一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法.pdf

一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，它是将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上，并获得适当分子量的胰蛋白酶－PEG聚合物，从而建立亲和双水相萃取体系，牛肺经过除杂、切块、捣碎后用硫酸酸解，然后过滤，滤液经过亲和双水相萃取后，最终的上相经过超滤脱盐和冷冻干燥后获得高纯度的抑肽酶产品。本发明制得的产品符合英国药典98版对于抑肽酶产品的要求，即大分子物质不得检出(分子筛层析)。产品的效价达到6300KIU/mg以上。

1.  一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，其特征是它包括亲和双水相萃取剂的制备、亲和双水相萃取体系的建立和纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺，具体步骤工艺如下：
(1)将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制备亲和双水相萃取剂：
首先活化甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)：称取MPEG 100g和无水碳酸钠20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃搅拌回流24小时，离心，将上清液倾入石油醚中，温度控制在30-60℃中，得活化MPEG2粗品沉淀，抽滤，将粗品用体积比为的1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀，同样溶解、沉淀，反复5次，抽干，即得到活化的MPEG，然后用活化后MPEG与胰蛋白酶进行偶联，取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂缓冲液中，然后加入若干胰蛋白酶，轻缓搅拌，胰蛋白酶∶MPEG的摩尔比为1∶5，pH值7.0，采用20KD的超滤膜进行超滤去掉未偶联的MPEG；
(2)亲和双水相萃取体系的建立：
将胰蛋白酶-MPEG、硫酸铵溶液和一定量的抑肽酶粗提液加入到烧杯中，双水相系统的总体积为25mL，磁力搅拌一定时间，调节pH值，在500rpm的转速下离心15min，分别测定上下相的体积、双水相中的抑肽酶活性及总蛋白的含量，建立的亲和双水相萃取体系的萃取条件为：萃取温度为20-30℃、萃取体系中萃取剂的浓度为8-16％(W/V)、(NH₄)₂SO₄的浓度为10-20％(W/V)、pH值为6.0-8.0、搅拌萃取时间为30-45min、萃取体系中初始蛋白浓度为5-25mg/mL；
(3)纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺：
取新鲜牛肺20Kg，经过硫酸酸解后，进行板框过滤，滤液调整pH值为7.0-8.0后成为抑肽酶粗提液，用于亲和萃取，每次亲和萃取体系的的体积定为1L，平均每批产品约萃取50次，每批产品的处理量达到0.2亿KIU左右，平均萃取能力为40万KIU/次，亲和萃取后含抑肽酶的上相组分经过调整pH值至1.5-2.0后用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤后的滤出液过3KD的超滤膜进行超滤脱盐和浓缩，截留液重新用于下一批亲和萃取的萃取剂，将从上述操作中获得的浓缩液进行冷冻干燥获得高纯度抑肽酶精品。

2.  根据权利要求1所述的一种直接从牛肺中纯化制备高纯度抑肽酶的方法，其特征是活化反应中采用的MPEG与均三氧三嗪的摩尔比为2∶1，采用的MPEG分子量为4000-10000。

3.  根据权利要求1所述的一种直接从牛肺中纯化制备高纯度抑肽酶的方法，其特征是采用冷冻干燥的方法保存偶联好的MPEG-胰蛋白酶亲和萃取剂。

一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法
                            技术领域
本发明涉及一种从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法，特别是一种采用亲和双水相萃取工艺直接从牛肺中提取纯化抑肽酶的方法。
                            背景技术
抑肽酶(Aprotinin)，又称为牛胰蛋白酶抑制剂(Bovine pancreatic trypsininhibitor，BPTI)，激肽释放酶抑制剂(Kallikrein inhibitor)，Kunitz抑制剂(Kunitz inhibitor)和抗蛋白酶肽等。其分子式为C284H432N84079S7，为一含58个氨基酸残基的碱性多肽链，其分子量为6.5KD，等电点为10.5。抑肽酶为一种白色或微黄色粉末，无臭，易溶于水，溶于70％乙醇和50％丙酮等，有可透析性。抑肽酶自上世纪60年代开始使用，发现它有抗激肽和抗休克的作用，进而有人成功使用大剂量抑肽酶治疗急性胰腺炎，因而引起了生化与临床医务工作者的高度重视。许多报道表明，抑肽酶对多种丝氨酸蛋白酶具有很强的广谱抑制作用，可以抑制胰蛋白酶(Trypsin)，胰凝乳蛋白酶(Chymotrypsin)、纤维蛋白溶酶(Plasmin)、弹性蛋白酶(Elastin)、激肽释放酶(Kallikrein)等。被用作于治疗急性胰腺炎、肺气肿喘息性支气管哮喘的首选药物，也可用于肿瘤的治疗。
中国专利96120494X公开了一种从黄牛肺中制备抑肽酶的方法为：将牛肺绞碎，用硫酸和80℃保温等“极端”条件将杂蛋白变性，然后用活性碳起脱色和过滤作用，再用10％氢氧化钠调整pH值后静置，离心收集上清液。上清液经过硫酸铵盐析沉淀或有机溶剂分级沉淀制成粗品，再经过胰蛋白酶亲和层析操作后，进行超滤、去热原、冷冻干燥等步骤后获得抑肽酶产品。其中的关键步骤为胰蛋白酶亲和层析步骤，目前采用的层析基质主要有珠状交联琼脂糖和经过化学改性与修饰的微珠壳聚糖等。采用琼脂糖珠为亲和层析的基质时，其缺点是此吸附剂的机械强度小，使用条件苛刻，成本高，故不适合于工业化生产。采用传统的层析纯化工艺有着生产周期长(每个生产批次约需三天以上，其中亲和层析的上样吸附约需要1天以上)，产品的效价低(只能达到5000-6000KIU/mg)，回收率低下，生产步骤多，劳动强度大等缺点。并且采用传统的层析方法虽然有分离度大等优点，但由于受到基质机械强度的限制，存在着柱的容量较小，流速小，处理量低下等诸多缺点，在大规模工业化生产中受到一定的限制。
                            发明内容
本发明的目的是提供一种采用亲和双水相萃取工艺从牛肺中直接提取纯化抑肽酶的方法。
本发明是这样来实现的，它包括亲和双水相萃取剂的制备、亲和双水相萃取体系的建立和纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺，具体步骤工艺如下：
(1)将胰蛋白酶固定到聚乙二醇分子上制备亲和双水相萃取剂：
首先活化甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)，称取MPEG 100g和无水碳酸钠20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，MPEG与均三氧三嗪的摩尔比为2∶1，MPEG分子量为4000-10000，优选为6000，80℃搅拌回流24小时，离心，将上清液倾入石油醚中(30-60℃)中，得活化MPEG2粗品沉淀。抽滤，将粗品用体积比为1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀。同样溶解、沉淀，反复5次，抽干，即得到活化的MPEG。然后用活化后MPEG与胰蛋白酶进行偶联，取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂缓冲液中，然后加入若干胰蛋白酶(效价为3000KIU/mg以上)，轻缓搅拌(50rpm)，偶联条件为：15℃、8小时、胰蛋白酶∶PEG为1∶5，pH值7.0。采用20KD的超滤膜进行超滤去掉未偶联的MPEG，偶联好的MPEG-胰蛋白酶亲和萃取剂采用冷冻干燥的方法保存；
(2)和双水相萃取体系的建立：
将胰蛋白酶-PEG或PEG溶液，硫酸铵溶液和一定量的抑肽酶粗提液(总蛋白浓度达到15mg/mL，抑肽酶活性为23KIU/mL)，双水相系统的总体积为25mL，磁力搅拌一定时间，调节pH值，在500rpm的转速下离心15min，分别测定上下相的体积、双水相中的抑肽酶活性及总蛋白的含量。其中：抑肽酶分配系数Ke＝上相总酶活ct/下相总酶活cb；总蛋白分配系数Kp＝上相总蛋白含量/下相总蛋白含量；抑肽酶的回收率＝上相中抑肽酶的含量/抑肽酶粗提液中抑肽酶的含量；相比R＝上相体积vt/下相体积vb。建立的亲和双水相萃取体系的萃取条件为：萃取温度为20-30℃、萃取体系中萃取剂的浓度为8-16％(W/V)、(NH₄)₂SO₄的浓度为10-20％(W/V)、pH值为6.0-8.0、搅拌萃取时间为30-45min、萃取体系中初始蛋白浓度为5-25mg/mL。此时蛋白质分配系数Kp达到0.28，Ke达24；
(3)纯化抑肽酶的亲和双水相萃取工艺：
取新鲜牛肺20Kg，经过硫酸酸解后(pH1.5)，进行板框过滤，滤液调整pH值为7.0-8.0后成为抑肽酶粗提液，用于亲和萃取。每次亲和萃取体系的的体积定为1L，平均每批产品约萃取50次，每批产品的处理量达到0.2亿KIU左右，平均萃取能力为40万KIU/次。亲和萃取后含抑肽酶的上相组分经过调整pH值至1.5-2.0后用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤后的滤出液过3KD的超滤膜进行超滤脱盐和浓缩。截留液重新用于亲和萃取的萃取剂。将上述中获得的浓缩液进行冷冻干燥获得高纯度抑肽酶精品。
本发明采用胰蛋白酶固定化技术将胰蛋白酶固定到聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG)上，控制偶联条件，获得适当分子量胰蛋白酶-PEG聚合物，并采取胰蛋白酶-PEG/(NH₄)₂SO₄亲和萃取体系进行提取牛肺中的抑肽酶，然后采用超滤的方法将结合到胰蛋白酶上的抑肽酶与胰蛋白酶-PEG分离，超滤的滤出液经过超滤脱盐、冻干后获得高效价的抑肽酶产品。产品的纯度或效价远远高于国家标准，效价达到6300KIU/mg。
                         具体实施方式
以下为本发明的一个具体实施实例。
甲氧基化的聚乙二醇(MPEG)的活化：称取MPEG 100g和无水碳酸钠20g，溶于苯500mL中，加入均三氯三嗪1.5g，80℃搅拌回流24小时，离心，将上清液倾入石油醚中(30-60℃)中，得活化MPEG2粗品沉淀。抽滤，将粗品用体积比为的1∶1的苯∶丙酮混合液溶解，再用石油醚沉淀。同样溶解、沉淀，反复5次，抽干，即得到活化的MPEG。
活化后MPEG与胰蛋白酶地偶联：取活化后的MPEG 3.0g并溶解于0.025mol/L的硼砂缓冲液中，然后加入若干胰蛋白酶(效价为3000KIU/mg以上)，轻缓搅拌(50rpm)，偶联条件为：15℃、8小时、胰蛋白酶∶PEG为1∶5，pH值7.0。采用20KD的超滤膜进行超滤去掉未偶联的MPEG。
胰蛋白酶-PEG/(NH4)2SO4亲和萃取体系的建立：在一个小烧杯(50mL)中按要求加入一定比例的胰蛋白酶-PEG或PEG溶液，硫酸铵溶液和一定量的抑肽酶粗提液(总蛋白浓度达到15mg/mL，抑肽酶活性为23KIU/mL)，双水相系统的总体积为25mL，磁力搅拌一定时间，调节pH值，在500rpm的转速下离心15min，分别测定上下相的体积、双水相中的抑肽酶活性及总蛋白的含量。其中：抑肽酶分配系数Ke＝上相总酶活ct/下相总酶活cb；总蛋白分配系数Kp＝上相总蛋白含量/下相总蛋白含量；抑肽酶的回收率＝上相中抑肽酶的含量/抑肽酶粗提液中抑肽酶的含量；相比R＝上相体积vt/下相体积vb。
根据单因素实验的结果，建立的亲和双水相萃取体系的萃取条件为：萃取温度为25℃、萃取体系中萃取剂的浓度为12％(W/V)、(NH₄)₂SO₄的浓度为15％(W/V)、pH值为7.0、搅拌萃取时间为30min、萃取体系中初始蛋白浓度为15mg/mL。此时蛋白质分配系数Kp达到0.28，Ke达24。
抑肽酶的亲和双水相萃取工艺：取新鲜牛肺20Kg，经过硫酸酸解后(pH1.5)，进行板框过滤，滤液调整pH值为7.5后成为抑肽酶粗提液，用于亲和萃取。每次亲和萃取体系的的体积定为1L，平均每批产品约萃取50次，每批产品的处理量达到0.2亿KIU左右，平均萃取能力为40万KIU/次。亲和萃取后含抑肽酶的上相组分经过调整pH值至1.5-2.0后用截留分子量为10KD的超滤膜进行超滤后的滤出液过3KD的超滤膜进行超滤脱盐和浓缩。截留液重新用于亲和萃取的萃取剂。将上述中获得的浓缩液进行冷冻干燥获得高纯度抑肽酶精品。