用作生长因子抑制物的FLT-4(类fms酪氨酸激酶)， FLT-15及其变异体 【发明领域】
本发明涉及抑制生长因子特别是血管内皮生长因子(VEGF)的物质，抑制生长因子及治疗肿瘤和调节生育力的方法。
【发明背景】
人们已经知道相当多的人类生长因子，其中许多已至少部分地被表征。其中之一是已在多种组织中鉴定到的血管内皮生长因子(VEGF)，(Gospodarowicz等，1989，PNAS 86，7311-7315；Conn等，1990，PNAS87，2628-2632；Tischer等，1991，生物化学杂志，266，11947-11954)。顾名思义，该生长因子是内皮细胞的高度特异性的促细胞分裂素，积极参与血管形成。VEGF是同二聚体糖蛋白，有两个23kDa亚基，与血小板来源的生长因子A和B链及胎盘生长因子有序列同源性。
同源的酪氨酸激酶受体，类fms酪氨酸激酶受体(FLT)和含有激酶插入结构域受体(KDR)，是高亲和性VEGF受体(de Vries等，1992，科学255，989-991；Terman等，1992，生物化学和生物物理研究公报187，1579-1586)。FLT和KDR都是跨膜受体，在细胞外配体结合区都有7个类免疫球蛋白(immunoglobulin-like)结构域，都有细胞内酪氨酸激酶结构域以及跨膜结构域。跨膜结构域将受体锚定到表达该受体的细胞的细胞膜上。
已发现一些膜连受体分子以截短的可溶形式存在，这种形式由蛋白水解加工或mRNA的交替拼接产生。最近，Kendall和Thomas(1993PNAS 90，10，705-10，709和WO94/21679)描述了一种交替拼接产生的FLT受体可溶形式(sFLT)的发现。
实质上，Kendall和Thomas用一种对flt编码区3′端(编码细胞内酪氨酸激酶结构域)特异性的探针和另一种对5′flt编码部分(编码细胞外N末端结构域之一)特异性的探针筛选一个人类脐静脉内皮细胞(HUVEC)cDNA文库。与5′特异性探针杂交而不与3′特异性探针杂交的克隆被选出作进一步研究。用这种方法，分离出一个克隆，它编码缺失跨膜结构域和细胞内结构域地可溶性FLT多肽。一个内含子终止密码子的“通读”造成这种截短。Kendall和Thomas建议可以将可溶性受体用作体内VEGF的有效的特异性拮抗物。
本发明基于更多的FLT可溶性变异体的发现，其存在不能由Kendall和Thomas的方法预测到。
发明概述
第一方面，本发明提供FLT多肽的改变的可溶形式，它能结合VEGF，因而产生抑制效应。该多肽含有5个或更少的完整的类免疫球蛋白结构域。优选地，改变的FLT多肽含有4个或更少的完整的类免疫球蛋白结构域。改变的可溶性FLT多肽通过阻止VEGF结合其天然受体-靶细胞表面的flt和KDR-而抑制VEGF。意外的是，这种截短形式尽管缺少了分子的一个主要的细胞外部分，仍被认为保持了对VEGF的亲合性。
此处用的术语“可溶性”意指FLT多肽的改变的形式，它不含有跨膜结构域因而一般不与表达该分子的细胞的细胞膜相联系。具体地说，本发明提供FLT多肽的可溶性的改变的形式，它基本上由4个或5个完整的类免疫球蛋白结构域组成。
在一具体实施方案中，本发明提供FLT的一种改变的可溶形式，其C末端有一区域，该区域基本上含有图5中显示的称作FLT4或FLT15序列的氨基酸序列，或其功能等价物。上面用的术语“功能等价物”包括这样一些多肽，它们与FLT4或FLT15编码的多肽基本上有相同的缺失(相对未改变的全长FLT分子而言)，但也可能有其它缺失、添加或替换(特别是保守性替换)，并且保持对VEGF的抑制效应。
优选地，该多肽在其N-末端还含有基本上对应于未改变的野生型FLT多肽的等价部分的氨基酸序列。适宜地，本发明的多肽含有400到500个左右氨基酸残基，优选480个左右氨基酸残基，最优选的是野生型FLT序列480到440之间的氨基酸残基。优选地，本发明的多肽由mRNA的交替拼接或成熟多肽的蛋白水解加工得到，尽管很明显，对于本领域的技术人员，该多肽可以(至少部分)被来源于重组DNA技术的核酸编码。
本发明进一方面提供一段编码本发明的多肽的核酸序列。在具体实施方案中，本发明提供一段核酸，它含有图3给出的FLT4序列中插入位置1655的核苷酸序列或是图3给出的FLT15序列中插入位置1555的核苷酸序列，或其功能等价物。功能等价核酸的例子包括那些编码与FLT4或FLT15编码的多肽基本上相同的多肽的序列，但由于遗传密码的简并性，这些多肽的核苷酸序列有所不同。对本领域的技术人员很明显，FLT4和FLT15中出现在早熟终止密码子后的那部分插入核苷酸序列可以去除而不影响所编码多肽的特性。相应地，没有这类序列的核酸分子，就本发明的目的来说，也可视为功能上等价。
适宜地，该核酸基本上含有图3给出的FLT4或FLT15的核苷酸序列，以及编码未改变的野生型FLT的N-末端的核苷酸序列。有利地，核酸从人类细胞样本中用PCR扩增得到。最合需要地，核酸用与FLT分子非保守区杂交的引物由PCR方法来得到。适宜地，核酸序列用被设计成与图3给出的下面划线的FLT序列区域或紧邻的区域杂交的PCR引物来得到。特别地，PCR引物应当基本上具有序列：5′-GCAAGGTGTGACTTTGTTC-3′和5′-AGGATTTCTTCCCCTGTGTA-3′。
另一方面，本发明提供一种体外抑制VEGF的方法，包括加入有效量的上述多肽。在受试人体内抑制VEGF也是人们需要的。因此本发明给出一种在受试人体内抑制VEGF的方法，包括用有效量的上述多肽以及一种生理可接受的载体物质给药。特别地，VEGF提供细胞分裂刺激信号(特别是参与血管形成的信号)，因而抑制VEGF预期会在与不适当的新血管生成有关的肿瘤或疾病的治疗中起到疗效。
特别地，本发明给出一种治疗与不适当的新血管生成有关的肿瘤或疾病的方法，包括用有效量的上述多肽以及一种生理可接受的载体物质给药。可能得到治疗的疾病包括卵巢癌和卵巢过度刺激(ovarianhyperstimulation)(Boocock等1995，国家癌症协会杂志87，506-516)。
另外，已确证FLT由滋养层和卵巢及内皮组织的细胞表达(Charnock-Jones等1994生殖生物学51，524-530)。这清楚地表明植入过程中VEGF对滋养层的生长和分化所起的作用。
因此，特别地，本发明提供一种通过抑制VEGF的作用来影响滋养层，卵巢细胞或子宫内膜细胞的生长和/或迁移的方法，包括用有效量的上述多肽以及一种生理可接受的载体物质给药。
本领域的专业人员应当理解，确定滋养层和子宫内膜细胞表面的FLT可能提供许多调节生育力的方法。例如，滋养层的生长对胚胎的成功植入是必需的。因此抑制滋养层生长提供了一种避孕或contragestion的方法。
因此本发明进一方面提供一种调节妇女生育力的方法，包括用有效量的上述多肽以及一种生理可接受的载体物质给药。多肽的“有效量”是足以基本上阻遏VEGF对滋养层和/或子宫内膜细胞的刺激的量。典型地，本方法将导致妇女的生育力降低。
此外，有可能鉴定出可以增强VEGF对滋养层的作用的药剂，从而增大辅助或自发月经周期(assisted or spontaneous cycles)中成功植入的概率。这种VEGF增强剂的候选物包括编码本发明的截短FLT多肽的核酸序列的反义等价物。对本领域的专业人员很明显，它们将被用于提高妇女的生育力。
另一方面，本发明提供一种含有上述多肽和一种生理可接受的载体物质的药物组合物。该组合物可在体内按上述任一方法使用。另一方面，本发明提供本发明的多肽在制备用于治疗与不适当的新血管生成有关的肿瘤和疾病的治疗组合物中的应用。这样的情况和疾病的例子在WO94/10202和WO94/21679中有详细描述。本发明在其范围内也包括一种生产药物组合物的方法，包括将上述多肽与一种生理可接受的载体物质混和。
本发明将由下面的说明性实施例并参考附图来描述，其中：
图1给出密切相关的酪氨酸激酶受体(flt，fms和kit，“kit”是KDR的另一名称)的氨基酸多重排列。
图2给出琼脂糖凝胶电泳的典型结果，表明在许多组织样本中均存在交替拼接的flt编码序列。
图3给出编码全长VEGF受体(FLT和相关受体KDR)的序列3′区的核苷酸序列，以及编码本发明的多肽的两段序列FLT4和FLT15。
图4是野生型与突变体FLT分子的图例表示。
图5给出本发明的两段多肽的C末端氨基酸序列。
实施例
在来源于人类类滋养层(trophoblast-like)、卵巢癌和子宫内膜癌的细胞系中研究VEGF受体FLT的表达。所用类滋养层(绒膜癌)细胞系为BeWo(从美国典型培养物保藏中心，Rockville MD，USA得到)。子宫内膜癌细胞系为Ishikawa(从M.Nishide教授，日本Tsukuba大学得到)和HECl-A和HECl-B(从ATCC USA得到)。卵巢癌细胞系是7、17R、25、25R和35。它们都是上皮来源的，并在培养物中建立了10-30代。细胞系17R和25R在化疗及复发后得到(细胞系25R与细胞系25来源于同一患者)。
根据ATCC的建议，BeWo细胞系在Ham′s F12中生长。子宫内膜癌细胞系在McCoy′s培养基中生长(ICN流动实验室，Irvine UK)。并加10％胎牛血清(ICN Flow)、2mM L-谷氨酰胺(ICN Flow)和50U/ml及50mg/ml的青霉素/链霉素(ICN Flow)。
发明人决定用PCT和原位杂交研究FLT在这些细胞系和正常组织中的表达。因此有必要构建适合的寡聚核苷酸引物和探针。
为帮助设计合适的引物，用计算机程序“pileup”构建了密切相关的酪氨酸激酶受体(FLT，FMS和KIT)的蛋白质多重排列(图1)。这显示出该受体家族中的彼此不同的序列区域。图1中被选来设计引物的区域下划双线。然后根据这些蛋白质序列合成下列成套的PCR引物：
A)5′GCAAGGTGTGACTTTTGTTC3′
B)5′GCGCTCGAGAGCATCACTCAG3′
C)5′GCGCGGCCGCAGTAAAATCCA3′
D)5′AGGATTTCTTCCCCTGTGTA3′
这些寡聚核苷酸的下划线部分是与flt cDNA序列杂交的区域。还加入其它核苷酸以帮助定向克隆。所用循环为：第一轮用引物A和D[95℃30秒，55℃30秒，72℃30秒]×25；第二轮用引物B和C：[95℃30秒，44℃30秒，72℃30秒]×2[95℃30秒，65℃30秒，72℃30秒]×25。内部引物B和C在其5′端分别有限制性内切酶XhoI和EagI的酶切位点以允许产物的定向克隆。
已发现某些组织的PCR扩增产物比全长FLT cDNA产物明显要大(用琼脂糖凝胶电泳判定)。典型结果由图2给出。
用成套引物A-D得到的PCR产物走胶。泳道1-3是从标为17，17R和25R的卵巢癌的初级组织样本得到的产物。泳道4到7是从由卵巢癌7，17R，25和25R建立的细胞系得到的产物，泳道8到10分别是细胞系HECl-A，HECl-B和Ishikawa，泳道11含有HUVECs的产物。
标准大小带与预期相同(285bp左右)，与发表的flt序列(Shibuya等，1990，癌基因，5，519-524)的3′端相同。然而可清楚看出除了全长fltcDNA PCR扩增产物，在泳道2(17R，初级组织)和泳道4(7，细胞系)有约360bp的大带，在泳道5(17R，细胞系)也能看到同样大小的浅带，不过凝胶照片复制后看不清。用已知技术从凝胶中提取这些大带，亚克隆到质粒载体pBluescript II KS中，然后用双脱氧核苷酸测序法(Sanger等1977PNAS 71，5463-5467)进行序列分析。
5个独立克隆的测序(Boocock等，1995，国家癌症协会杂志87.506-516)表明每个克隆在发表的flt序列中的两个引物之间区域含有1或2个新的插入序列。这些克隆中的3个(命名为FLT5，FLT15和FLT16)在大约位置1555处含有一段85bp的插入序列，而另2个克隆(FLT13和FLT14)在约位置1665含有一段65bp的插入序列(见图3，编号基于Shibuya等，1990，引文同上)。这些插入序列造成PCR产物带变大。然而，两种插入序列都含有阅读框架内终止密码子，所以相应的全长RNA能编码可溶性的截短的受体变异体，该变异体含有细胞外区域的头5个类免疫球蛋白结构域，到氨基酸517或553，以及C末端不相关的24个或14个氨基酸(其中13个是附加的)。
尽管这些变异体flt克隆来源于只编码氨基酸503以上的部分cDNA，利用每个新插入序列的特异性引物和正好与起始ATG5′结合的引物，仍能够从来自HUVEC细胞、人类绒膜和卵巢癌细胞系7的cDNA扩增出大小与按相应的全长cDNA的预计相同的PCR产物。
图4是不同FLT受体分子的图例表示。在顶部，(a)显示野生型全长FLT受体分子，(b)表示Kendall和Thomas描述的截短形式，(c)表示FLT4编码的多肽，(d)表示FLT15编码的多肽。右边的数字表示分子中的氨基酸数目，框中数字代表存在于sFLT变异体中但不在野生型分子中的氨基酸的数目。
图5给出可能被“全长”FLT4和FLT15克隆(即含有用来生成真实克隆的所有引物位点5′端核苷酸序列的克隆)编码的多肽的预测的C末端氨基酸序列。FLT4克隆的最后14个氨基酸，以及FLT15克隆的最后24个氨基酸与野生型FLT序列不同。