‑Gluc（北京中生瑞泰科技有限公司。
取步骤（6）中培养1个月的植株的根部，在GUS染液中于25℃浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。
149株成活的植株中，31株为阳性植株，遗传转化率为20.8%。149株成活的植株中，根部显示较弱GUS活性的样本的照片见图10A，根部显示中等GUS活性的样本的照片见图10B，根部显示较强GUS活性的样本的照片见图10C，根部不显示GUS活性的样本的照片见图10D。小麦品种“京冬1号”的根的GUS染色后的照片见图10E，不显示GUS活性。
2、第二组处理
步骤（4）中用培养基甲代替培养基乙，其它完全同步骤1。培养3‑4周时的照片见图9B。许多芽点即使能够形成，也不能正常发育成小苗；
共得到101株成活的植株，成苗率为21%。
101株成活的植株中，27株为GUS鉴定阳性植株，遗传转化率为26.7%。
3、第三组处理
步骤（4）中，用胚性愈伤分化培养基代替培养基乙，其它完全同步骤1。
共得到89株成活的植株，成苗率为51%。
89株成活的植株中，15株为GUS鉴定阳性植株，遗传转化率为16.9%。
综合步骤1至3的结果。步骤（4）中，如果不采用潮霉素进行筛选，成苗率较高，但遗传转化率很低。采用20mg·L‑1潮霉素筛选时，比采用40mg·L‑1潮霉素筛选的遗传转化率略有降低，但成苗率大大升高，获得的转化苗总数大大增加了，即降低筛选压以利于芽点的生长，提高芽点的正常发育率。
实施例4、小麦的遗传转化
用TaCYP‑pUN1301载体代替pUN1301载体，其它完全同实施例3。
第一组处理中，成苗率为42%，遗传转化率为13%。
第二组处理中，成苗率为16%，遗传转化率为14%。
第三组处理中，成苗率为59%，遗传转化率为6%。
实施例5、培养基对胚性愈伤组织产生芽点的影响
一、培养基的制备
培养基Ⅰ：与实施例1的MS培养基的差别仅在于用等质量的蔗糖取代麦芽糖，每升加入0.1g肌醇。
培养基Ⅱ的制备方法：在培养基Ⅰ中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为2mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为500mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
培养基Ⅲ的制备方法：在培养基Ⅰ中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为500mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
培养基Ⅳ的制备方法：在培养基Ⅱ中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.4mol·L‑1。
培养基Ⅴ的制备方法：在培养基Ⅱ中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为40mg·L‑1。
培养基Ⅵ培养基的制备方法：在培养基Ⅰ中加入6‑糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6‑糖基氨基嘌呤的浓度为2mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为500mg·L‑1。
二、小麦愈伤的准备
1、取小麦品种“京冬1号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4‑5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于培养基Ⅱ上，25℃黑暗培养4‑5个月（每2周继代一次，继代时均采用培养基Ⅲ），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。
2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于培养基Ⅳ中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25℃黑暗培养4小时。
三、基因枪转化小麦愈伤
同实施例3的步骤二。
四、转化后小麦愈伤的梯度筛选
1、第一组处理
（1）将完成步骤三的愈伤组织置于培养基Ⅳ上，25℃黑暗培养12小时。
（2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于培养基Ⅴ上，25℃黑暗培养45天，每15天更换新的培养基Ⅴ并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织，颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。
（3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于含有40mg·L‑1潮霉素的培养基Ⅵ上，培养15天，得到产生芽点的胚性愈伤组织。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
照片见图11。与实施例3中的图4相比，图11产生的芽点数量较少。
实施例6、小麦的遗传转化
一、培养基的制备
1、MS培养基的制备
同实施例1的步骤一。
用步骤1制备的MS培养基作为基础培养基，配制步骤2中的其它培养基。
2、其它培养基的制备
胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为300mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为300mg·L‑1。
胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为300mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为300mg·L‑1。
高渗培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.3mol·L‑1。
筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为37mg·L‑1。
胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6‑糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6‑糖基氨基嘌呤的浓度为1.5mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为300mg·L‑1。
生根培养基的制备方法在MS培养基中加入α‑萘乙酸（俗称生长素NAA），使得α‑萘乙酸的浓度为0.5mg·L‑1。
二、小麦愈伤的准备
1、用小麦组织取代
取小麦品种“京花9号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4‑5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养4‑5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。
2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25℃黑暗培养4小时。
三、基因枪转化小麦愈伤
将TaCYP‑pUN1301载体通过基因枪轰击步骤二得到的愈伤组织。轰击条件：TaCYP‑pUN1301载体的浓度为1μg/μl；采用直径为1.0μm的金粉，1100psi的可裂膜；靶材料至可裂膜的距离为9厘米。
四、转化后小麦愈伤的梯度筛选
（1）将完成步骤三的愈伤组织置于高渗培养基上，25℃黑暗培养12小时。
（2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于筛选培养基上，25℃黑暗培养35天，每10‑15天更换新的筛选培养基并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织，颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。
（3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于含37mg·L‑1潮霉素的胚性愈伤分化培养基上，培养10天，得到产生芽点的胚性愈伤组织。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
（4）将步骤（3）得到的产生芽点的胚性愈伤组织置于含17mg·L‑1潮霉素的胚性愈伤分化培养基上上，培养30天，每15天更换新的相同的培养基并继代，芽点发育成小苗。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
（5）将步骤（4）得到的2厘米左右的小苗置于生根培养基上，培养至小苗生根且根长为10厘米左右，打开容器封口膜，炼苗2‑3天。培养条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
共得到105株成活的植株。成苗率为47%。
（6）将步骤（5）得到的植株移栽到花盆中（装有等质量混合的营养土和蛭石），于人工气候室中培养。培养条件为：21℃±5℃，光暗周期为16小时/8小时。
（7）通过GUS染色鉴定遗传转化效率
取步骤（6）中培养1个月的植株的根部，在GUS染液中于25℃浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。
成活的植株中，11株为阳性植株，遗传转化率为10%。
实施例7、小麦的遗传转化
一、培养基的制备
1、MS培养基的制备
同实施例1的步骤一。
用步骤1制备的MS培养基作为基础培养基，配制步骤2中的其它培养基。
2、其它培养基的制备
胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为700mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为700mg·L‑1。
胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4‑二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4‑二氯苯氧乙酸的浓度为1mg·L‑1、谷氨酰胺的浓度为700mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为700mg·L‑1。
高渗培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.8mol·L‑1。
筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为43mg·L‑1。
胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6‑糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6‑糖基氨基嘌呤的浓度为3mg·L‑1、水解酪蛋白的浓度为700mg·L‑1。
生根培养基的制备方法在MS培养基中加入α‑萘乙酸（俗称生长素NAA），使得α‑萘乙酸的浓度为0.5mg·L‑1。
二、小麦愈伤的准备
1、用小麦组织取代
取小麦品种“京花9号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4‑5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25℃黑暗培养4‑5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。
2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25℃黑暗培养4小时。
三、基因枪转化小麦愈伤
将TaCYP‑pUN1301载体通过基因枪轰击步骤二得到的愈伤组织。轰击条件：TaCYP‑pUN1301载体的浓度为1μg/μl；采用直径为1.0μm的金粉，1100psi的可裂膜；靶材料至可裂膜的距离为9厘米。
四、转化后小麦愈伤的梯度筛选
（1）将完成步骤三的愈伤组织置于高渗培养基上，25℃黑暗培养12小时。
（2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于筛选培养基上，25℃黑暗培养55天，每10‑15天更换新的筛选培养基并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织，颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。
（3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于含43mg·L‑1潮霉素的胚性愈伤分化培养基上，培养20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
（4）将步骤（3）得到的产生芽点的胚性愈伤组织置于含23mg·L‑1潮霉素的胚性愈伤分化培养基上上，培养60天，每15天更换新的相同的培养基并继代，芽点发育成小苗。培养条件：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
（5）将步骤（4）得到的2厘米左右的小苗置于生根培养基上，培养至小苗生根且根长为10厘米左右，打开容器封口膜，炼苗2‑3天。培养条件为：25℃，光暗周期为12小时/12小时。
共得到86株成活的植株。成苗率为37%。
（6）将步骤（5）得到的植株移栽到花盆中（装有等质量混合的营养土和蛭石），于人工气候室中培养。培养条件为：21℃±5℃，光暗周期为16小时/8小时。
（7）通过GUS染色鉴定遗传转化效率
取步骤（6）中培养1个月的植株的根部，在GUS染液中于25℃浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。
成活的植株中，13株为阳性植株，遗传转化率为15%。

资源描述

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1、(10)申请公布号 CN 102952823 A (43)申请公布日 2013.03.06 C N 1 0 2 9 5 2 8 2 3 A *CN102952823A* (21)申请号 201210505827.9 (22)申请日 2012.11.30 C12N 15/82(2006.01) A01H 4/00(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20 号中国科学院植物研究所发育楼218 室 (72)发明人种康牛遇达李春华张景昱 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限公司 11245。

2、代理人关畅 (54) 发明名称一种小麦遗传转化方法 (57) 摘要本发明公开了一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法，包括如下步骤：（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；（2）将含有目的基因和潮霉素抗性基因的表达载体通过基因枪法导入胚性愈伤组织；（3）恢复培养；（4）在筛选培养基上培养35-55天；所述筛选培养基中含有35-45mgL -1 的潮霉素；（5）在含有35-45mgL -1 潮霉素的分化培养基上培养10-20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织；（6）在含有15-25mgL -1 潮霉素的分化培养基上培养30-60天，得到。

3、小苗；（7）在生根培养基上培养至生根。本发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页说明书11页序列表10页附图5页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 11 页序列表 10 页附图 5 页 1/1页 2 1.一种小麦遗传转化方法，包括如下步骤：（1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养；（2）将含有目的基因的表达载体通过基因枪法导入完成步骤（1）的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因；（3）将完成步骤（2）的胚性愈伤组。

4、织进行恢复培养；（4）取完成步骤（3）的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35-55天；所述筛选培养基中含有35-45mgL -1 的潮霉素；（5）取步骤（4）得到的胚性愈伤组织，在含有35-45mgL -1W 潮霉素的分化培养基上培养10-20天，得到产生芽点的胚性愈伤组织；（6）取步骤（5）得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15-25mgL -1 潮霉素的分化培养基上培养30-60天，得到小苗；（7）取步骤（6）得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述步骤（1）中，所述预培养采用的培养基为高渗培养基。 3.如权利要求1或2所述的方。

5、法，其特征在于：所述步骤（3）中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。 4.如权利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（4）中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的培养基。 5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述步骤（5）和/或所述步骤（6）中，所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。 6.权利要求1至5中任一所述的方法在小麦育种中的应用。权利要求书CN 102952823 A 1/11页 3 一种小麦遗传转化方法技术领域 0001 本发明涉及一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。背。

6、景技术 0002 小麦是世界上最重要的粮食作物之一，是仅次于水稻的第二大粮食作物，在世界各地都被广泛种植。小麦是我国人民赖以为生的农作物，随着我国人口的增加和人民生活水平的提高，对小麦的产量和品质也提出了越来越高的要求。传统的常规育种已经不能满足对小麦的品种和品质的要求，转基因技术的发展打破了常规育种的限制，已经成功地在棉花、玉米、大豆、油菜等作物中培育出高产新品种，创造了良好的经济效益和社会效益。小麦由于转化效率较低，转基因株系较难获得，因而与其它作物相比分子育种相对落后。 0003 目前小麦的转化方法主要有花粉管通道法、基因枪法、农杆菌法、电激转化法和 PEG法。由于小麦原生质体。

7、再生困难,所以限制了电激转化法和PEG转化法的应用。 0004 花粉管通道介导的遗传转化是在植物授粉后将外源DNA片段通过花粉管通道导入胚囊，从而整合到受精卵基因组中，然后发育成种子。花粉管通道法简单易行，但转化后代性状变异复杂，后期筛选工作很困难，因而一直没有被广泛使用。农杆菌介导的小麦遗传转化一直是植物界研究的一道难题。人们对影响农杆菌介导小麦遗传转化的因素作了深入广泛的研究，包括小麦基因型、外植体源、预培养时间、侵染和共培养时间、乙酰丁香酮、农杆菌菌株、载体以及筛选剂等都会影响转化率。农杆菌法具有转基因低拷贝、遗传稳定、能够转化相对较大片段DNA以及成本低廉等优点，但存在受基。

8、因型限制、对组织培养技术依赖性强、转化频率不高以及起始外植体单一等问题，因而应用受到一定的限制。 0005 基因枪法是小麦转化中应用较为广泛的一种转化方法。基因枪转化法是借助高速运动的金属微粒使附着于其表面的核酸分子穿过受体的细胞壁,释放出的DNA分子，并且随机整合到植物基因组中,然后通过组织培养技术再生出植株。发明内容 0006 本发明的目的是提供一种小麦遗传转化方法，具体来说涉及一种通过抗生素梯度筛选增加小麦遗传转化效率的方法。 0007 本发明提供的小麦遗传转化方法，包括如下步骤： 0008 （1）将小麦胚性愈伤组织进行预培养； 0009 （2）将含有目的基因的表达载体通过基因。

9、枪法导入完成步骤（1）的胚性愈伤组织；所述表达载体含有潮霉素抗性基因； 0010 （3）将完成步骤（2）的胚性愈伤组织进行恢复培养； 0011 （4）取完成步骤（3）的胚性愈伤组织，在筛选培养基上培养35-55天（可为35-45 天、45-55天、35天、45天或55天）；所述筛选培养基中含有35-45mgL -1 （可为37-43mgL -1 、 37-40mgL -1 、40-43mgL -1 、37mgL -1 、40mgL -1 或43mgL -1 ）的潮霉素；说明书CN 102952823 A 2/11页 4 0012 （5）取步骤（4）得到的胚性愈伤组织，在含有35-45m。

10、gL -1 （可为37-43mgL -1 、 37-40mgL -1 、40-43mgL -1 、37mgL -1 、40mgL -1 或43mgL -1 ）潮霉素的分化培养基上培养 10-20天（可为10-15天、15-20天、10天、15天或20天），得到产生芽点的胚性愈伤组织； 0013 （6）取步骤（5）得到的产生芽点的胚性愈伤组织，在含有15-25mgL -1 （可为 17-23mgL -1 、17-20mgL -1 、20-23mgL -1 、17mgL -1 、20mgL -1 或23mgL -1 ）潮霉素的分化培养基上培养30-60天（可为30-47天、47-60天、30天、。

11、47天或60天），得到小苗； 0014 （7）取步骤（6）得到的小苗，在生根培养基上培养至生根。 0015 所述步骤（1）中，所述预培养采用的培养基可为高渗培养基。 0016 所述步骤（1）中，所述预培养的条件为：25黑暗培养4小时。 0017 所述步骤（2）中，所述表达载体可为植物表达载体。所述表达载体具体可为 pUN1301载体、以pUN1301载体为骨架的载体、在pUN1301载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体、pCAMBIA1301载体、以pCAMBIA1301载体为骨架的载体或在pCAMBIA1301载体载体的多克隆位点插入外源基因得到的载体。所述步骤（2）中，所述目的基因可。

12、为GUS 基因。所述步骤（2）中，所述基因枪法的参数可为：所述表达载体的浓度为1ug/ul，采用 1.0m金粉和1100psi可裂膜。 0018 所述pUN1301载体的构建方法如下：以pCAMBIA1301载体为骨架载体，在其多克隆位点插入序列表的序列1所示的UbiPro（启动子）和序列表的序列2所示的Noster（终止子）。 0019 所述pUN1301载体的构建方法具体如下：以pCAMBIA1301载体为骨架载体，将 BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列1所示的UbiPro（启动子），将SacI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2所示。

13、的Noster（终止子）。 0020 所述步骤（3）中，所述恢复培养采用的培养基为高渗培养基。 0021 所述步骤（3）中，所述恢复培养的条件为：25黑暗培养12小时。 0022 所述步骤（4）中，所述筛选培养基为在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素得到的培养基。 0023 所述步骤（4）中，所述培养的条件为：25黑暗培养，每10-15天更换新的筛选培养基并继代。 0024 所述步骤（5）中：所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。 0025 所述步骤（5）中，所述培养的条件为：25，光暗周期为12小时/12小时。 0026 所述步骤（6）中：所述分化培养基为胚性愈伤分化培养基。 0027 所述。

14、步骤（6）中，所述培养的条件为：25，光暗周期为12小时/12小时。 0028 所述步骤（7）中，所述培养的条件为：25，光暗周期为12小时/12小时。 0029 所述小麦可为栽培或野生小麦品种、品系、育种材料或中间材料，具体可为小麦品种“京冬1号”或小麦品种“京花9号”。 0030 所述步骤（1）中，所述小麦胚性愈伤组织可为扩繁得到的小麦胚性愈伤组织；所述扩繁的方法如下：将小麦胚性愈伤组织在胚性愈伤诱导培养基上25黑暗培养4-5个月，每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基。 0031 以上任一所述胚性愈伤诱导培养基的制备方法如下：在MS培养基中加入2,4-二说明书CN 1。

15、02952823 A 3/11页 5 氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1-2mgL -1 （如 1.5-2mgL -1 、1.5mgL -1 或2mgL -1 ）、谷氨酰胺的浓度为200-700mgL -1 （如300-700mgL -1 、 300-500mgL -1 、500-700mgL -1 、500mgL -1 、300mgL -1 或700mgL -1 ）、水解酪蛋白的浓度为 500-700mgL -1 （如300-700mgL -1 、300-500mgL -1 、500-700mgL -1 、500mgL -1 、300mgL -1 或700m。

16、gL -1 ）。 0032 以上任一所述胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1-2mgL -1 （如 1-1.5mgL -1 、1.5-2mgL -1 、如1mgL -1 、1.5mgL -1 或2mgL -1 ）、谷氨酰胺的浓度为 200-700mgL -1 （如300-700mgL -1 、300-500mgL -1 、500-700mgL -1 、500mgL -1 、300mgL -1 或700mgL -1 ）、水解酪蛋白的浓度为500-700mgL -1 （如300-700mgL -1 、300。

17、-500mgL -1 、 500-700mgL -1 、500mgL -1 、300mgL -1 或700mgL -1 ）。 0033 以上任一所述高渗培养基的制备方法：在所述胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.3-0.8molL -1 （如0.3-0.4molL -1 、0.4-0.8molL -1 、 0.3molL -1 、0.4molL -1 或0.8molL -1 ）。 0034 以上任一所述筛选培养基的制备方法：在所述胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为35-45mgL -1 （可为37-43mgL -1 、37-40mgL -1 、40-43m。

18、gL -1 、 37mgL -1 、40mgL -1 或43mgL -1 ）。 0035 以上任一所述胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.5-4mgL -1 （如1.5-3mgL -1 、 1.5-2mgL -1 、2-3mgL -1 、1.5mgL -1 、2mgL -1 或3mgL -1 、）、水解酪蛋白的浓度为 500-700mgL -1 （如200-500mgL -1 、500-700mgL -1 、500mgL -1 、200mgL -1 或700mgL -1 ）。 0036 以上任一所述生根培养基的制备方法。

19、在MS培养基中加入-萘乙酸，使得-萘乙酸的浓度为0.5-1.0mgL -1 （如0.5mgL -1 ）。 0037 以上任一所述的方法均可用于小麦育种。 0038 以上任一所述MS培养基的制备方法具体为：按照表1的加入量将各个组分溶于水并用水定容至1L。 0039 本发明提供的是一种利用梯度筛选法提高基因枪法转化小麦的转化效率的方法。发明操作简单易行，转化效率高，转化后所得到转基因小麦幼苗生长状态良好，具有非常大的实际应用价值和市场推广前景。附图说明 0040 图1为胚性愈伤诱导培养基上培养4-5个月后得到的愈伤组织的照片；A为照片； B为局部放大的照片。 0041 图2为高渗培养基。

20、上培养4小时后愈伤组织的照片。 0042 图3为筛选培养基上培养45天后抗性愈伤组织的照片。 0043 图4为培养基甲上培养15天后产生芽点的胚性愈伤组织的照片；A为照片；B为局部放大的照片。 0044 图5为培养基乙上培养47天时愈伤组织的照片。 0045 图6为生根过程中的小苗的照片。说明书CN 102952823 A 4/11页 6 0046 图7为移栽至花盆后植株生长过程中的照片。 0047 图8为移栽至花盆后结实植株的照片。 0048 图9为培养基乙或培养基甲上培养3-4周时愈伤组织的照片。 0049 图10为GUS染色后的照片。 0050 图11为实施例5的照片。 0051。

21、图12为pCAMBIA1301载体的结构示意图。具体实施方式 0052 以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，具体步骤可参见：Molecular Cloning:ALaboratory Manual(Smabrook,J.,Ressule L.,David W.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3 rd edition,2001,NY,Cold Spring Harbor)。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设。

22、置三次重复实验，结果取平均值。 0053 小麦品种“京冬1号”：参考文献：新农业；题目：冬小麦新品种京冬1号；作者：翟惠，期卷：2003年09期：44页。 0054 小麦品种“京花9号”：参考文献：麦类作物学报，题目：高产优质早熟冬小麦新品种京花9号；作者：刘建平张立全田立平苏青赵克勇单福华张立平赵昌平；期卷：2008年，28期5卷：921页。 0055 实施例1、培养基的制备 0056 本实施例的各个培养基的pH值均为5.8，配制完成后120高压灭菌20分钟。 0057 一、MS培养基的制备 0058 每升MS培养基加入的各个组分及其加入量见表1。 0059 表1每升M。

23、S培养基中各个溶质的含量 0060 加入量(g) 硝酸钾(KNO 3 ) 1.90 硝酸铵(NH 4 NO 3 ) 1.65 磷酸二氢钾(KH 2 PO 4 ) 0.17 七水硫酸镁(MgSO 4 7H 2 O) 0.37 二水氯化钙(CaCl 2 2H 2 O) 0.44 碘化钾(KI) 0.00083 硼酸(H 3 BO 3 ) 0.0062 说明书CN 102952823 A 5/11页 7 四水硫酸锰(MnSO 4 4H 2 O) 0.0223 七水硫酸锌(ZnSO 4 7H 2 O) 0.0086 二水钼酸钠(Na 2 MoO 4 2H 2 O) 0.00025 五水硫酸铜(Cu。

24、SO 4 5H 2 O) 0.000025 六水氯化钴(CoCl 2 6H 2 O) 0.000025 乙二胺四乙酸二钠(Na 2 EDTA) 0.0373 七水硫酸亚铁(FeSO 4 7H 2 O) 0.0278 甘氨酸(Glycine) 0.002 盐酸硫胺素(VB1) 0.0001 盐酸吡哆醇(VB6) 0.0005 烟酸(VB5) 0.0005 麦芽糖（Maltose） 30 植物凝胶Gelzan（Sigma公司） 2.5 0061 MS培养基的制备方法：按照表1的加入量将各个组分溶于水并用水定容至1L，调 pH值至5.8，120高压灭菌20分钟。 0062 用步骤一制备的MS培养基作。

25、为基础培养基，配制步骤二中的其它培养基。 0063 二、其它培养基的制备 0064 胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸（俗称 2，4-D）、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为2mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为500mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为500mgL -1 。 0065 胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为500mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为500mgL -1 。 0066 高渗培养基的制备方法：在胚。

26、性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.4molL -1 。 0067 筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为40mgL -1 。 0068 胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6-糖基氨基嘌呤（俗称激动素KT）和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为2mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为 500mgL -1 。 0069 生根培养基的制备方法在MS培养基中加入-萘乙酸（俗称生长素NAA），使得说明书CN 102952823 A 6/11页 8 -萘乙酸的浓度为0.5mgL -1 。 0070 实施例2、重组质粒的构建 0。

27、071 一、pUN1301载体的构建 0072 以pCAMBIA1301载体（如序列表的序列4所示；结构示意图见图12；购自上海迪奥生物科技有限公司，产品目录号BDRH209）为骨架载体，将BamHI和HindIII酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列1所示的UbiPro（启动子），将SacI和EcoRI酶切位点之间的小片段替换为了序列表的序列2所示的Noster（终止子）。 0073 二、TaCYP-pUN1301载体的构建 0074 将pUN1301载体KpnI和SacI酶切位点之间的小片段替换为序列表的序列3所示的TaCYP基因（TaCYP基因是与小麦株型相关的基因，超表达会。

28、使植株矮化）。 0075 实施例3、小麦的遗传转化 0076 采用实施例1制备的培养基进行实施例3。 0077 一、小麦愈伤的准备 0078 1、取小麦品种“京冬1号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4-5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25黑暗培养4-5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织（照片见图1）。 0079 2、从步骤1得到的愈伤组织中取。

29、直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25黑暗培养4小时（照片见图2）。 0080 二、基因枪转化小麦愈伤 0081 将pUN1301载体通过基因枪轰击步骤一得到的愈伤组织。轰击条件：pUN1301载体的浓度为1g/l；采用直径为1.0m的金粉，1100psi的可裂膜；靶材料至可裂膜的距离为9厘米。 0082 三、转化后小麦愈伤的梯度筛选 0083 1、第一组处理 0084 （1）将完成步骤二的愈伤组织置于高渗培养基上，25黑暗培养12小时。 0085 （2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于筛选培养基上，25黑暗培养45天，每15天更换新的筛选培养基并继。

30、代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织（照片见图3），颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。 0086 （3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于培养基甲（培养基甲的制备方法：在胚性愈伤分化培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为40mgL -1 ）上，培养15天，得到产生芽点的胚性愈伤组织（照片见图4）。培养条件：25，光暗周期为12小时/12小时。 0087 （4）将步骤（3）得到的产生芽点的胚性愈伤组织置于培养基乙（培养基乙的制备方法：在胚性愈伤分化培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为20mgL -1 ）上，培养47天，每15天更换新的培养基乙并继代，芽点发育成。

31、小苗。培养条件：25，光暗周期为12小时 /12小时。培养3-4周时的照片见图9A，多数芽点能够正常发育成小苗。培养结束时的照片见图5。 0088 （5）将步骤（4）得到的2厘米左右的小苗置于生根培养基上，培养至小苗生根且根说明书CN 102952823 A 7/11页 9 长为10厘米左右(生根过程中的小苗见图6)，打开容器封口膜，炼苗2-3天。培养条件为： 25，光暗周期为12小时/12小时。 0089 共得到149株成活的植株。成苗率为49%。成苗率=步骤（5）得到的成活植株的个数/用于步骤（4）的产生芽点的胚性愈伤组织个数100%。 0090 （6）将步骤（5）得到的植株移栽。

32、到花盆中（装有等质量混合的营养土和蛭石），于人工气候室中培养。培养条件为：215，光暗周期为16小时/8小时。植株生长过程中的照片见图7，植株结实的照片见图8。小麦植株均能正常生长，开花结实，顺利繁育下一代。 0091 （7）通过GUS染色鉴定遗传转化效率 0092 GUS染液（pH 7.0）由水和溶质组成；溶质及其在GUS染液中的浓度如下：100mM磷酸钠、10mM EDTA、0.5%（体积比）Triton X-100、0.5mM亚铁氰化钾、0.5mM铁氰化钾和1mM X-Gluc（北京中生瑞泰科技有限公司。 0093 取步骤（6）中培养1个月的植株的根部，在GUS染液中于25浸泡过。

33、夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。 0094 149株成活的植株中，31株为阳性植株，遗传转化率为20.8%。149株成活的植株中，根部显示较弱GUS活性的样本的照片见图10A，根部显示中等GUS活性的样本的照片见图10B，根部显示较强GUS活性的样本的照片见图10C，根部不显示GUS活性的样本的照片见图10D。小麦品种“京冬1号”的根的GUS染色后的照片见图10E，不显示GUS活性。 0095 2、第二组处理 0096 步骤（4）中用培养基甲代替培养基乙，其它完全同步骤1。培养3-4周时的照片见图9B。许多芽点即使能够形成，也不能正常发育成小苗； 0097 共得到101。

34、株成活的植株，成苗率为21%。 0098 101株成活的植株中，27株为GUS鉴定阳性植株，遗传转化率为26.7%。 0099 3、第三组处理 0100 步骤（4）中，用胚性愈伤分化培养基代替培养基乙，其它完全同步骤1。 0101 共得到89株成活的植株，成苗率为51%。 0102 89株成活的植株中，15株为GUS鉴定阳性植株，遗传转化率为16.9%。 0103 综合步骤1至3的结果。步骤（4）中，如果不采用潮霉素进行筛选，成苗率较高，但遗传转化率很低。采用20mgL -1 潮霉素筛选时，比采用40mgL -1 潮霉素筛选的遗传转化率略有降低，但成苗率大大升高，获得的转化苗总数大大增加了。

35、，即降低筛选压以利于芽点的生长，提高芽点的正常发育率。 0104 实施例4、小麦的遗传转化 0105 用TaCYP-pUN1301载体代替pUN1301载体，其它完全同实施例3。 0106 第一组处理中，成苗率为42%，遗传转化率为13%。 0107 第二组处理中，成苗率为16%，遗传转化率为14%。 0108 第三组处理中，成苗率为59%，遗传转化率为6%。 0109 实施例5、培养基对胚性愈伤组织产生芽点的影响 0110 一、培养基的制备 0111 培养基：与实施例1的MS培养基的差别仅在于用等质量的蔗糖取代麦芽糖，每说明书CN 102952823 A 8/11页 10 升加入0.。

36、1g肌醇。 0112 培养基的制备方法：在培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为2mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为500mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为500mgL -1 。 0113 培养基的制备方法：在培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为500mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为500mgL -1 。 0114 培养基的制备方法：在培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为 0.4molL -1 。 0115 培养基的制备方法：在培养基中加入潮霉素，使。

37、得潮霉素的浓度为40mgL -1 。 0116 培养基培养基的制备方法：在培养基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为2mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为500mgL -1 。 0117 二、小麦愈伤的准备 0118 1、取小麦品种“京冬1号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4-5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于培养基上，25黑暗培养4-5个月（每2周继代一次，继代时均采用培养基），得到颗粒较小、致密易。

38、碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。 0119 2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25黑暗培养4小时。 0120 三、基因枪转化小麦愈伤 0121 同实施例3的步骤二。 0122 四、转化后小麦愈伤的梯度筛选 0123 1、第一组处理 0124 （1）将完成步骤三的愈伤组织置于培养基上，25黑暗培养12小时。 0125 （2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于培养基上，25黑暗培养45天，每15天更换新的培养基并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织，颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。 0126 （3）将步骤（2）得。

39、到的抗性愈伤组织置于含有40mgL -1 潮霉素的培养基上，培养15天，得到产生芽点的胚性愈伤组织。培养条件：25，光暗周期为12小时/12小时。 0127 照片见图11。与实施例3中的图4相比，图11产生的芽点数量较少。 0128 实施例6、小麦的遗传转化 0129 一、培养基的制备 0130 1、MS培养基的制备 0131 同实施例1的步骤一。 0132 用步骤1制备的MS培养基作为基础培养基，配制步骤2中的其它培养基。 0133 2、其它培养基的制备 0134 胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为。

40、1.5mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为说明书CN 102952823 A 10 9/11页 11 300mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为300mgL -1 。 0135 胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为 300mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为300mgL -1 。 0136 高渗培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.3molL -1 。 0137 筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓。

41、度为37mgL -1 。 0138 胚性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为1.5mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为300mgL -1 。 0139 生根培养基的制备方法在MS培养基中加入-萘乙酸（俗称生长素NAA），使得 -萘乙酸的浓度为0.5mgL -1 。 0140 二、小麦愈伤的准备 0141 1、用小麦组织取代 0142 取小麦品种“京花9号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无。

42、菌蒸馏水冲洗4-5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25黑暗培养4-5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。 0143 2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25黑暗培养4小时。 0144 三、基因枪转化小麦愈伤 0145 将TaCYP-pUN1301载体通过基因枪轰击步骤二得到的愈伤组织。轰击条件： TaCYP-pUN1301载体的浓度为1g/l；采用直径为1.0m的金粉，1100psi的可裂膜；靶材料至可裂膜的距离为9厘米。 01。

43、46 四、转化后小麦愈伤的梯度筛选 0147 （1）将完成步骤三的愈伤组织置于高渗培养基上，25黑暗培养12小时。 0148 （2）将完成步骤（1）的愈伤组织置于筛选培养基上，25黑暗培养35天，每10-15 天更换新的筛选培养基并继代，颜色浅黄鲜亮且增殖旺盛的愈伤组织为抗性愈伤组织，颜色成暗褐色且不增殖的愈伤为非抗性愈伤组织。 0149 （3）将步骤（2）得到的抗性愈伤组织置于含37mgL -1 潮霉素的胚性愈伤分化培养基上，培养10天，得到产生芽点的胚性愈伤组织。培养条件：25，光暗周期为12小时/12 小时。 0150 （4）将步骤（3）得到的产生芽点的胚性愈伤组织置于含17mgL 。

44、-1 潮霉素的胚性愈伤分化培养基上上，培养30天，每15天更换新的相同的培养基并继代，芽点发育成小苗。培养条件：25，光暗周期为12小时/12小时。 0151 （5）将步骤（4）得到的2厘米左右的小苗置于生根培养基上，培养至小苗生根且根长为10厘米左右，打开容器封口膜，炼苗2-3天。培养条件为：25，光暗周期为12小时 /12小时。说明书CN 102952823 A 11 10/11页 12 0152 共得到105株成活的植株。成苗率为47%。 0153 （6）将步骤（5）得到的植株移栽到花盆中（装有等质量混合的营养土和蛭石），于人工气候室中培养。培养条件为：215，光暗周期为1。

45、6小时/8小时。 0154 （7）通过GUS染色鉴定遗传转化效率 0155 取步骤（6）中培养1个月的植株的根部，在GUS染液中于25浸泡过夜，显示蓝色的植株具有GUS活性，为阳性植株。 0156 成活的植株中，11株为阳性植株，遗传转化率为10%。 0157 实施例7、小麦的遗传转化 0158 一、培养基的制备 0159 1、MS培养基的制备 0160 同实施例1的步骤一。 0161 用步骤1制备的MS培养基作为基础培养基，配制步骤2中的其它培养基。 0162 2、其它培养基的制备 0163 胚性愈伤诱导培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得。

46、2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1.5mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为 700mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为700mgL -1 。 0164 胚性愈伤增殖培养基的制备方法：在MS培养基中加入2,4-二氯苯氧乙酸、谷氨酰胺和水解酪蛋白，使得2,4-二氯苯氧乙酸的浓度为1mgL -1 、谷氨酰胺的浓度为700mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为700mgL -1 。 0165 高渗培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入甘露醇，使得甘露醇的浓度为0.8molL -1 。 0166 筛选培养基的制备方法：在胚性愈伤诱导培养基中加入潮霉素，使得潮霉素的浓度为43mgL -1 。 0167 胚。

47、性愈伤分化培养基的制备方法：在MS培养基中加入6-糖基氨基嘌呤和水解酪蛋白，使得6-糖基氨基嘌呤的浓度为3mgL -1 、水解酪蛋白的浓度为700mgL -1 。 0168 生根培养基的制备方法在MS培养基中加入-萘乙酸（俗称生长素NAA），使得 -萘乙酸的浓度为0.5mgL -1 。 0169 二、小麦愈伤的准备 0170 1、用小麦组织取代 0171 取小麦品种“京花9号”开花后2周的未成熟种子，剥去稃片，置于70%（体积比）酒精水溶液中浸泡30秒，用无菌蒸馏水冲洗2次，然后置于转入0.1g/100mL升汞水溶液中浸泡10分钟(消毒)，用无菌蒸馏水冲洗4-5次后，然后手术镊子将胚挑出，盾面向上置于胚性愈伤诱导培养基上，25黑暗培养4-5个月（每2周继代一次，继代时均采用胚性愈伤增殖培养基），得到颗粒较小、致密易碎、浅黄鲜亮的愈伤组织。 0172 2、从步骤1得到的愈伤组织中取直径约2.5厘米的置于高渗培养基中央，每个培养皿放100块左右愈伤组织，25黑暗培养4小时。 0173 三、基因枪转化小麦愈伤 0174 将TaCYP-pUN1301载体通过基因枪轰击步骤二得到的愈伤组织。轰击条件： TaCYP-pUN1301载体的浓度为1g/l；采用直径为1.0m的金粉，1100psi的可裂膜；靶说明书CN 102952823 A 12 11/11页 13 材料至可。

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