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1、10申请公布号CN104046601A43申请公布日20140917CN104046601A21申请号201410248592922申请日20140606C12N9/20200601C12R1/64520060171申请人南昌大学地址330000江西省南昌市红谷滩新区学府大道999号72发明人吴兰葛刚张小琴余祥单刘以珍74专利代理机构南昌洪达专利事务所36111代理人刘凌峰54发明名称解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基57摘要本发明公开了一种解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基，其特征是所述培养基溶液包含01蔗糖、01尿素、25蛋白胨、01硫酸镁、15氯化钠、01吐温80、7G/L油。
2、,PH自然。本发明使得微生物细胞生产脂肪酶的能力提高，在处理色拉油、橄榄油废水的同时大量产生脂肪酶，为废水的资源化利用奠定了基础。51INTCL权利要求书1页说明书3页19中华人民共和国国家知识产权局12发明专利申请权利要求书1页说明书3页10申请公布号CN104046601ACN104046601A1/1页21一种解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基，其特征是所述培养基溶液包含01蔗糖、01尿素、25蛋白胨、01硫酸镁、15氯化钠、01吐温80、7G/L油,PH自然，所述是百分比是指100ML溶液中所含溶质的克数。2一种解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的方法，其特征是将解脂耶氏酵母W29。
3、按照25（VV）的接种量接入权利要求1所述的培养基中进行发酵培养；使用500ML三角瓶，装液量150ML，培养温度30，摇床转速150R/MIN，有氧培养60H；培养结束后，发酵液在4，5000RPM离心10MIN后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶。权利要求书CN104046601A1/3页3解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基技术领域0001本发明涉及一种微生物培养基，尤其涉及一种解脂耶氏酵母W29培养基，属于微生物产脂肪酶的生产技术领域。背景技术0002脂肪酶EC3113是一类作用于酯键的重要水解酶，是能够水解长链脂肪酸甘油酯生成游离长链脂肪酸、甘油、甘油单酯和甘油二酯或者该反应逆反应。
4、的界面酶，是能在油水界面或脂溶性系统中催化水解、酸解、醇解、胺解、酯化、转酯、酯交换等多种化学反应的生物催化剂。它具有化学选择性、立体选择性、位点选择性和底物专一性等特点，已成为了重要的工业用酶之一，广泛应用于饲料、食品、洗涤、油脂废水处理等传统工业领域，以及生物能源如生物柴油、手性药物合成、生物传感器等现代工业领域。0003脂肪酶主要存在于动物、植物和微生物中，且在微生物中产脂肪酶种类最多，已发现至少有65个产酶微生物属，其中包括细菌28个属、酵母菌10个属、放线菌4个属，其他真菌共23个属。由于微生物脂肪酶不仅可以催化酯类化合物的醇解、水解、酯化、酯合成以及酯交换等反应，而且反应过程中不需。
5、要辅酶、反应条件温和、耗能低、底物原材料广泛、副产品少，且容易获得和进行大规模生产，同时具有比动植物脂肪酶更广泛的作用PH和温度适应性等优点，使其成为了工业用酶的重要来源。脂肪酶作为重要的工业用酶，应用广泛、需求量大，因此通过发酵工艺条件优化来提高菌株产酶能力是一个非常紧迫的工作。0004解酯耶式酵母YARROWIALIPOLITICA是一种非常规性的、严格好氧、生长条件温和的子囊酵母，它能以糖类、油脂类以及烃类等广泛低廉物质作碳源进行生长。我们的前期研究表明经我们实验室改良的解脂耶氏酵母W29对色拉油、餐饮废水有较高的降解能力，即在温度为2530、PH6070、培养时间为50H、摇床转速20。
6、0R/MIN的条件下，对油含量2000MG/L的色拉油和餐饮废水的降解率达到了933和851。解脂耶氏酵母W29有很强的降解油脂的能力，且降解油脂主要是通过产生脂肪酶来进行的。尽管解脂耶氏酵母能产脂肪酶已有文献报道，且已经知道YLIPOLITICA共有8种不同的基因编码脂肪酶，但是在处理油脂废水过程中生产脂肪酶的报道相对较少。研究表明不同的的诱导剂、碳源及不同的培养条件表达的脂肪酶基因不同，GERARDO等人发现用玉米油做碳源以及诱导剂、降低通气量都可以使YLIPOLITICA提高脂肪酶的产量，因此培养基的组成就对YLIPOLITICA表达那种脂肪酶以及产量有着至关重要的影响。发明内容0005。
7、本发明的目的在于提供一种解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基，以提高解脂耶氏酵母W29产脂肪酶的产量。0006本发明是这样来实现的，一种解脂耶氏酵母W29生产胞外脂肪酶的培养基，其特征是所述培养基包含01蔗糖、01尿素、25蛋白胨、01硫酸镁、15氯化钠、01吐温80、7G/L油,PH自然，所述是百分比是指100ML溶液中所含溶质的克数。即每100ML培说明书CN104046601A2/3页4养基溶液含01G蔗糖、01G尿素、25G蛋白胨、01G硫酸镁、15G氯化钠、01G吐温80、07G油、余量为水。0007本发明是针对解脂耶氏酵母W29在现有培养基（色拉油水培养基、色拉油YPD培养基、。
8、引用培养基）内产酶量都很低的情况下（低至052U/ML），通过培养基配方的优化，以油外加01蔗糖为碳源、以尿素蛋白胨为氮源、加上少量的无机盐、吐温80表面活性剂为激活剂，使得解脂耶氏酵母（YLIPOLITICA）W29在利用油脂为碳源并对之降解的同时，大幅提高了发酵水平，发酵60H所达到最高酶活性（以橄榄油为底物达到870U/ML，以色拉油为底物达到404U/ML）。产生的脂肪酶活性仍然比LOPES等人报道的解脂耶氏酵母W29分解橄榄油废水生产脂肪酶活性高出40倍。本发明通过优化培养基配方，使得微生物细胞生产脂肪酶的能力提高，在处理色拉油、橄榄油废水的同时大量产生脂肪酶，为废水的资源化利用奠定。
9、了基础。具体实施方式0008为了便于理解，下面结合实施例对本发明予以进一步说明。实施例中涉及的百分号（）若无特别说明，是指100ML溶液中所含溶质的克数。下述实施例中以YLIPOLITICAW29（保藏在南昌大学分子生物学与基因工程重点实验室）为菌种，经过YPD培养基活化后，接种到发酵培养基进行发酵培养，培养后离心获得上清液为所包含的胞外脂肪酶。本研究以温度为40，PH70的条件下，以脂肪酶水解三油酸甘油酯每分钟产生1U/MOL游离肪酶酸所需的酶量定义为一个酶活单位U，国际单位U/ML。所述油为橄榄油（国药集团化学试剂有限公司）或色拉油（金龙鱼牌111调和油，市售）。0009实施例1按照如下步。
10、骤使用解酯耶式酵母W29生产胞外脂肪酶（1）种子培养将解酯耶式酵母（YLIPOLITICA）W29接入含有1酵母膏、2蛋白胨、2葡萄糖、PH自然的YPD液体培养基中进行摇床培养，使用250ML三角瓶，装液量50ML，培养温度28，摇床转速150R/MIN，培养18H。0010（2）发酵培养按照25（VV）的接种量接入含有01蔗糖、01尿素、25蛋白胨、01MGSO47H2O、15NACL、01吐温80、7G/L橄榄油，PH自然的培养基中进行发酵培养。使用500ML三角瓶，装液量150ML，培养温度30，摇床转速150R/MIN，有氧培养60H。培养结束后，发酵液在4，5000RPM离心10MI。
11、N后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，测定的脂肪酶活力为870U/ML。同时以引用培养基（2蛋白胨，05蔗糖，07橄榄油，01NH42SO4，01MGSO47H2O，02K2HPO4）为对照，生产的脂肪酶活性提高了28倍。0011实施例2按照如下步骤使用解酯耶式酵母W29生产胞外脂肪酶（1）种子培养将解酯耶式酵母（YLIPOLITICA）W29接入（1酵母膏，2蛋白胨，2葡萄糖，PH自然）YPD液体培养基中进行摇床培养，使用250ML三角瓶，装液量50ML，培养温度28，摇床转速150R/MIN，培养18H。0012发酵培养按照25（VV）的接种量接入含有01蔗糖、01尿素、25蛋白胨、01MGSO47H2O、15NACL、01吐温80，PH自然、7G/L色拉油的培养基中进行发酵培养。使用使用500ML三角瓶，装液量150ML，培养温度30，摇床转速150R/MIN，有氧培养说明书CN104046601A3/3页560H。培养结束后，发酵液在4，5000RPM离心10MIN后获得的上清液即包含了所需的脂肪酶，测定的脂肪酶活力为404U/ML。同时以7G/L色拉油水培养基为对照，生产的脂肪酶活性提高了8倍。说明书CN104046601A。