透明质酸－几丁聚糖生物膜的制备方法.pdf

本申请涉及一种生物膜的制备方法，具体涉及一种用于青光眼术后防止滤过通道瘢痕化的透明质酸－几丁聚糖生物膜的制备方法。该方法以透明质酸、羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇、丁二醇双缩水甘油醚等为原料制备生物膜。该生物膜生物相容性好，具有一定的抑制结膜下成纤维细胞增殖的作用，降解过程缓慢，不会引起明显的炎症反应和免疫排斥反应，成本低廉。为眼科青光眼滤过手术后抑制滤过通道的瘢痕化，提高手术成功率提供了一种新的材料。

1、  一种制备透明质酸-几丁聚糖生物膜的方法，该方法包括如下步骤：
(1)取纯化好的无菌无热原的透明质酸、羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇，三者质量比为8∶1∶1，溶于水中，
(2)按计算好的量加入交联剂丁二醇双缩水甘油醚溶液，搅拌均匀，
固形物与丁二醇双缩水甘油醚的摩尔质量比为40∶1。此处的固形物是指将丁二醇双缩水甘油醚加入步骤(1)的溶液中所形成的凝胶样物质，
(3)流涎法制膜，
(4)真空干燥器中干燥，
(5)膜干后，无菌刀片切成小块，
(6)无菌pH7.4的PBS中浸泡备用。

透明质酸-几丁聚糖生物膜的制备方法
技术领域：
本申请涉及一种生物膜的制备方法，具体涉及一种用于青光眼术后防止滤过通道瘢痕化的透明质酸-几丁聚糖生物膜的制备方法。
背景技术：
青光眼是我国首位的不可逆性致盲眼病，手术仍是我国抗青光眼治疗的首选策略。但是，由于生物固有的创伤愈合机制，青光眼术后滤过通道的瘢痕化是青光眼手术治疗成功的最大障碍。近几年来针对原发性开角型青光眼所设计的新的手术--非穿透小梁切除术联合SK胶植入在临床上得到了广泛的应用，其中SK胶的植入起到了机械支撑滤过通道的作用，SK胶成分为交键透明质酸钠，在滤过手术后的早期，维持了滤过通道，由于房水的持续流动，在一定程度上也延缓和抑制了成纤维细胞的生长，提高了手术成功率。但是由于目前非穿透小梁手术术中植入的材料均来自国外，费用成本高。我们为此进行了成本效益分析，通过非穿透手术来降低一例不良事件需多花费人民币11万元，降低一例严重不良事件需多花费人民币19万元。并通过分析发现，植入材料是该手术选择费用增加的主要来源。只有进一步降低植入材料的成本，该手术方式才能在我国进行进一步的推广。透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖以糖苷链交替连接而成的一种线形多聚糖，广泛存在于高等动物和低等动物的细胞外间质中。大量研究表明透明质酸具有优异的生物相容性和无免疫原性，同时具有高粘弹性。几丁聚糖是生物界仅次于纤维素的第二大类多糖，国内外研究已经证实几丁聚糖具有生物黏附性和多种生物活性，包括几丁聚糖能够促进上皮细胞的生长，抑制成纤维细胞的增殖，抑制肿瘤细胞的增殖，抑制细菌等微生物的生长，促进组织创面的修复等多种作用。因此，几丁聚糖及其衍生物已经广泛的应用到临床工作中，用于防止术后粘连，制作成人工皮肤，促进创伤的皮肤修复等方面。
本发明利用了透明质酸和几丁聚糖的生物特性，成功合成了透明质酸-几丁聚糖生物膜，该生物膜既具有国外产品SK胶在滤过手术通道的机械支撑作用，同时又具有抑制成纤维细胞增殖的作用，并且原材料价格低廉，产品成本大大低于国外进口产品，将会有利于青光眼滤过手术成功率的提高和非穿透小梁手术的广泛推广开展，并且会降低患者的医疗费用。
发明内容：
本发明以透明质酸、羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇、丁二醇双缩水甘油醚等为原料通过如下步骤制备透明质酸-几丁聚糖生物膜。
1取纯化好的无菌无热原的透明质酸、羧甲基壳聚糖、聚乙烯醇，三者质量比为8∶1∶1，溶于水中。
2按计算好的量加入交联剂丁二醇双缩水甘油醚溶液，搅拌均匀。
固形物与丁二醇双缩水甘油醚的摩尔质量比为40∶1。此处的固形物是指将丁二醇双缩水甘油醚加入步骤1的溶液中所形成的凝胶样物质。
3流涎法制膜。
4真空干燥器中干燥。
5膜干后，无菌刀片切成小块。
6无菌pH7.4的PBS中浸泡备用。
本产品优点：用本方法研制的生物膜生物相容性好，具有一定的抑制结膜下成纤维细胞增殖的作用，降解过程缓慢，不会引起明显的炎症反应和免疫排斥反应，成本低廉。为眼科青光眼滤过手术后抑制滤过通道的瘢痕化，提高手术成功率提供了一种新的材料。
附图说明：
图1：实验眼手术区扫描电镜结果图。
图2：对照眼手术区扫描电镜结果图。
图3：实验眼手术区扫描电镜结果图。
图4：对照眼手术区扫描电镜结果图。
图5：实验眼手术区扫描电镜结果图，放大6万倍。
图6：对照眼手术区扫描电镜结果图，放大3万倍。
图7：实验眼手术区扫描电镜结果图，放大2万倍。
图8：实验眼手术区扫描电镜结果图，放大10万倍。
具体实施方式
实施例1：透明质酸-几丁聚糖生物膜的制备
1取纯化好的无菌无热原透明质酸0.4g，羧甲基壳聚糖0.05g，聚乙烯醇0.05g，溶于20ml无菌水中，搅拌2小时。
2加入交联剂1％丁二醇双缩水甘油醚1.3ml，搅拌20min。
3流涎法将搅拌均匀的胶体溶液铺至8×8cm²的平板上。
4放入40℃真空干燥器中干燥1天。
5膜干后，无菌刀片切成5×5cm²大小。
6无菌pH7.4的PBS洗涤浸泡2天。
7小瓶分装。
实施例2：透明质酸-几丁聚糖生物膜对成纤维细胞体外增殖的抑制作用。
体外培养兔眼结膜下成纤维细胞，使用直径为6mm环钻制作圆形实施例1生物膜片。96孔板的第一列8个培养孔中放置预制的环形膜片作为实验组，第二列8个培养孔不放置环形膜作为对照组，将培养第4代的细胞以5×10³个/ml浓度接种在96孔板中，选择接种后24h、48h、72h的细胞行MTT比色，共重复3次。MTT比色方法结果显示实验组24h、48h和72h的光密度值分别是0.2071±8.264×10^-2，0.1736±7.963×10^-2和0.1814±4.749×10^-2，而对照组为0.2837±0.1095^-2，0.2721±8.332×10^-2和0.3070±5.556×10^-2，两者差距均有统计学意义(P＜0.05)，证明在体外合成的透明质酸-几丁聚糖生物膜具有抑制成纤维细胞增殖的作用。
实施例3：透明质酸-几丁聚糖生物膜对兔眼滤过手术滤过通道的作用：
将实施例1制备的生物膜植入在兔眼滤过手术的巩膜瓣下，扫描电镜(见图1-8)发现几丁聚糖共混膜植入区巩膜床表面光滑，可见排列整齐的巩膜板层胶原，表面有少量的增殖胶原纤维；未植入生物膜的对照眼的巩膜床表面粗糙，表面有大量的增殖胶原纤维。透射电镜显示几丁聚糖共混膜植入眼在植入膜周围可见炎症细胞及细胞碎片，同时可见在植入膜旁的成纤维细胞内粗面内质网扩张，部分脱颗粒，显示细胞的合成蛋白和分泌蛋白的功能受到影响，部分成纤维细胞内有大量脂滴，显示细胞功能受损蜕变；对照眼在两层巩膜瓣交界处可见大量含有粗面内质网的成纤维细胞，周围有成熟的胶原纤维。说明几丁聚糖生物膜具有抑制成纤维细胞合成胶原的作用。