转基因百脉根植物的培育及筛选方法.pdf

本发明公开了一种转基因百脉根植物的培育及筛选方法，包括：（1）构建含有标记基因及目的基因的重组植物表达载体，将重组植物表达载体转化百脉根，获得转化外植体；（2）将转化外植体依次通过分化培养、选择培养和生根培养再生获得转基因百脉根植株；其中，所述的标记基因是磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因；所述的选择培养或生根培养的培养基中含有甘露糖。本发明构建了以PMI为筛选标记基因的植物表达载体并将其以农杆菌介导法转化百脉根，结果表明以PMI作为筛选标记获得阳性转化率为23%，表明本发明所建立的生物安全的PMI/甘露糖筛选体系可取代传统的抗生素抗性标记应用于转基因百脉根植物的培育和筛选。

权利要求书转基因百脉根（L.Corniculatus L.）植物的培育及筛选方法，包括：（1）构建含有标记基因及目的基因的重组植物表达载体，将重组植物表达载体转化百脉根，获得转化外植体；（2）将转化外植体依次通过分化培养、选择培养和生根培养再生获得转基因百脉根植株；其特征在于：步骤（1）所述的标记基因是磷酸甘露糖异构酶基因；步骤（2）中所述的选择培养或生根培养的培养基中含有甘露糖。按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述选择培养的培养基组成是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15‑20g/L。按照权利要求2所述的方法，其特征在于，所述选择培养的培养基组成是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖20g/L。按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的生根培养的培养基组成是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖10‑20g/L。按照权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的生根培养的培养基组成是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15g/L。按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的百脉根是鸟足百脉根。按照权利要求6所述的方法，其特征在于：所述的鸟足百脉根是里奥“Leo”。按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的目的基因包括禽流感血凝素抗原基因或大肠杆菌热敏毒素B亚基。

说明书转基因百脉根植物的培育及筛选方法
技术领域
本发明涉及转基因植物的培育和筛选方法，尤其涉及转基因百脉根植物的培育及筛选方法，属于转基因百脉根植物的培育和筛选领域。
背景技术
随着近几年转基因技术在植物生物反应器上的应用，转基因的生物安全性问题已引起世界的广泛关注。人们对转基因作物的食品安全和环境安全的忧患主要来源于植物遗传转化中应用的抗性筛选基因。到目前为止，在植物遗传转化应用的选择标记基因主要是抗生素基因和抗除草剂基因。这些抗性标记基因很有可能会通过转基因漂移造成基因污染问题，对生态环境造成严重的影响。抗性标记基因在食品安全性方面的问题也势必影响到转基因植物的发展。如何去掉转基因植物的抗生素等抗性筛选标记，培育生物安全的转基因植物已成为当前植物基因工程研究的热点，解决抗性标记安全问题的途径之一就是开发生物安全标记基因。
磷酸甘露糖异构酶（PMI）基因是一种新型生物安全选择标记基因，广泛存在于植物之外的生物界，具有巨大的应用潜力。磷酸甘露糖异构酶能够将甘露糖‑6‑磷酸转化为果糖‑6‑磷酸，使转化细胞能以甘露糖为惟一或主要碳源而正常生长，非转化细胞由于不能利用甘露糖而停止生长。以PMI基因作为选择标记基因，以甘露糖作为筛选剂的筛选系统应用于植物的转化中，筛选程序简单、筛选剂价格低廉，而且不影响转化植株的代谢平衡和生长发育，不利变异少，筛选效果显著，对人体和环境无污染，在单子叶植物和双子叶植物中均适用。此外，PMI基因不仅可以作为筛选基因代替抗生素等抗性基因，还可利用氯酚红显色作为转基因植株的报告基因，并结合常规分子检测减少假阳性植株。因此，PMI/甘露糖筛选体系必将在转基因植物培育中得到更为广泛的应用，代替传统抗性筛选系统，消除生物安全隐患，成为植物遗传转化过程中安全有效的新型筛选体系。目前，该筛选标记已成功应用于甜菜、甘蔗、玉米、黄瓜等植物。
PMI/甘露糖筛选体系依赖于甘露糖‑6‑磷酸这一不参与代谢且对植物生长有毒害作用的己糖积累以及ATP和磷酸根离子的无效消耗而实现筛选作用，从而容易受培养基或外植体内其它糖类水平等生理因素的干扰，导致甘露糖筛选的敏感性较低。不同的植物对甘露糖敏感性不同，在转基因甜菜筛选时，在选择培养基中添加30g/L蔗糖，当甘露糖浓度达到2.5‑3g/L时，幼苗再生被完全抑制，获得最佳转化率的甘露糖浓度为1.25g/L左右（Joersbo et al,1998）（Joersbo M,Donaldson I,Kreiberg J(1998)Analysis of mannose selection used for transformation of sugar beet[J].Mol.Breed 4:111‑117.）。在玉米转化研究中，筛选培养基中甘露糖和蔗糖的最佳浓度则分别为5g/L和10g/L(Wright M,Dawson J,Dunder E(2001)Efficient biolistic transformation of maize(Zeamays L.)and wheat(Triticumaestivum L.)using the phosphomannoseisomerase gene,pmi,as the selectable marker[J].Plant Cell Rep 20:429‑436.)；甘露糖筛选体系用于油菜的最适浓度则为4.5g/L（Wallbraun M,Sonntag K,Eisenhauer C(2009)Phosphomannose‑isomerase(pmi)gene as a selectable marker for Agrobacterium‑mediated transformation of rapeseed [J].Plant CellTiss.Organ.Cult 99:345‑351）。
文献报道中指出肉桂和一些豆类植物由于具有内源PMI活性，因而该筛选体系在这些植物上不能应用，对于以往研究尚未涉及过的材料，需要先对内源PMI活性进行检测；另外，作为一种新的筛选体系，它在植物中的应用尚十分有限，在应用之前需要对筛选培养基中的甘露糖与其它糖以及以及磷酸根离子浓度等因素作进一步的优化，同时还需要考虑基因型对转化的影响（杨莉，徐昌杰，陈昆松.PMI/甘露糖筛选体系在植物转基因中的应用.林业科学.2005年5月,第41卷第3期）。Joersbo等研究发现，选择培养基中碳源的性质和浓度以及磷酸根离子的浓度成为制约转化效率的关键因子，而基因型和光密度对筛选体系的影响较小。
百脉根(L.Corniculatus L.)又名五叶草(四叶草)、鸟足豆、牛角花,是多年生豆科百脉根属草本植物,原产欧亚大陆温带地区,中国河北、云南、贵州、四川、甘肃等地均有野生种分布。1980年以后,中国一些科研部门从加拿大等国引入百脉根栽培品种,广泛用于果园生草、绿肥、草场改良及牧草。其茎叶柔软细嫩多汁，适口性好，各类家畜均喜食，可调制青干草，加工草粉和混合饲料，还可用作放牧利用。用于青饲或放牧时，其青绿期长，含皂素低，耐牧性强，不会引起家畜膨胀病，为一般豆科牧草所不及。此外，百脉根耐瘠薄、固土防冲刷能力强，是一种很好的水土保持植物。
迄今为止，在转基因百脉根植物遗传转化体系中所采用的选择标记基因主要是抗生素基因或抗除草剂基因，存在着较为严重的生物安全隐患，亟待需要一种生物安全的转基因百脉根植物的培育和筛选方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是克服现有的转基因百脉根植物的筛选方法所存在的生物安全隐患的缺陷，提供一种新的转基因百脉根植物的培育和筛选方法，该筛选方法采用生物安全选择标记基因，生物安全性好。
本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：
转基因百脉根植物的筛选方法，包括：（1）构建含有标记基因及目的基因的重组植物表达载体，将重组植物表达载体转化百脉根，获得转化外植体；（2）将转化外植体依次通过分化培养、选择培养和生根培养再生获得转基因百脉根植株；其中，步骤（1）中所述的标记基因是磷酸甘露糖异构酶基因；步骤（2）中所述的选择培养或生根培养的培养基中含有甘露糖。
其中，所述选择培养的培养基组成优选是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15‑20g/L；更优选的，所述选择培养的培养基组成是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖20g/L。
所述的生根培养的培养基组成优选是：MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖10‑20g/L；
更优选为MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15g/L。
本发明首先测定百脉根植物外植体对甘露糖耐受浓度，设计了27种不同甘露糖糖和蔗糖浓度配比，观察百脉根外植体在不同浓度梯度培养基中分化情况。30d后，测定不同浓度梯度下的外植体鲜重绘制成标准曲线。
在同一蔗糖浓度下，随着甘露糖浓度的升高，外植体鲜重呈递减趋势，当甘露糖浓度达到20g/L之后，外植体的鲜重平均下降了80%。统计不同浓度梯度下外植体的出芽情况，同一蔗糖浓度下，随着甘露糖浓度的升高，外植体分化率大幅下降，出芽数量减少，芽的生长也因受抑制生长发育迟缓。当甘露糖浓度达到25g/L之后外植体已不再分化，逐渐黄化枯死。在同一甘露糖浓度下，增加蔗糖浓度，外植体的出芽率呈上升趋势，且芽长的粗壮浓密。相对百脉根的子叶，根对甘露糖较为敏感。将百脉根种子置于不同甘露糖浓度的培养基中，2周后发现随着甘露糖浓度的增加，发芽率逐渐降低。生根受到抑制，根系变短，当甘露糖浓度达到10g/L之后，生根受到抑制，甘露糖浓度达到20g/L之后，生根完全受到抑制。通过测定外植体鲜重、出芽率、根系长短等，观察外植体在不同浓度梯度培养基中分化和生根情况，确定百脉根对甘露糖的耐受浓度，结果表明在外植体分化出芽时期，甘露糖耐受浓度为15‑20g/L，优选为20g/L；在生根阶段耐受浓度为10‑20g/L，优选为15g/L；在此基础上，本发明建立了以PMI为筛选标记的百脉根遗传转化体系。
根据目前的文献报道，在转基因甜菜筛选时，在培养基中添加30g/L蔗糖，当甘露糖浓度达到2.5‑3g/L时，幼苗再生被完全抑制，获得最佳转化率的甘露糖浓度为1.25g/L左右（Joersbo et al,1998），在玉米转化研究中，筛选培养基甘露糖和蔗糖的最佳浓度则分别为5g/L和10g/L(Wright et al,2001)。甘露糖筛选体系用于油菜的最适浓度则为甘露糖4.5g/L（Wallbraun et al,2009）。本发明确定的转基因白脉根在外植体分化出芽时期的甘露糖耐受浓度为15‑20g/L，在生根阶段耐受浓度为10‑20g/L，显然比文献报道中的筛选浓度要高很多，这说明百脉根相对其它植物对甘露糖敏感性较小。
本发明构建了以PMI为筛选标记基因的植物表达载体并将其以农杆菌介导法转化百脉根，通过甘露糖筛选，对所获得的抗性植株进行PCR、RT‑PCR及Southern‑blotting检测，并对转基因植株进行了酶活测定，实验结果表明以PMI作为筛选标记获得转化率为23%。本发明进一步构建了以PMI为筛选标记的植物融合表达载体，该植物融合表达载体将禽流感血凝素抗原基因（MHA)与大肠杆菌热敏毒素B亚基基因融合在一起，通过农杆菌介导法将该植物融合表达载体转化百脉根，通过本发明所确定的甘露糖筛选浓度筛选获得78株抗性植株，经分子鉴定获得转PMI基因的植株37株，转MHA‑MLTB融合基因的植株28株，PMI基因和MHAMLTB融合基因均整合入百脉根基因组的植株21株，表明本发明所建立的生物安全的PMI/甘露糖筛选体系可代替传统的抗生素抗性标记应用于转基因百脉根植物的培育和筛选。
除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。
术语“宿主细胞”意指包含本发明多核苷酸的细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生重组宿主细胞，例如直接摄取、转导、f配对或所属领域中已知的其它方法。外源性多核苷酸可保持为例如质粒的非整合载体或者可整合入宿主基因组中。
术语“多核苷酸”或“基因”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA（肽核酸）、在反义技术中所用的DNA类似物（硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等）。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体（包括（但不限于）简并密码子取代）和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选（或所有）密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代（Batzer等人,Nucleic Acid Res.19:5081(1991);Ohtsuka等人,J.Biol.Chem.260:2605‑2608(1985);和Cassol等人,(1992);Rossolini等人,Mol Cell.Probes 8:91‑98(1994)）。
术语“目的基因”指该DNA序列对该特定的宿主细胞而言属于外来的来源，或若来自相同的原始来源但对该原始序列进行了修饰或改造。
术语“转化”：将异源性DNA序列引入到宿主细胞或有机体的方法。
术语“表达”：内源性基因或转基因在植物细胞中的转录和/或翻译。
术语“编码序列”：转录成RNA的核酸序列。
术语“植物表达载体”：一种或多种用于实现植物转化的DNA载体；本领域中这些载体常被称为二元载体。二元载体连同具有辅助质粒的载体是大多常用于土壤杆菌介导转化的。二元载体通常包括：T‑DNA转移所需要的顺式作用序列、经工程化处理以便能够在植物细胞中表达的选择标记物，待转录的异源性DNA序列等。
本发明所涉及的缩略术语：
PMI：磷酸甘露糖异构酶；6‑BA：6‑苄氨基腺嘌呤；Cef：头孢霉素；NAA:萘乙酸；Rif：利福平抗生素；Kan：卡那霉素抗生素。
附图说明
图1甘露糖各浓度梯度时的外植体的鲜重绘制的标准曲线；横坐标为甘露糖各浓度；纵坐标为外植体的鲜重；S0表示蔗糖浓度为0g时，随着甘露糖浓度的不断增加对百脉根外植体鲜重的影响曲线；S10表示蔗糖浓度为10g时，随着甘露糖浓度的不断增加对百脉根外植体鲜重的影响曲线；S20表示蔗糖浓度为20g时，随着甘露糖浓度的不断增加对百脉根外植体鲜重的影响曲线；S30表示蔗糖浓度为30g时，随着甘露糖浓度的不断增加对百脉根外植体鲜重的影响曲线。
图2重组质粒pMD‑19T‑PMI的酶切鉴定结果；M：DNA Marker；1、Xhol单酶切；2、pMD‑19T质粒。
图3重组质粒pCAMBIA1302‑PMI的示意图。
图4重组质粒pCAMBIA1302‑PMI的酶切鉴定结果；M：DNA Marker；1、Xhol单酶切；2、Xhol单酶切。
图5百脉根抗性植株的PCR检测；M：DNA Marker；M:DNA Marker PC：pCAMBIA1302‑PMI质粒NC：野生型1、2、3、4、5、6、7、9、10、11：阳性植株。
图6百脉根抗性植株的PCR‑Southern检测；PC：pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑MARs质粒；NC：野生型P1、P2、P3、P4、P5、P6：阳性植株。
图7百脉根植株的RT‑PCR检测；M:DNA Marker；1‑7:转基因植株。
图8重组载体pMD‑19T‑MHA和pMD‑19T‑MLTB的酶切鉴定结果。
图9重组载体pBI121‑MLTB‑MHA的酶切鉴定结果。
图10重组载体pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA的酶切鉴定结果。
图11重组质粒pMD‑19T‑Mars和pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA的酶切鉴定结果。
图12重组质粒pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars酶切鉴定结果。
图13重组质粒pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars的构建示意图。
图14pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars转入农杆菌PCR鉴定结果。
图15PMI基因的PCR检测结果。
图16MHA基因的PCR检测结果。
图17MLTB基因的PCR检测结果。
图18MHA基因的PCR‑Southern检测结果。
图19MLTB基因的PCR‑Southern检测结果。
图20PMI基因的RT‑PCR检测结果。
图21MHA基因的RT‑PCR检测结果。
图22MLTB基因的RT‑PCR检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1转基因百脉根植物的PMI/甘露糖筛选体系的建立
1试验材料
1.1植物材料
百脉根（L.Corniculatus L.）：里奥百脉根购自北京克劳沃草业技术开发中心。
1.2菌种及质粒
1.2.1.菌种
根癌农杆菌LBA4404（Agrobacterium tumefaciens LBA4404）由本发明人实验室保存（根癌农杆菌LBA4404也可通过各种生物试剂公司购买得到）；大肠杆菌DH5（Escherichia coli DH5）购自北京全式金生物公司。
1.2.2质粒及基因
pCAMBIA1302购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司；
pNOV2804质粒（携带有PMI基因；PMI基因在GeneBank上的登录号为GeneID:944840）由中国科学院植物研究所沈世华老师惠赠；
1.3培养基
MS固体培养基(1L)：MS大量元素50mL、MS钙盐50mL、MS有机元素5mL、MS铁盐5mL、MS微量元素5mL、MS肌醇5mL、蔗糖30g、植物凝胶0.5g/200mL；用去离子水定容至1L，用NaOH调pH约为5.86，高压灭菌15min。
B5固体培养基(1L)：B5大量元素50mL、B5钙盐50mL、B5有机元素5mL、铁盐5mL、B5微量元素5mL、肌醇5mL、植物凝胶0.5g/200mL；用去离子水定容至1L，用NaOH调pH约为5.86，高压灭菌15min。
LB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaC l 10g，琼脂粉1.70g/200mL；去离子水定容至1L，高压蒸气灭菌（121℃，1.034×105Pa）15分钟。
YEB培养基（1L）：胰蛋白胨10g，酵母提取物1g，MgSO47H2O 0.5g，蔗糖5g，琼脂粉1.7g/200mL；去离子水定容至1L，高压灭菌15min。
2试验方法
2.1百脉根对甘露糖敏感性的测定
2.1.1PMI筛选系统不同甘露糖梯度培养基的配制
由于甘露糖对不同的植物毒害程度不同，不同的植物细胞获得最佳转化率时蔗糖与甘露糖最佳比例也不同，因此本试验根据蔗糖和甘露糖的不同配比设计了27浓度梯度进行甘露糖敏感度的测试。甘露糖不同浓度梯度培养基的配制如下表1、表2、表3和表4所示。
表1
  10:0  10:5  10:10  10:15  10:20  10:25  10:30  MS大量元素  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS钙盐  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS铁盐  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS有机元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS微量元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS肌醇  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  蔗糖  10g/L  10g/L  10g/L  10g/L  10g/L  10g/L  10g/L  甘露糖  0g  5g/L  10g/L  15g/L  20g/L  25g/L  30g/L  植物凝胶  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  pH  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86
表2
  20:0  20:5  20:10  20:15  20:20  20:25  20:30  MS大量元素  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS钙盐  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS铁盐  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS有机元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS微量元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS肌醇  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  蔗糖  20g/L  20g/L  20g/L  20g/L  20g/L  20g/L  20g/L  甘露糖  0g  5g/L  10g/L  15g/L  20g/L  25g/L  30g/L  植物凝胶  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  pH  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86
表3
  30:0  30:5  30:10  30:15  30:20  30:25  30:30  MS大量元素  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS钙盐  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS铁盐  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS有机元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS微量元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L
  MS肌醇  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  蔗糖  30g/L  30g/L  30g/L  30g/L  30g/L  30g/L  30g/L  甘露糖  0g  5g/L  10g/L  15g/L  20g/L  25g/L  30g/L  植物凝胶  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  pH  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86
表4
  10:0  24:6  15:15  6:24  0:10  0:0  MS大量元素  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS钙盐  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  50ml/L  MS铁盐  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS有机元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS微量元素  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  MS肌醇  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  5ml/L  蔗糖  10g  24g  15g  6g  0g  0g  甘露糖  0g  6g  15g  24g  10g  0g  植物凝胶  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  0.5g/L  pH  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86  5.86
2.1.2甘露糖对外植体分化的影响
将里奥百脉根种子放入三角瓶中，用无菌水冲洗2遍，在超净工作台中用75%酒精浸泡10min。再将种子移到灭过菌的三角瓶中，然后将种子用灭菌水清洗6‑8遍，再将种子移到滤纸上让其吸干水分。最后将种子移入B5（无糖）培养基中，放入光照培养箱中生长。播种后7d时，选择生长状态良好的无菌苗，将其子叶和外胚轴分别切下，放入不同梯度的培养基中，将剪取的叶片近轴面朝下。每个梯度20个外植体，且选择大小、颜色一致的外植体，观察其生长情况，通过测定30d的鲜重来确定甘露糖的最佳筛选浓度。
2.1.3甘露糖对百脉根生根的影响
将百脉根种子放入三角瓶中，用无菌水冲洗2遍，在超净工作台中用75%酒精浸泡10min。再将种子移到灭过菌的三角瓶中，然后将种子用灭菌水清洗6‑8遍，再将种子移到滤纸上让其吸干水分，最后将种子移入分别含有0g/L、5g/L、10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L甘露糖的培养基中（只含甘露糖不含蔗糖），放入光照培养箱中生长，观察其发芽率和生根情况。
2.2pCAMBIA1302‑PMI农杆菌转化百脉根及再生植株的获得
2.2.1百脉根无菌苗的获得
在超净工作台中，将百脉根种子用75%酒精浸泡10min，再用无菌水冲洗5‑8次，用无菌滤纸吸干水分，接种于B5固体培养基上，放入光照培养箱中生长，光照16h/天，25℃培养，播种后约8‑12d时，种子发芽长出子叶。
2.2.2pCAMBIA1302‑PMI农杆菌转化百脉根
28℃培养2d的平板上挑取单菌落，接种到2mL YEB液体培养基，28℃摇床震荡培养48h。取500μl上述菌液，加入50ml YEB液体培养物中，28℃摇床振荡培养以活化菌体，使细菌达到对数生长期（OD 600为0.5‑0.6）。10000rpm离心15min，菌体用MS液体培养基重悬，使OD 600为0.5‑0.6。
（1）摇菌
在侵染前一天将农杆菌接1ml在约50ml的YEB+RiF30mg/L+Kan50mg/L培养液中，然后放入摇床中28℃过夜培养。
（2）离心
将过夜培养的呈黄色的菌液倒入50ml的离心管中，在离心机中4℃，8000转，离心5min。然后将上清菌液倒掉。剩下的沉淀，用液体MS培养基将沉淀混匀成60‑80ml呈乳白色菌液，这些菌液可以浸染2个培养皿中的外植体。
（3）侵染
取播种后约8天的百脉根幼苗，以百脉根子叶作为外植体在子叶柄部位剪切，放入培养皿中；将混均匀的农杆菌菌液倒入放子叶的培养皿中，浸泡20min，然后将其中的子叶转入有滤纸的培养皿中晾干。
（4）暗培养
用滤纸吸干外植体上的菌液后，将子叶一个个放入不加抗生素的MS培养基中，培养基上要放入一张滤纸用来间隔材料和培养基直接接触，最后将培养皿放入黑暗中，25℃暗培养3‑4天。
2.2.3百脉根再生植株的获得
(1)分化培养
将暗培养后的愈伤组织转接到加抗生素的分化培养基中（MS+BA0.1mg/L+Cef500mg/L）培养。放入光照培养箱中约1周。
(2)选择培养
将一周左右生长良好的子叶愈伤从培养皿中转入选择培养基（MS培养基+蔗糖20g/L+甘露糖20g/L+6‑BA 0.1mg/L+头孢霉素500mg/L）中。大约每两周换一次新的选择培养基。在转苗时，将枯黄的茎叶剪掉，将褐化并且松散软化的愈伤剪掉。如需扩繁，用剪刀在愈伤组织部分剪成几块，分成几株苗放入新的培养基中。
(3)生根培养
将在选择培养基上生长良好的无菌苗，转移到MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15g/L的生根培养基上。每两周换一次新的培养基，快速生根，直至成苗。
3试验结果与分析
3.1百脉根对甘露糖的耐受浓度
3.1.1甘露糖对百脉根生根的影响
为了研究甘露糖对百脉根生根的影响，将百脉根种子种在甘露糖和蔗糖不同配比的培养基中，14d后，发现甘露糖浓度增加，种子的萌发率降低，生根受到抑制，根系变短。
3.1.2甘露糖对外植体分化的影响
由于不同的植物对甘露糖的耐受程度不同，因此按照蔗糖和甘露糖不同的配比设计了27种不同浓度梯度的培养基，以测定最适筛选浓度。结果发现随着甘露糖浓度的增加，外植体形成芽的数目越来越少，而且高甘露糖浓度处理的外植体分化迟缓。当甘露糖浓度达到25g/L之后，外植体不再分化，并且随着时间的延长，这些外植体逐渐由绿变黄，最后枯死。即使在甘露糖为25g/L时有个别的外植体分化，但是却不能继续分化出芽。由表5可以看出外植体分化率随着甘露糖浓度的升高越来越低，而增加蔗糖浓度可以减缓甘露糖对外植体的毒性（表5）。此外，随着甘露糖浓度的升高，外植体分化生成芽的数目明显降低，芽生长迟缓，第30d时，高浓度甘露糖处理的外植体分化出的芽数量减少，芽长度短，生长发育明显受到抑制。
表5不同甘露糖浓度下外植体分化率

根据第30d时各浓度梯度的外植体的鲜重绘制标准曲线（图1），可以看出在甘露糖浓度为20g/L时，外植体的鲜重平均下降了80%，而根的生长在15g/L时几乎完全受到抑制，这说明根对甘露糖更敏感。
根据以上这些数据看出，在外植体分化出芽时期，甘露糖耐受浓度为15‑20g/L,优选为20g/L，在生根阶段耐受浓度为10‑20g/L，优选为15g/L。
3.2pCAMBIA1302‑PMI植物表达载体的构建
3.2.1pMD‑19T‑PMI载体的构建
1.从pNOV2804载体上扩增到两端带有Xhol酶切位点的PMI基因片段(PMI基因在GeneBank上的登录号为Gene ID:944840)，连接在克隆载体pMD‑19T多克隆位点处。提取PCR阳性克隆的质粒，进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图2，将鉴定正确的克隆进行测序。
3.2.2pCAMBIA1302‑PMI植物表达载体的构建
用Xhol酶切测序正确的pMD‑19T‑PMI质粒，回收小片段。同时，用Xhol过夜酶切pCAMBIA1302质粒，回收大片段。经T4连接酶连接，将回收的PMI小片段与pCAMBIA1302大片段过夜连接（图3）。将连接产物转化DH5α感受态细胞，提取阳性克隆质粒进行酶切鉴定，酶切鉴定结果见图4，将鉴定正确的质粒进行测序。
3.2.3pCAMBIA1302‑PMI植物表达载体转化百脉根
选取生长状态良好的7d苗龄百脉根无菌苗，剪取子叶作为外植体，用预先准备好的pCAMBIA1302‑PMI农杆菌菌液侵染20min。用无菌滤纸吸干外植体的菌液，放入MS培养基上，培养基与外植体之间用一张无菌滤纸间隔，放入人工气候箱中进行共培养，黑暗培养3d。将暗培养后的外植体转接到未加选择剂的MS分化培养基中（MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L）培养。放入人工气候培养箱中约一周。将一周左右生长良好的子叶外植体移入添加20g/L甘露糖的选择培养基中（MS+6‑BA0.1mg/L+Cef500mg/L+蔗糖20g/L），每两周换一次新的培养基中，避免产生的毒素物质影响外植体的分化。在移苗时，将枯黄的叶子和褐化的愈伤剪掉。约8周后，将在选择培养基上生长良好的无菌苗，转移到添加15g/L甘露糖的生根培养基中（MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L）。每2周换一次新的培养基，快速生根，直至成苗。约3周后，将已生根的苗转入培养土中，并在培养盆上覆盖一层保鲜膜，并撕开一个小口，以使生长环境既保持湿润，又保持空气流通。约炼苗1周后，将其移入温室中进行培养。
3.2.4pCAMBIA1302‑PMI转基因植株的分子鉴定
3.2.4.1PCR检测
待百脉根阳性幼苗长到6cm左右时，剪取幼苗的小部分组织，提取DNA进行PCR检测（图5）。
3.2.4.2基因组DNA提取及PCR‑Southern检测
在PCR检测为阳性的植株中，随机选取植株进行PCR‑Southern检测，以PMI基因的中间532bp的片段为探针去杂交，结果发现随机选取的这几个植株均为阳性，同时，Southern‑Blotting检测也验证了PCR的可靠性（图6）。
3.2.4.3RNA提取及RT‑PCR检测
选取PCR‑Southern检测的阳性植株，提取总RNA，结果28S和18S条带明显，并且28S比18S条带清晰明亮，完全符合进行后续试验的要求。对提取的总RNA进行反转录成cDNA，然后对植株中的PMI基因进行RT‑PCR检测，结果如图所示（图7）。
3.2.5氯酚红检测（Chlorphenol red assay）
随机选取PCR、RT‑PCR、PCR‑Southern检测均为阳性的植株5个，并在PCR‑Southern检测为阳性，但RT‑PCR检测为阴性的植株中随机取3株，进行氯酚红检测。随机选取的PCR、PCR‑Southern、RT‑PCR检测均为阳性的5个植株，它们的组织均能使培养基酸化，从而使显色剂氯酚红由红色变为黄色，说明组织中表达的PMI有活性。然而，在阴性对照及随机选取的PCR‑Southern检测为阳性，但RT‑PCR检测为阴性的3个植株的培养基却未变色，这说明未检测到PMI。
本试验利用农杆菌介导法，将以PMI为筛选标记的植物表达载体pCAMBIA1302‑PMI转入百脉根子叶外植体中，经选择培养基筛选，获得抗性苗78株；抗性苗经PCR、RT‑PCR等分子检测，获得阳性苗18株，其中阳性苗占所获得的抗性苗的比率达23%。
试验例2转禽流感血凝素抗原基因与大肠杆菌热敏毒素B亚基融合基因百脉根植物的培育及筛选
1、重组质粒pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars的构建
1.1重组载体pMD‑19T‑MHA和pMD‑19T‑MLTB的构建
禽流感血凝素基因（HA）来源于中国农业科学院哈尔滨兽药研究所，本发明根据该高致病性禽流感毒株A/Goose/Guangdong/3/96(H5N1)的血凝素氨基酸序列，按照豆科植物偏爱密码子人工改造，设计合成了适合植物表达的禽流感血凝素基因（说明：所述“禽流感血凝素基因”的核苷酸序列已在授权公告号为CN 100410378C、发明名称为“编码禽流感血凝素的基因及其植物表达载体和应用”的发明专利文献中公开）并保存在pMD‑MHA质粒中。通过PCR扩增，从实验室保存的pMD‑MHA上扩增两端分别带有BamHⅠ和SacⅠ的酶切位点MHA序列，连接到pMD19‑T载体上，挑出阳性克隆，进行酶切，酶切结果见图8，将酶切正确的质粒拿去公司测序，重组产物命名为pMD‑19T‑MHA。
按照设计的MLTB引物，扩增一段去除TAA终止子、上下游分别带有XbaⅠ和BamHⅠ酶切位点的MLTB片段。将扩增片段pMD‑19T载体连接，挑取阳性克隆，进行酶切，酶切结果见图8，将酶切正确的质粒拿去公司测序，重组产物命名为pMD‑19T‑MLTB。
1.2重组载体pBI121‑MLTB‑MHA的构建
用XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切pMD‑19T‑MLTB载体，回收400bp的小片段；用XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶酶切pBI121载体，回收大片段。将回收的400bp的小片段和pBI121大片段，经T4连接酶连接。挑取阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定。重组产物命名为pBI121‑MLTB。
用BamHⅠ和SacⅠ限制性内切酶酶切pMD‑19T‑MHA载体，回收1700bp的片段；用BamHⅠ和SacⅠ限制性内切酶酶切pBI121‑MLTB载体，回收大片段。将回收的1700bp片段和pBI121‑MLTB大片段，经T4连接酶连接。挑取阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果如图9所示。重组产物命名为pBI121‑MLTB‑MHA。
1.3重组载体pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA的构建
用HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶酶切pBI121‑MLTB‑MHA质粒，回收小片段；用HindⅢ、EcoRⅠ限制性内切酶酶切pCAMBIA1302‑PMI载体质粒，回收大片段。将回收的pBI121‑MLTB‑MHA的小片段和pCAMBIA1302‑PMI大片段，用T4连接酶连接，挑取阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果如图10所示。重组产物命名为pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA。
1.4重组载体pMD‑19T‑Mars的构建
通过PCR扩增，从保存MAR序列的载体pGMET‑MAR上扩增得到两端带有HindIII酶切位点的MAR序列，连接到pMD19‑T载体上，挑取其阳性克隆质粒，HindIII酶切，酶切，将酶切正确的质粒测序，重组产物命名为pMD‑19T‑MARs。
1.5重组载体pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars的构建
用HindⅢ限制性内切酶单酶切pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA质粒，回收大片段；用HindⅢ限制性内切酶单酶切pMD‑19T‑Mars（目的片段两端带有HindⅢ酶切位点），回收小片段。将回收的pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA质粒的大片段和pMD‑19T‑Mars的小片段，用T4连接酶连接。挑取阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，重组质粒pMD‑19T‑Mars和pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA的酶切鉴定结果如图11所示。重组产物命名为pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mar。
用EcoRⅠ限制性内切酶单酶切pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mar质粒，回收大片段；用EcoRⅠ限制性内切酶单酶切pMD‑19T‑Mars（目的片段两端带有EcoRⅠ酶切位点），回收小片段。将回收的pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mar质粒的大片段和pMD‑19T‑Mars的小片段，用T4连接酶连接。挑取阳性克隆，进行PCR和酶切鉴定，鉴定结果如图12所示。重组产物命名为pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars。
重组质粒pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars的构建示意图见图13。
2、pCAMBIA1302‑PMI‑MLTB‑MHA‑Mars转入农杆菌PCR鉴定
挑取形状规则，大小一致的单一菌落，接种于400μl含相应抗生素的LB液体培养基中，置37℃摇床200rpm，温育45min，然后进行菌落PCR，挑取阳性克隆，测序。PCR反应条件为：首先94℃、5min，然后94℃变性45sec，55.4℃退火45sec，72℃延伸1min，30个循环，最后72℃延伸10min。PCR反应体系如下表6所示。
表6PCR反应体系

PCR鉴定结果见图14。
3、百脉根遗传转化
（1）百脉根无菌苗的获得
在超净工作台中，将百脉根种子用75%酒精浸泡10min，再用无菌水冲洗5‑8次，用无菌滤纸吸干水分，接种于B5固体培养基上，放入光照培养箱中生长，光照16h/天，25℃培养。播种后约8‑12d时，种子发芽长出子叶。
（2）重组农杆菌转化百脉根
28℃培养2d的平板上挑取单菌落，接种到2mL YEB液体培养基，28℃摇床震荡培养48h。取500μl上述菌液，加入50ml YEB液体培养物中，28℃摇床振荡培养以活化菌体，使细菌达到对数生长期（OD 600为0.5‑0.6）。10000rpm离心15min，菌体用MS液体培养基重悬，使OD 600为0.5‑0.6。
a.摇菌
在侵染前一天将农杆菌接1ml在约50ml的YEB+RiF30mg/L+Ka50mg/L培养液中，然后放入摇床中28℃过夜培养。
b.离心
将过夜培养的呈黄色的菌液倒入50ml的离心管中，在离心机中4℃，8000转，离心5min。然后将上清菌液倒掉。剩下的沉淀，用液体MS培养基将沉淀混匀成60‑80ml呈乳白色菌液，这菌液可以浸染2个培养皿中的外植体。
c.侵染
取播种后约8天的百脉根幼苗，以百脉根子叶作为外植体在子叶柄部位剪切，放入培养皿中。将混均匀的菌液倒入放子叶的培养皿中，浸泡20min。然后将其中的子叶转入有滤纸的培养皿中晾干。
d.暗培养
用滤纸吸干外植体上的菌液后，将子叶一个个放入不加抗生素的MS培养基中，培养基上要放入一张滤纸用来间隔材料和培养基直接接触。最后将培养皿放入黑暗中，25℃暗培养3‑4天。
（3）百脉根再生植株的获得
a.分化培养
将暗培养后的愈伤组织转接到加抗生素的分化培养基中（MS+BA0.1++Cef500mg/L）培养。放入光照培养箱中约1周。
b.选择培养
将一周左右生长良好的子叶愈伤从培养皿中转入选择培养基（MS培养基+6‑BA 0.1mg/L+头孢霉素500mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖20g/L）中。大约每两周换一次新的选择培养基。在转苗时，将枯黄的茎叶剪掉，将褐化并且松散软化的愈伤剪掉。如需扩繁，用剪刀在愈伤组织部分剪成几块，分成几株苗放入新的培养基中。
c.生根培养
将在选择培养基上生长良好的无菌苗，转移到MS+6‑BA0.1mg/L+Cef100mg/L+NAA0.2mg/L+蔗糖20g/L+甘露糖15g/L的生根培养基上。每两周换一次新的培养基，快速生根，直至成苗。
4、转基因植株的分子鉴定
4.1转基因植株的PCR检测
PMI基因的PCR检测结果见图15，MHA基因的PCR检测结果见图16，MLTB基因的PCR检测结果见图17。
4.2转基因植株的PCR‑Southern检测
MHA基因的PCR‑Southern检测结果见图18，MLTB基因的PCR‑Southern检测结果见图19。
4.3转基因植株的RT‑PCR检测
PMI基因的RT‑PCR检测结果见图20，MHA基因的RT‑PCR检测结果见图21，MLTB基因的RT‑PCR检测结果见图22。
5.氯酚红检测
随机选取PCR、PCR‑Southern、RT‑PCR检测均为阳性的百脉根植株5株，选取PCR、PCR‑Southern检测为阳性，但RT‑PCR检测为阴性的植株3株，进行氯酚红检测。结果：PCR、PCR‑Southern、RT‑PCR检测均为阳性的5株百脉根的组织均能使培养基酸化，使显色剂氯酚红由红色变为黄色，说明组织表达的PMI有活性。而阴性对照及RT‑PCR阴性的百脉根，不能使氯酚红变色。
本试验构建了以PMI为筛选标记基因的融合有抗原基因与大肠杆菌热敏毒素B亚基的植物融合表达载体pCAMBIA1302‑PMI‑MHA‑MLTB‑MARs，将所构建的植物融合表达载体转化百脉根，通过试验例1所确立的PMI/甘露糖筛选体系，经选择培养基筛选，获得抗性苗95株；抗性苗经PCR、RT‑PCR等分子检测，获得阳性苗21株，其中阳性苗所占获得的抗性苗的比率可达22.1%。