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本发明涉及通过用羰基还原酶和辅酶酶促催化还原2－丁酮而制备2－丁醇的方法，且其特征在于：为还原2－丁醇，使含有羰基还原酶和辅酶的水相和与所述水相不相混溶并含有2－丁酮的醇相相接触，前提是在醇相中存在的醇是能够使辅酶再生和具有高于水的沸点的仲醇，接着使产生的2－丁醇在随后被分离。

1.  通过借助羰基还原酶和辅酶酶促催化还原2-丁酮而制备2-丁醇的方法，其特征在于：
(a)为还原2-丁酮，使含有羰基还原酶和辅酶的水相和不与所述水相混溶且含有2-丁酮的醇相相接触，其前提是，在醇相中存在的醇是能够再生辅酶并具有高于水的沸点的仲醇，接着
(b)分离形成的2-丁醇。

2.  权利要求1的方法，其特征在于，所述醇相中的醇是2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、2-辛醇或者4-甲基-2-戊醇。

3.  权利要求2的方法，其特征在于，所述醇相中的醇是2-庚醇或者2-辛醇。

4.  权利要求1-3中任一项的方法，其特征在于，醇相中的仲醇和2-丁酮以1∶2-1∶10(2-丁酮∶仲醇)的摩尔比使用。

5.  权利要求4的方法，其特征在于，所述摩尔比为1∶2.5-1∶5。

6.  权利要求1-5中任一项的方法，其特征在于，2-丁酮以至少5体积％、优选10-25体积％的量使用，以总反应混合物计。

7.  权利要求1-6中任一项的方法，其特征在于，每千克2-丁酮使用至少2000单位、但优选至少10000单位的羰基还原酶。

8.  权利要求1-7中任一项的方法，其特征在于，使用由近平滑假丝酵母得到的羰基还原酶。

9.  权利要求1-8中任一项的方法，其特征在于，通过蒸馏进行所形成的2-丁醇的分离。

10.  权利要求1-9中任一项的方法，其特征在于，使用能够制备基本上对映体纯的S-2-丁醇或者R-2-丁醇的羰基还原酶。

2-丁醇制备方法
本发明涉及制备2-丁醇的方法，和特别是借助羰基还原酶和辅酶来酶促催化还原2-丁酮制备R-2-丁醇和S-2-丁醇的方法。
在制备药物活性物质时，2-丁醇和特别是手性化合物R-2-丁醇和S-2-丁醇是理想的中间产物。
制备对映体纯的2-丁醇即R-2-丁醇和S-2-丁醇是昂贵的，这是因为将2-丁酮直接化学催化不对称还原成R-2-丁醇或者S-2-丁醇至今是不可能的。直接酶促还原的方法迄今也还未有记载。对映体纯的R-2-丁醇和S-2-丁醇在大工业规模上仅能绕道通过拆分外消旋体而制备。
已知羰基还原酶(其它名称：醇脱氢酶，氧化还原酶)为用于还原羰基化合物或者用于氧化仲醇的催化剂。这些酶需要辅酶，例如NAD(P)H。借助由高加索酸奶粒状乳杆菌(Lactobacillus kefir)得到的羰基还原酶和辅酶NADPH还原酮由例如US 5342767已知。
来自莫拉菌属(Moraxella sp.)的醇脱氢酶的提纯和表征由Eur.J.Biochem.254，356-362(1998)已知。
在含水介质中借助羰基还原酶将2-丁酮还原为2-丁醇是困难的，这是因为反应混合物不容易后处理和2-丁醇非常好地溶于水中。此外，用于分离2-丁醇和水的萃取和蒸馏方法在技术上是昂贵的。
借助羰基还原酶来将2-丁酮酶促还原成2-丁醇的另一问题在于辅助因素NADH或者NADPH的再生。现今通常使用的借助2-丙醇再生NAD(P)H的方法在这里同样是麻烦的，这是因为2-丙醇使得产物R-2-丁醇和S-2-丁醇更加困难，并且其与R-2-丁醇和S-2-丁醇的完全分离极其昂贵。
在借助2-丙醇同时进行NAD(P)H辅酶再生情况下在含水介质中在酶促还原2-丁酮时的另一问题在于大多数酶在2-丙醇和2-丁醇含量超过20％时失活。这意味着，当采用过量的2-丙醇开始时，所采用的2-丁酮的最终浓度必须远低于10％(w/v)。这些低的可实现的底物浓度或者产物浓度再次使得从反应混合物中分离R-2-丁醇或者S-2-丁醇变得困难。
现在，根据本发明的通过借助羰基还原酶和辅酶来酶促催化还原2-丁酮而制备2-丁醇的方法的任务在于解决上述问题，且其特征在于：
(a)为还原2-丁酮，使含有羰基还原酶和辅酶的水相和不与所述水相混溶且含有2-丁酮的醇相相接触，其前提是，在醇相中存在的醇是能够再生辅酶并具有高于水的沸点的仲醇，
接着
(b)分离形成的2-丁醇。
因此，在根据本发明的方法中借助羰基还原酶将2-丁酮转化为2-丁醇的反应在两相体系中进行，所述两相体系由其中溶解有酶和辅酶的水相和由所述仲醇和2-丁醇形成的有机相组成。
所述辅酶再生借助不与水混溶且同时具有尽可能明显高于水的沸点的仲醇进行。经证实有利的是2-戊醇、2-己醇、2-庚醇、2-辛醇和4-甲基-2-戊醇，其中优选2-庚醇和2-辛醇。
作为辅酶而言NADH和NADPH是特别合适的。此外，在本发明方法中，不与水混溶的仲醇导致羰基还原酶的稳定化。
使用不与水混溶的仲醇进行辅酶再生的优点在于，所述仲醇可以以相对于待还原的底物2-丁酮计更高程度的过量使用。由此同时实现在进料中更高的2-丁酮浓度和更高的转化率。因此，优选的是醇相中的仲醇和2-丁酮以1∶2至1∶10(2-丁酮∶仲醇)的摩尔比使用，其中1∶2.5至1∶5的摩尔比是特别优选的。
根据本发明方法的另一优选方案在于，以至少5体积％、优选10-25体积％的量使用2-丁酮，以总反应混合物计。
所述羰基还原酶优选以每千克2-丁酮至少2000单位、但优选至少10000单位羰基还原酶的量使用，其中上限宜为每千克2-丁酮250000单位羰基还原酶。其中酶单位1U对应于每分钟(min)转化1μmol 2-丁酮所需的酶量。
经证实特别有效的是，源自近平滑假丝酵母(CandidaParapsilosis)的那些酶作为羰基还原酶或者醇脱氢酶。优选的是采用能够制备基本上为对映体醇的S-2-丁醇或者R-2-丁醇的羰基还原酶。在此发现，来自近平滑假丝酵母的羰基还原酶能够将2-丁酮立体有择地还原成S-2-丁醇，其中取决于所选择的方法条件，可实现超过98％所需的对映体的对映体纯度。
在本发明方法中形成的2-丁醇存在于仲醇相中并可以与仲醇一起从水相中滗析出来。然后可以以简单的方式蒸馏得到2-丁醇。
在本发明方法中还可以使用相应的对映体纯S-醇以进行辅酶再生。
在反应混合物的总体积中水相和有机相的份额可以变化，其中水相的份额可以降低到3体积％，这导致在由不与水混溶的醇形成的相中存在超过大于90％的所采用的2-丁酮和R-2-丁醇或者S-2-丁醇。
本发明方法的另一优点在于相对简单地后处理和分离高纯度形式的R-2-丁醇或者S-2-丁醇。产物R-2-丁醇或者S-2-丁醇的分离通过从高沸点的不与水混溶的仲醇中分离出有机相和蒸馏2-丁酮/2-丁醇而进行。
然后可以借助蒸馏得到由大于99％化学纯度且具有大于98％的对映体纯度的2-丁醇/2-丁酮混合物组成的手性产物R-2-丁醇或者S-2-丁醇。
在根据本发明方法中所用的底物2-丁酮的浓度优选高于5体积％，特别优选为10体积％至25体积％。
以水相计，辅酶NAD(P)H的浓度为0.01mM至10mM，特别是0.1mM至1mM。
在本方法所用的水相中优选添加缓冲剂，例如pH值为5-10，优选pH值为6-9的磷酸钾、Tris/HCl或者三乙醇胺缓冲液。
在本发明方法中，所述羰基还原酶可以是完全纯化或者部分纯化的，以细胞溶解产物形式或者以整个细胞形式使用。其中所采用的细胞可以以天然形式或者渗透化形式使用。
所述温度例如为约10℃-60℃，优选为25℃-35℃。
根据本发明的方法可以例如在由玻璃或者金属制成的封闭反应容器中进行。为此，将组分各自引入到反应容器中并在例如氮气或者空气的气氛下搅拌。反应时间为1小时至48小时，特别是2小时至24小时。
代替来自近平滑假丝酵母的羰基还原酶，还可以使用其它的能够将2-丁酮对映体有择地还原为S-2-丁醇或者R-2-丁醇的羰基还原酶。
借助下面的实施例来更详细地描述本发明。
                       实施例1
在本实施例中指出了由2-丁酮制备S-2-丁醇和S-2-丁醇的产率对所使用的2-丁酮/仲醇(2-庚醇)的比率的依赖性。作为羰基还原酶使用的是来自近平滑假丝酵母的羰基还原酶。辅酶再生借助2-庚醇进行。在下面表1中示出了对于具有不同的2-丁酮/2-庚醇比率的三种进料的转化数据。
                            表1