伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法.pdf

本发明公开了一种伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。本发明制备的伊马替尼免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗伊马替尼特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的伊马替尼检测试剂，可以精确快速地确定样品中的伊马替尼含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低伊马替尼检测成本，有利于临床大规模推广使用。

1.  一种伊马替尼免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：

式中，R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数；载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲状腺球蛋白中的一种。

2.  一种如权利要求1所述的伊马替尼免疫原的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)将载体蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg伊马替尼衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到伊马替尼免疫原。

3.  一种伊马替尼衍生物，结构式如式(Ⅱ)所示：

上述R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n为1至20之间的整数。

4.  根据权利要求3所述的伊马替尼衍生物的制备方法，其特征在于，取n＝4时，伊马替尼衍生物的合成步骤如下：

或者当n为4以外的其余整数时，伊马替尼衍生物的合成步骤与上述合成步骤的区别仅在于：由化合物5合成化合物7的步骤中，采用的原料6-溴己酸甲酯替换为其类似物。

5.  一种抗伊马替尼特异性抗体，由权利要求1所述的伊马替尼免疫原免疫实验动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与伊马替尼特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。

6.  根据权利要求5所述的一种抗伊马替尼特异性抗体，其特征在于所述的完整的抗体分子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的伊马替尼免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种。

7.  一种如权利要求5或6所述的抗伊马替尼特异性抗体的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)用PBS将连接有牛血清白蛋白的伊马替尼免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
(2)2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次；
(3)对步骤(2)的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗伊马替尼特异性抗体。

8.  一种伊马替尼检测试剂，含有权利要求5或6所述的抗伊马替尼特异性抗体和指示试剂，所述的指示试剂选自酶试剂；所述的酶试剂由伊马替尼酶标偶联物和酶的底物组成，酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。

9.  一种如权利要求8所述的伊马替尼检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤：
(1)试剂A：将4.036g、11.25mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和1.711g、11.25mM葡萄糖-6-磷酸用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将权利要求5-7中任一项所述的抗伊马替尼特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗伊马替尼特异性抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
(2)试剂B：将伊马替尼酶标偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，伊马替尼酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。

10.  根据权利要求8所述的伊马替尼检测试剂的制备方法，其特征在于所述的伊马替尼酶标偶联物的制备方法包含以下步骤：
(1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取15mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，室温溶解于12mL含有72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgCl₂和100mg NaCl的溶液中，pH＝9.0；在溶液中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷酸以及0.75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亚砜；
(2)伊马替尼衍生物的激活：在无水状态下称取10mg伊马替尼衍生物，溶解于600μL二甲基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2～-8℃；加入3μL三丁胺；加入1.5μL氯甲酸异丁酯；-2～-8℃搅拌30分钟；
(3)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与伊马替尼衍生物的连接：将步骤(2)激活的伊马替尼衍生物溶液逐滴加入到步骤(1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8℃搅拌过夜；
(4)纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。

伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及伊马替尼免疫原、衍生物及合成方法、特异性抗体和检测试剂及制备方法。
背景技术
伊马替尼(Imitimib)，其结构式如式(Ⅲ)所示：
            
伊马替尼是一种抗癌药，其药理活性盐：甲磺酸伊马替尼(商品名Gleevec)，主要用于慢性粒细胞白血病的治疗，尤其是用于治疗α-干扰素治疗失败的胚细胞危象病期、加速病期或慢性病期的慢性骨髓性白血病患者。此外本品还可用于胃肠道间质细胞瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、费城染色体阳性的急性淋巴细胞白血病，嗜酸细胞增多症、系统性肥大细胞增多症等多种疾病的治疗。据报道，个体内和个体间的伊马替尼及其盐的药代动力学变异性程度较大，并受诸多因素影响，包括：器官功能、遗传调节、疾病状态、年龄、药物间相互作用、药物摄入时间、顺应性等，相同剂量的伊马替尼或其盐的有效性依据患者的个体药物清除率和最终血清药物浓度而有显著变化。因此，不同个体使用相同剂量的本品可导致显著不同的临床效果。监测血液中的该药物浓度能使临床医生及时了解药物施用过程中患者个体间的差异，并对不同患者的药物施用量进行个体化调整，能有效提高治疗效果，并显著降低药物毒副作用，对于临床合理用药具有重要意义。
目前，国内外对于伊马替尼的分析方法研究主要集中在血药浓度及生物利用度上。伊马替尼的检测分析主要有HPLC-UV、LC-MS-MS、MESED-LC-MS-MS、C₁₄放射能测定法、毛细管电泳分析法、HPLC-ESI-MS和电化学分析法等，但是这些方法都不适合临床大规模应用，无法满足日益增长的临床检测需求。目前市场上缺乏稳定性好、灵敏度高、特异性强的伊马替尼检测试剂，尤其是质量好的 自动化检验试剂。因此，研发生产质量达到临床要求、实用性强、性价比高，可应用于全自动生化分析仪的伊马替尼测定试剂已成为国内外体外诊断试剂行业的热点。
发明内容
本发明为了克服现有技术存在的缺陷，采用全新的伊马替尼衍生物制备免疫原性强的伊马替尼免疫原及其抗体，用该抗体制备的伊马替尼均相酶免疫检测试剂可以实现在全自动生化分析仪上对伊马替尼高通量、快速化的检测。该检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低伊马替尼检测成本，有利于临床推广使用。
本发明的一个目的在于提供一种伊马替尼衍生物。
本发明的另一个目的在于提供一种免疫原性强的伊马替尼免疫原。
本发明的另一个目的在于提供一种伊马替尼免疫原的制备方法。
本发明的又一个目的在于提供使用本发明伊马替尼免疫原制备得到的特异性强的抗伊马替尼特异性抗体。
本发明的再一个目的在于提供一种伊马替尼检测试剂。
免疫原性与所合成的伊马替尼衍生物分子结构及所选载体种类有关，现有技术中伊马替尼免疫原的免疫原性较弱，所得到抗体的特异性、与伊马替尼的结合力，敏感度都不如本发明。本发明的伊马替尼免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗伊马替尼特异性抗体。该抗体特异性高，与伊马替尼的结合力强。由该抗体制备得到的伊马替尼检测试剂，可以快速、准确地确定样品中的伊马替尼含量。本发明是通过以下技术方案实现的：
一种伊马替尼免疫原，其结构式如式(Ⅰ)所示：
            
式中，R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数，优选R为-(CH₂)₄-COO-。
载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，优选为血清蛋白、血蓝蛋白和甲状腺 球蛋白，更优选为血清白蛋白，进一步优选为牛血清白蛋白。
当R为-(CH₂)_n-COO-时，该伊马替尼免疫原的合成途径和方法如下：
1.伊马替尼衍生物的制备方法：
一种伊马替尼衍生物，其结构式如式(Ⅱ)所示：
            
式中，R为连接基团-(CH₂)_n-COO-，n是1至20之间的整数。
取n＝4时，该伊马替尼衍生物的合成步骤如下：
            
或者当n为4以外的其余整数时，伊马替尼衍生物的合成步骤与上述合成步 骤的区别仅在于：由化合物5合成化合物7的步骤中，采用的原料6-溴己酸甲酯替换为其类似物。
2.伊马替尼免疫原的制备步骤：
(1)将载体蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
(2)将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg本发明合成的伊马替尼衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
(3)将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到伊马替尼免疫原。
本发明中当n取1～20范围内的其他整数时，用上述方法可以制备出如式(Ⅰ)所示的伊马替尼免疫原。载体仍为具有免疫原性的蛋白质，可以是血清蛋白，血蓝蛋白和甲状腺球蛋白。优选的，载体为血清蛋白。更优选的，载体为牛血清白蛋白。
由于连接基团主要起小分子衍生物与载体的连接作用，免疫原性强弱与所合成的伊马替尼衍生物分子结构及所选载体种类有关，因此理论上n取1至20之间的任意整数时，伊马替尼衍生物制备的伊马替尼免疫原无显著差异，均具备强免疫原性，都能制备高效价的特异性抗体。
一种抗伊马替尼特异性抗体，由上述的伊马替尼免疫原免疫动物后生产得到。
所述的抗伊马替尼特异性抗体由上述制得的伊马替尼免疫原采用常规方法接种实验动物，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
(1)用PBS将上述合成的BSA-伊马替尼免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射；
(2)2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次；
(3)对上述实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗伊马替尼特异性抗体。
本发明的抗伊马替尼特异性抗体为完整的抗体分子，也包括保留与伊马替尼 特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生物。
本发明的抗体为采用单一的伊马替尼免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。
本发明提供一种伊马替尼检测试剂，含有上述抗伊马替尼特异性抗体和指示试剂。
本发明指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂、发光试剂。优选的，指示试剂为酶试剂，由伊马替尼酶标偶联物和酶的底物所组成。
上述酶标偶联物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物；上述酶的底物为葡萄糖-6-磷酸。
伊马替尼均相酶免疫检测试剂在使用之前，为了避免指示试剂中的酶标偶联物和酶的底物发生反应，酶标偶联物和酶的底物是不混合的且分开放置，所以将酶的底物与上述抗伊马替尼特异性抗体混合在一起。因此，伊马替尼均相酶免疫检测试剂包括两类试剂：
(1)试剂A由抗伊马替尼特异性抗体和均相酶底物混合而成，具体制备步骤如下：
1)将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；
2)将制备的抗伊马替尼特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；
(2)试剂B由葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物与Tris缓冲液混合而成，制备方法如下：
1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
a.称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl₂(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中，该溶液pH＝9.0；
b.加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇；
c.逐滴加入2mL二甲基亚砜；
2)伊马替尼衍生物的激活：
a.在无水状态下称取10mg伊马替尼衍生物，溶解于600μL DMF中；
b.使上述溶液温度降到-2～-8℃；
c.加入3μL三丁胺；
d.加入1.5μL氯甲酸异丁酯；
e.-2～-8℃搅拌30分钟；
3)G6PDH与伊马替尼衍生物的连接：
a.将上述激活的伊马替尼衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中；
b.2-8℃搅拌过夜；
4)纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
5)将制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100～1:10000。
所述的抗伊马替尼特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:400；
所述的伊马替尼酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:1500。
本发明的伊马替尼免疫原特异性强、免疫原性高，制备出的抗伊马替尼特异性抗体特异性强、效价高，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；含有上述抗伊马替尼特异性抗体的均相酶免疫检测试剂可以方便、快速、准确地确定样品中的伊马替尼含量，并且可以在全自动生化分析仪上同时测定多个样品，实现伊马替尼的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率相比之前都有了较大的提高，同时实现了检测过程的全自动化，对检测人员的要求不高，易于实现和推广使用。
附图说明
图1是伊马替尼的ELISA检测反应曲线；
图2是伊马替尼的均相酶免疫反应曲线。
具体实施方式
实施例一伊马替尼衍生物的合成及其定量检测
伊马替尼衍生物的化学结构如式(Ⅳ)所示：
            
上述伊马替尼衍生物的合成路线及制备步骤如下：
            
具体的合成步骤如下：
化合物3的合成
            
称取20g(87.31mmol)化合物1，溶解于CH₃CN中，然后称取18g(130.96mmol)K₂CO₃和19.5g(104.77mmol)化合物2(1-叔丁氧羰基哌嗪)，依次加入上述溶液中制成反应混合溶液。所有成分添加完成后，将上述反应混合溶液在60℃下搅拌过夜。通过减压方法使溶剂蒸发，然后将得到的残留物溶解于300mLEA中，再用60mL卤水进行洗涤，最后将有机相通过Na₂SO₄进行干燥，浓缩后得到28g黄色油状的化合物3，产率96％。
化合物4的合成
            
称取28g(83.73mmol)化合物3，溶解于200mL甲醇中，然后依次加入100mL H₂O和10.53g(251.18mmol)LiOH，制成反应混合溶液。所有成分添加完成后，将上述反应混合溶液在室温下搅拌过夜。通过减压方法使溶剂蒸发，然后将得到的残留物溶解于200mL纯化水中，再用3×40mL EA进行萃取。将萃取后分离出的水相用2N的盐酸进行酸化并过滤，收集滤饼并进行干燥，最终得到25g白色固体状的化合物4，产率93％。
化合物5的合成
            
称取10g(31.25mmol)化合物4，溶解于50mL DCM中，在0℃下加入50mL CF₃COOH，制成反应混合溶液，然后将上述反应混合溶液在室温下搅拌 过夜。将溶剂蒸发干，然后将得到的残留物在MTBE中进行研磨，过滤并收集滤饼，得到10g白色固体状的化合物5，产率71％。
化合物7的合成
            
称取5g(11.15mmol)化合物5，溶解于50mL CH₃CN中，然后称取2.8g(13.38mmol)化合物6(6-溴己酸甲酯)和6.9g(50.18mmol)K₂CO₃，依次加入上述溶液中制成反应混合溶液。所有成分添加完成后，将上述反应混合溶液在80℃下搅拌过夜。反应完成后将溶剂蒸发干，然后将得到的残留物溶解于100mL EA中，再将有机相用纯化水和卤水进行冲洗，冲洗后通过Na₂SO₄进行干燥并进行浓缩。将浓缩后得到的残留物通过硅胶柱(DCM:MeOH＝20:1)进行纯化，最终得到1.3g白色固体状的化合物7，产率33％。
化合物9的合成
            
称取1.3g(3.73mmol)化合物7，溶解于10mL DMSO中，然后称取1.7g(4.48mmol)HATU、1.1g(11.21mmol)TEA及1g(3.73mmol)化合物8(N-(5-氨基-2-甲基苯基)-4-(3-吡啶基)-2-氨基嘧啶)，依次加入上述溶液中制成反应混合溶液。所有成分添加完成后，将上述反应混合溶液在室温下搅拌过夜。将搅拌后 的反应混合溶液注入50mL纯化水中，然后用3×30mL EA进行萃取。萃取后将结合的有机相用卤水洗涤，然后通过Na₂SO₄进行干燥，并进行浓缩。将浓缩后得到的残留物通过硅胶柱(DCM:MeOH＝50:1～20:1)进行纯化，最终得到1.3g白色固体状的化合物9，产率59％。
伊马替尼衍生物的合成
            
称取1.3g(2.14mmol)化合物9，溶解于13mL甲醇中，然后依次加入6.5mLH₂O和269mg(6.42mmol)LiOH，制成反应混合溶液。所有成分添加完成后，将上述反应混合溶液在室温下搅拌过夜。通过减压方法使溶剂蒸发，然后将得到的残留物溶解于20mL纯化水中，再用3×10mL EA进行萃取。将萃取后分离出的水相用2N的盐酸进行酸化并过滤，收集滤饼并进行干燥，最终得到1g黄色固体状的化合物(Imatinib Derivative)，即伊马替尼衍生物，产率97％。
对上述黄色固体化合物(Imatinib Derivative)进行结构鉴定
1、利用Bruker Avance III plus 400MHz和VARIAN MERCURY plus 300M对上述黄色固体化合物进行核磁共振光谱扫描，采用TMS作为内标。结果如下：¹H-NMR(400MHz,DMSO_d6):δ1.17-1.31(m,2H),1.33-1.43(m,2H),1.44-1.55(m,2H),2.12-2.49(m,15H),3.52(s,2H),7.20(d,1H),7.39-7.55(m,5H),7.90(d,2H),8.07(d,1H),8.45-8.50(m,1H,8.50(d,1H),8.68(dd,1H),8.97(s,1H),9.27(d,1H),10.15(brs,1H)。表征为式(Ⅳ)所示的伊马替尼衍生物。
2、采用安捷伦公司的串联四级杆质谱仪LC/MSD1200对得到的衍生物进行分析鉴定，可以确定该黄色固体化合物为式(Ⅳ)所示的伊马替尼衍生物。
本实施例中，伊马替尼衍生物的制备过程中，化合物7的合成步骤选用了化 合物6(6-溴己酸甲酯)为合成原料，故所得的最终产物伊马替尼衍生物的链接基团R为-(CH₂)₄-COO-。当n取其他数值时，选用其他6-溴己酸甲酯的类似物(比如5-溴戊酸甲酯、4-溴丁酸甲酯、7-溴庚酸甲酯等等)进行实验，合成方法完全一致。
实施例二伊马替尼免疫原的合成
伊马替尼免疫原由牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)与式(Ⅱ)所示的伊马替尼衍生物的-(CH₂)_n-COO-基团连接而成，在本实施例中，以n＝4为例详细说明该免疫原的合成方法，具体步骤如下：
1.将牛血清白蛋白200mg溶解于50ml 0.2M，pH 8.5的磷酸缓冲液中；
2.将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg合成的伊马替尼衍生物、3.5ml二甲基甲酰胺、3.5ml乙醇、7.0ml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基)碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min；
3.将溶解好的溶液滴加至BSA溶液中，并在2～8℃下搅拌过夜，得到抗原；将合成好的抗原经过透析进行纯化，得到伊马替尼免疫原。
实施例三：抗伊马替尼特异性抗体的制备
将实施例二制备得到的伊马替尼免疫原采用常规方法接种实验动物兔，加强免疫后取抗血清，具体步骤如下：
1.用PBS将上述合成的伊马替尼免疫原稀释至1.0mg/ml，得到抗原溶液，然后用1.0ml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物兔进行注射。
2.2～3周后，再用1.0ml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物兔注射一次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次。
3.对步骤2的实验动物兔取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗伊马替尼特异性抗体。
实施例四：伊马替尼ELISA检验
1.伊马替尼ELISA检测标准曲线的建立
(1)标准品的制备
将伊马替尼粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液，制备成1mg/ml的储存液。用ELISA缓冲液将储存液依次稀释为400.00ng/mL、200.00ng/mL、100.00ng/mL、50.00ng/mL、25.00ng/mL和0.00ng/mL的标准溶液。其中，ELISA缓冲液含有50.0mM Tris，145mM NaCl和0.25％的BSA。
(2)利用伊马替尼的ELISA检验方法制备标准曲线
用PBS将实施例三中所制备的抗伊马替尼抗体稀释成1:8000的终浓度溶液，100μL/孔包被在96孔酶联板上，4℃放置12-24h；用PBS将上述包被有抗伊马替尼抗体的96孔酶联板洗涤3次后，加入200μL/孔的0.5％的BSA溶液，4℃封闭放置8-16h。然后用PBS洗涤3次，加入20μL/孔的标准品。再加入100μL/孔工作浓度的HRP-伊马替尼偶联物；室温下孵育30min后PBS洗板5次；然后每孔加入100μL TMB底物，室温孵育30min。再每孔加入100μL终止液(2M硫酸)。测定450nm的吸光值。根据各标准品所对应的450nm的吸光值定标，制作标准曲线，结果如附图1所示。
2.待测样品中伊马替尼含量的检测
(1)制作待测样品
制备方法：将伊马替尼粉末(购于Sigma公司)溶解于甲醇溶液制成1μg/mL的储存液，并将此储存液稀释于空白血浆中，至终浓度分别为0.00，10.00，100.00，350.00ng/mL，形成空白、低、中、高浓度的血浆样本。该空白血浆为不含伊马替尼的健康人血浆。
(2)测试方法
利用上述伊马替尼的ELISA检验方法，将上述空白、低、中、高浓度的血浆样本代替标准品，测试上述空白、低、中、高浓度的血浆样本在450nm的吸光值。
(3)测试结果
对照图1中所示的伊马替尼ELISA检验的标准曲线，计算每个样本中伊马替尼含量，并对每个样本进行3个复孔测定，根据上述样本中伊马替尼的实际含量计算回收率，结果如表1所示。
表1伊马替尼的ELISA检测回收实验
                  
            
由表1中结果可知：采用本发明伊马替尼ELISA检测试剂测定不同浓度样品中的伊马替尼回收率都较高，均＞90％，说明本发明所述的抗伊马替尼特异性抗体可以用于样本中伊马替尼的检测，并且结果准确度高。
实施例五：葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物的制备
1.葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PDH)溶液的制备：
(1)准确称取15mg规格为100KU的G6PDH，室温溶解于12mL含有72.6mg(0.05M)Tris、8mg MgCl₂(3.3mM)和100mg NaCl的溶液中,该溶液pH＝9.0，本步骤在烧杯C中进行。
(2)在上述烧杯C中加入225mg还原态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，135mg葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)以及0.75mL卡必醇(Carbitol)。
(3)在上述烧杯C中再逐滴加入2mL二甲基亚砜(dimethy sulfoxide，DMSO)。
2.伊马替尼衍生物的激活：
(1)在无水状态下称取10mg上述伊马替尼衍生物，溶解于600μL DMF中。
(2)使上述溶液温度降到-2～-8℃。
(3)加入3μL三丁胺(tributylamine)。
(4)加入1.5μL氯甲酸异丁酯(isobutylchloroformate)。
(5)-2～-8℃搅拌30分钟。
3.G6PDH与伊马替尼衍生物的连接：
(1)将上述激活的伊马替尼衍生物溶液逐滴加入到上述溶解的G6PDH溶液中。
(2)2-8℃搅拌过夜。
4.纯化产物：
通过G-25凝胶层析柱纯化步骤3中的溶液，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8℃下储存。
实施例六：伊马替尼均相酶免疫检测试剂的制备
1.试剂A的制备：将4.036g(11.25mM)氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)、1.711g(11.25mM)葡萄糖-6-磷酸(G-6-P)置于烧杯D中，用1L 55mM、pH＝8.0的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将上述制备的抗伊马替尼特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中的比例为1:400。
2.试剂B的制备：将实施例五制备的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶-半抗原偶联物加到120mM、pH＝8.2的Tris缓冲液中，上述偶联物与Tris缓冲液的体积比可以为1:100～1:10000，在本实施例中的比例为1:1500。
实施例七：伊马替尼均相酶免疫检验及结果
1.获得标准曲线：
(1)设置迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数(见表2)。
(2)操作步骤为：先加试剂A，再加入标准品，最后加入试剂B。加入试剂B后，测定不同时间点的OD₃₄₀吸光值，算出不同标准品浓度时的反应速率，实际操作过程中需不断调整试剂A和试剂B的体积比例，同时调整测光点，最后得出较理想的反应标准曲线图，如图2所示。
表2迈瑞BS-480全自动生化分析仪反应参数
                  
            
2.样本检测：通过本发明的均相酶免疫检测试剂得到的标准曲线，重复测定低、中、高浓度质控样本10次，上述质控样本为：将伊马替尼标准品溶解于人血清中，至浓度分别为50.00，300.00，800.00ng/ml。检测数据及数据分析见表3。
表3样品测定及精密度和回收率评估