一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用.pdf

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摘要
申请专利号:

CN201210044845.1

申请日:

2012.02.24

公开号:

CN102603877A

公开日:

2012.07.25

当前法律状态:

授权

有效性:

有权

法律详情:

授权|||实质审查的生效IPC(主分类):C07K 14/415申请日:20120224|||公开

IPC分类号:

C07K14/415; C12N15/29; C12N15/63; C12N5/10; C12N1/21; C12N15/09; C12N15/82; A01H5/00

主分类号:

C07K14/415

申请人:

合肥工业大学

发明人:

江力; 慈凌坤; 曹树青; 卢云峰

地址:

230009 安徽省合肥市屯溪路193号

优先权:

专利代理机构:

安徽省合肥新安专利代理有限责任公司 34101

代理人:

何梅生

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内容摘要

本发明公开了一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因与应用。植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白是序列表中SEQ?ID?No:2,其编码基因是序列表中SEQ?ID?No:1?DNA序列。本发明所提供的增强植物耐硒及增加植物中硒含量的方法,是抑制植物中的上述植物耐硒及增加植物中硒含量相关蛋白编码基因的表达。为农作物耐硒育种提供基因与技术支持。

权利要求书

1.一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白,其特征在于:氨基酸残基序列如序列表中SEQ ID No:2所示或是将SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No:2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No:2衍生的氨基酸残基序列。2.权利要求1所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因,其特征在于:选自下列核苷酸之一:(1)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列;(2)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白质序列的多核苷酸;(3)在高严谨条件下与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列;(4)与SEQ ID No:1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能蛋白质的DNA序列。3.根据权利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因,其特征在于,所述基因序列的开放阅读框架为SEQ ID No:2自5’端第446位至1876位碱基。4.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的载体。5.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的转基因细胞系。6.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的宿主菌。7.一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法,其特征在于:是抑制植物中如权利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达。8.根据权利要求7所述的一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法,其特征在于:抑制植物中耐硒相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的方法,或者反义核酸技术沉默基因的方法,或者siRNA介导的基因沉默方法。9.权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因在增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的应用。

说明书

一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物工程领域中一个植物耐硒相关基因及其编码蛋白与应用和利用该基因
增强植物耐硒的方法。

背景技术

硒是环境中一种重要的生命元素,是人体必需的微量元素,对机体发挥着极其重要的作
用。然而一方面硒在地壳中的含量相当稀少和分散,硒缺乏在全世界是一种很普遍的现象,
另一方面硒污染在某些地区也同时存在着。硒污染的产生主要与人类的生产活动有关,它可
以从一些矿业、农业、石化产品和工业制造业所产生的废弃原料中释放出来,从而在土壤、
水体中富集形成污染。植物、动物吸收了土壤或水体中过量的硒就会产生毒害作用,在植物、
动物体内形成富集,并最终通过食物链对人体产生毒害作用。因此,硒的缺乏和过剩都与人
的生命活动休戚相关,深入探讨植物对硒耐受性机制具有重要理论意义和实践价值。利用先
进的分子生物学手段分离耐硒的抗性基因,再利用转基因技术培育出更多的耐硒植物是未来
的发展趋势。其潜在的应用价值一方面是通过在农作物中表达硒代谢关键基因来调节农产品
含硒水平,满足人类健康摄硒的需要;另一方面利用转基因技术实现通过植物治理环境硒污
染的目标。

拟南芥是一种模式植物,广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域。
拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到,有关拟南芥的任何发现都能应用于其它植物研
究。因此,对拟南芥耐硒的分子生物学机制的研究对提高植物的耐硒能力具有重要的理论
与经济意义。拟南芥基因组已完全测序,根据拟南芥测序数据库寻找和发现新的具有自主知
识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一。利用突变技术研究基因功能已成为一
种有效的方法,通过对突变体的研究,发现了一些耐硒基因的功能,如AtGPX,AtHMT,
APS等,这些基因在突变体和野生型中的转录水平不一样。

目前定位出的耐硒基因还非常有限,我们从化学诱导型激活标签子系统构建的拟南芥突
变体库中筛选到功能获得性耐硒及增加硒吸收的突变体vse1,克隆获得具有耐硒功能的基因
VSE1,基因转录水平分析显示,在硒盐胁迫条件下,其转录水平提高。为此,我们研究了
该基因功能,并在分子生物学水平上阐明了该基因耐硒胁迫的机理。

发明内容

本发明的目的是提供一种新的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基因,本发
明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因VSE1,来源于哥伦比亚野生型
的拟南芥(Col-0),其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质,氨基酸残基序列如序列
表中SEQ ID No:2所示或是将SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基
的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No:2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No:
2衍生的氨基酸残基序列。

序列表中的序列2由250个氨基酸残基组成。

所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基酸残基的取
代和/或缺失和/或添加。

VSE1的编码基因也属于本发明的保护范围。

VSE1的cDNA基因,选自下述核甘酸序列之一;

(1)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列;

(2)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白质序列的多核苷酸;

(3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核甘酸序列;

(4)与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有90%以上同源性、且编码相同功能
蛋白质的DNA序列。

序列表中的序列1由1269个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5’端第446位至1876
位碱基,编码序列SEQ ID No:2的蛋白质。

含有本发明VSE1的表达载体,细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增VSE1中
任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量
的方法。

本发明所提供的增强植物对硒耐受性及增加硒含量的方法,是抑制植物耐硒及增加植物
硒含量相关蛋白编码基因的表达,该表达可通过多种方法实现。本发明抑制基因表达的方法
并不限于上述几种方法,只要能抑制VSE1表达即可。

利用任何一种植物基因敲除技术,将此基因敲除后,植物表现为耐硒性状;利用任何一
种可以引导外源基因在植物中表达的载体,将本发明所提供的VSE1转入野生型植物中,植
物就表现出对硒非耐受。

本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中筛选并通
过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1,用经典的CTAB法提取vse1基因组
DNA,再通过Tail-PCR获得耐硒基因VSE1,后经上海生工生物工程有限公司测序鉴定并在
TAIR数据库中进行序列比对,最后进行基因定位,获得一个新的耐硒基因。构建了VSE1基
因的过量表达载体,并导入根癌农杆菌C58菌株中,用花絮浸渍法进行拟南芥植株的遗传转
化,并用抗生素筛选转化株,以期观察该转基因植株在硒胁迫下的表型,并研究其功能。

本发明的VSE1基因在构建到植物表达载体中时,在其转录起始核苷酸前可加上任何一
种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选,可对所
使用的载体进行加工,如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或具有抗性
的抗生素标记物(庆大霉素,卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶植物,也可
以是双子叶植物。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直接以植物耐
硒症状来筛选转化植株。携带有本发明VSE1基因的表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、
植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植
物细胞或组织,并将转化的植物经组织培育成植株。

本发明的植物耐硒相关基因为农作物耐硒育种提供基因与技术的支持。

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。

附图说明

图1是本发明以40mg/LNa2SeO3作为筛选的临界浓度,获得耐硒突变体vse1

图2是本发明突变体vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较

图3是本发明突变vse1在不同Na2SeO3浓度下发芽率比较

图4是本发明突变体vse1和野生型植株对硒盐耐受性比较

图5是本发明vse1和野生型主根长、鲜重、蛋白质、GSH-Px、APX、硒含量等比较

图6是本发明vse1突变体在硒盐胁迫下相关基因的表达

图7是本发明T-DNA插入位点图谱分析

图8是本发明VSE1基因基因表达模式分析

具体实施方式

下述实施例中的实验方法如无特别说明,均为常规方法。

实施例1、VSE1基因的获得

利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中通过对野生型和
突变体拟南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na2SeO3浓度梯度选择培养基中进行培养,
在40mg/L Na2SeO3浓度下,WT完全不能存活而突变体有三株能够生长,得到疑似耐硒突变
体,并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1,用经典的CTAB法提取
vse1基因组DNA,以提取出来的DNA为模板,进行如下Tail-PCR反应:20μl反应体
系,内含10×PCR缓冲液、dNTPs(2.5mM)混合物、巢式引物(2μM)和随机引物
(50μM)、Taq酶(5U/μl),其余加双蒸水至20μl。其中,巢式引物1:LexA2、LexA3、
LexA4、LexA5、LexA6以及随机引物2:AD1、AD2、AD3、AD4见表一。

Tail-PCR所用的引物序列


将获得的PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的DNA片段连接于
pGEM-T载体,得到含有目的片段的载体pT-VSE1,进行测序鉴定,结果表明PCR得
到的DNA片段具有序列表中序列SEQ ID No:1的DNA序列,为VSE1的DNA基
因,由2106个碱基组成,其编码序列为自5’端第446位碱基到第1876位碱基,编码具有
序列表中序列SEQ ID No:2的氨基酸残基序列的蛋白质。

实施例2、培育对硒耐受性增强的拟南芥

1、耐硒突变体vse1的获得

设定20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na2SeO3浓度梯度进行耐硒突变体筛选实验,发
现在40mg/L Na2SeO3浓度下野生型全部不能生长,而突变体有三株长势很好(图1),将其
土培移栽后只有一株存活,命名为耐硒突变体vse1。

2、vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较

正常光照条件下突变体vse1和WT(野生型植株,下同)生长发育,如图2所示,发
现在正常土培培养条件下突变体vse1与WT的形态没有显著差别,表明VSE1基因功能
缺失突变对植株生长发育没有产生显著影响。

2、vse1在不同Na2SeO3浓度下发芽率比较

将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和
Na2SeO3半固体培养基),4℃春化3天后,置于22℃恒温光照下(光周期为16小时光照,8
小时黑暗)培养,14天后观察结果。从图3中我们可以看出在30mg/L Na2SeO3和40mg/L
Na2SeO3条件下突变体vse1的发芽率和野生型无明显差异,而在50mg/L Na2SeO3胁迫条件下
突变体vse1的发芽率明显高于野生型。

3、突变体vse1与野生型植株对硒耐受性比较

将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和
Na2SeO3半固体培养基),4℃春化3天后,置于22℃恒温光照下(光周期为16小时光照,8
小时黑暗)培养,21天后观察结果。从图4的结果我们可以看出,相对于野生型来说,突变
体vse1表现出了对硒耐受性的性状。硒胁迫条件下突变体vse1的根长明显高于野生型,如图
5-A所示。鲜重测定结果也显示,在Na2SeO3培养条件下,突变体vse1的鲜重明显高于野生型,
如图5-B所示。上述结果表明了vse1耐硒能力比野生型强。

4、vse1和野生型蛋白质含量比较

蛋白质的积累是植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步从生理上说明上述
现象,测定了在正常和硒盐胁迫条件下vse1和WT植株体内蛋白质含量,如图5-C所示。
在正常生长条件下,vse1和WT植株体内蛋白质积累没有显著差异。相比之下,在硒
胁迫条件下,vse1和WT植株体内蛋白质积累显著增加,但突变体vse1比WT积累得更
多,进一步说明vse1突变体较WT对硒胁迫更加耐受。这些结果表明,VSE1基因参与
拟南芥对硒胁迫响应的调控。

5、vse1和野生型GSH-Px、APX活性比较

硒胁迫还会使植物体内产生大量活性氧自由基,ROS水平上升,对植物体造成严重的伤
害,植物通过抗氧化系统的一系列的防御机制清除活性氧保护自身。抗氧化防御作用可通过
GSH-Px、APX等抗氧化酶来清除活性氧,又硒是GSH-Px的活性中心,GSH-Px活性大小是
植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内
GSH-Px、APX等抗氧化酶活性有关,测定了在正常生长和硒胁迫条件下vse1和WT植株
体内GSH-Px、APX等抗氧化酶活性。在正常生长条件下,vse1和WT植株体内GSH-Px活
性没有显著差异,然而在硒胁迫条件下,vse1体内GSH-Px活性明显比WT高,如图5-D
所示,说明vse1对硒胁迫的耐受可能是由于相关抗氧化酶的活性升高所致。

6、vse1和野生型硒含量比较

为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内硒含量有关,测定了在正常生长和硒
胁迫条件下vse1和WT植株叶和根部硒含量。在正常生长条件下,vse1和WT植株的
根部和叶部积累的硒没有显著差异。然而在硒胁迫条件下,vse1的叶部积累的硒与
WT相比差异不显著(图5-F),而根部差异极显著(图5-G),说明在硒胁迫时,突
变体vse1较WT更好地在体内转化硒,以致突变体植株受到较小的伤害,这与表型
上的结果一致。

7、vse1突变体在硒胁迫下相关基因的表达变化

植物对硒胁迫条件的适应会涉及很多种基因,其中有许多基因对植物有效地吸收
和利用硒具有专一性,另外一些则涉及多种硒胁迫基因表达的调控。为进一步说明突
变体vse1对硒胁迫耐受的可能分子机理,采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下硒诱
导4个相关基因的表达(图6)。植物体内的AtGPX可能是多基因家族成员,它们可能在不
同的胁迫环境下调控不同的发育途径和防御反应。研究结果表明,不同的环境胁迫下,表达
AtGPX的mRNA水平稳步提高,因此AtGPX在植物氧化信号转导过程中可能起着重要作
用。从图6可以看出,它在硒诱导下的WT中转录水平很低,而在突变体中转录水平非
常高;AtHMT能够减少硒代高半胱氨酸在细胞内的浓度,这些氨基酸掺入到蛋白质后可以
对植物蛋白的结构、肽键状态产生影响并导致蛋白功能的损害,如果硒被转化为非蛋白硒代
氨基酸,就可以减少硒的掺入。从图6可以看出,它在硒诱导下的WT和vse1中转录水平
无明显差异。这些结果进一步说明突变体vse1较WT更加对硒胁迫耐受。

8.T-DNA插入位点图谱分析

VSE1基因测序结果在NCBI数据库Blast后结果显示,T-DNA插入了AT1G07890基因的起
始密码子ATG下游第二个内含子处(图7).

9.VSE1基因基因表达模式分析

为了证明VSE1基因在突变体中被敲除,采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下VSE1
基因。从图8中可以看出VSE1基因在野生型中正常表达,而在突变体中几乎不表达,表明vse1
为基因敲除型突变体。



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1、(10)申请公布号 CN 102603877 A (43)申请公布日 2012.07.25 C N 1 0 2 6 0 3 8 7 7 A *CN102603877A* (21)申请号 201210044845.1 (22)申请日 2012.02.24 C07K 14/415(2006.01) C12N 15/29(2006.01) C12N 15/63(2006.01) C12N 5/10(2006.01) C12N 1/21(2006.01) C12N 15/09(2006.01) C12N 15/82(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人合肥工业大学 地。

2、址 230009 安徽省合肥市屯溪路193号 (72)发明人江力 慈凌坤 曹树青 卢云峰 (74)专利代理机构安徽省合肥新安专利代理有 限责任公司 34101 代理人何梅生 (54) 发明名称 一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用 (57) 摘要 本发明公开了一种植物耐硒及增加植物硒吸 收相关蛋白及其编码基因与应用。植物耐硒及增 加植物硒吸收相关蛋白是序列表中SEQ ID No:2, 其编码基因是序列表中SEQ ID No:1 DNA序列。 本发明所提供的增强植物耐硒及增加植物中硒含 量的方法,是抑制植物中的上述植物耐硒及增加 植物中硒含量相关蛋白编码基因的表达。为农作 物耐硒育种提供基因与技术。

3、支持。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 序列表2页 附图6页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 2 页 附图 6 页 1/1页 2 1.一种植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白,其特征在于:氨基酸残基序列如序列表 中SEQ ID No:2所示或是将SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基 的取代和/或缺失和/或添加且与SEQ ID No:2限定的蛋白质具有相同活性的由SEQ ID No:2衍生的氨基酸残基序列。 2.权利要求1所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因,其特征在于:。

4、 选自下列核苷酸之一: (1)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列; (2)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白质序列的多核苷酸; (3)在高严谨条件下与SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列; (4)与SEQ ID No:1限定的DNA序列具有90以上同源性、且编码相同功能蛋白质的 DNA序列。 3.根据权利要求2所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因,其特征在 于,所述基因序列的开放阅读框架为SEQ ID No:2自5端第446位至1876位碱基。 4.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的 载体。 5.含有权利要求2或3。

5、所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的 转基因细胞系。 6.含有权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因序列的 宿主菌。 7.一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法,其特征在于:是抑制植物中 如权利要求2所述的耐硒及增加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达。 8.根据权利要求7所述的一种增强植物对硒耐受性及增加植物中硒含量的方法,其特 征在于:抑制植物中耐硒相关蛋白编码基因表达的方法包括植物病毒载体介导基因沉默的 方法,或者反义核酸技术沉默基因的方法,或者siRNA介导的基因沉默方法。 9.权利要求2或3所述的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因。

6、在增强植物 对硒耐受性及增加植物中硒含量的应用。 权 利 要 求 书CN 102603877 A 1/5页 3 一种植物耐硒蛋白及其编码基因与应用 技术领域 0001 本发明涉及生物工程领域中一个植物耐硒相关基因及其编码蛋白与应用和利用 该基因增强植物耐硒的方法。 背景技术 0002 硒是环境中一种重要的生命元素,是人体必需的微量元素,对机体发挥着极其重 要的作用。然而一方面硒在地壳中的含量相当稀少和分散,硒缺乏在全世界是一种很普遍 的现象,另一方面硒污染在某些地区也同时存在着。硒污染的产生主要与人类的生产活动 有关,它可以从一些矿业、农业、石化产品和工业制造业所产生的废弃原料中释放出来,从 。

7、而在土壤、水体中富集形成污染。植物、动物吸收了土壤或水体中过量的硒就会产生毒害作 用,在植物、动物体内形成富集,并最终通过食物链对人体产生毒害作用。因此,硒的缺乏和 过剩都与人的生命活动休戚相关,深入探讨植物对硒耐受性机制具有重要理论意义和实践 价值。利用先进的分子生物学手段分离耐硒的抗性基因,再利用转基因技术培育出更多的 耐硒植物是未来的发展趋势。其潜在的应用价值一方面是通过在农作物中表达硒代谢关键 基因来调节农产品含硒水平,满足人类健康摄硒的需要;另一方面利用转基因技术实现通 过植物治理环境硒污染的目标。 0003 拟南芥是一种模式植物,广泛用于植物遗传学、发育生物学和分子生物学等研究 领。

8、域。拟南芥的大多数基因在其它植物中都能找到,有关拟南芥的任何发现都能应用于其 它植物研究。因此,对拟南芥耐硒的分子生物学机制的研究对提高植物的耐硒能力具有重 要的理论与经济意义。拟南芥基因组已完全测序,根据拟南芥测序数据库寻找和发现新的 具有自主知识产权的功能基因是国际植物学研究领域的热点之一。利用突变技术研究基因 功能已成为一种有效的方法,通过对突变体的研究,发现了一些耐硒基因的功能,如AtGPX, AtHMT,APS等,这些基因在突变体和野生型中的转录水平不一样。 0004 目前定位出的耐硒基因还非常有限,我们从化学诱导型激活标签子系统构建的拟 南芥突变体库中筛选到功能获得性耐硒及增加硒吸。

9、收的突变体vse1,克隆获得具有耐硒功 能的基因VSE1,基因转录水平分析显示,在硒盐胁迫条件下,其转录水平提高。为此,我们研 究了该基因功能,并在分子生物学水平上阐明了该基因耐硒胁迫的机理。 发明内容 0005 本发明的目的是提供一种新的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白及其编码基 因,本发明所提供的植物耐硒及增加植物硒吸收相关蛋白的编码基因VSE1,来源于哥伦比 亚野生型的拟南芥(Col-0),其蛋白是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质,氨基酸残基 序列如序列表中SEQ ID No:2所示或是将SEQ ID No:2的氨基酸残基序列经过一个或几个 氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与SE。

10、Q ID No:2限定的蛋白质具有相同活性的 由SEQ ID No:2衍生的氨基酸残基序列。 0006 序列表中的序列2由250个氨基酸残基组成。 说 明 书CN 102603877 A 2/5页 4 0007 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不超过10个氨基 酸残基的取代和/或缺失和/或添加。 0008 VSE1的编码基因也属于本发明的保护范围。 0009 VSE1的cDNA基因,选自下述核甘酸序列之一; 0010 (1)序列表中SEQ ID No:1的DNA序列; 0011 (2)编码序列表中SEQ ID No:2蛋白质序列的多核苷酸; 0012 (3)在高严谨条件下。

11、可与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列杂交的核甘酸序 列; 0013 (4)与序列表中SEQ ID No:1限定的DNA序列具有90以上同源性、且编码相同 功能蛋白质的DNA序列。 0014 序列表中的序列1由1269个碱基组成,其开放阅读框架(ORF)为自5端第446 位至1876位碱基,编码序列SEQ ID No:2的蛋白质。 0015 含有本发明VSE1的表达载体,细胞系和宿主菌均属于本发明的保护范围。扩增 VSE1中任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。 0016 本发明的第二个目的是提供一种利用该基因增强植物对硒耐受性及增加植物中 硒含量的方法。 0017 本发明所提供。

12、的增强植物对硒耐受性及增加硒含量的方法,是抑制植物耐硒及增 加植物硒含量相关蛋白编码基因的表达,该表达可通过多种方法实现。本发明抑制基因表 达的方法并不限于上述几种方法,只要能抑制VSE1表达即可。 0018 利用任何一种植物基因敲除技术,将此基因敲除后,植物表现为耐硒性状;利用任 何一种可以引导外源基因在植物中表达的载体,将本发明所提供的VSE1转入野生型植物 中,植物就表现出对硒非耐受。 0019 本发明利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中筛 选并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1,用经典的CTAB法提取 vse1基因组DNA,再通过Tail-P。

13、CR获得耐硒基因VSE1,后经上海生工生物工程有限公司测 序鉴定并在TAIR数据库中进行序列比对,最后进行基因定位,获得一个新的耐硒基因。构 建了VSE1基因的过量表达载体,并导入根癌农杆菌C58菌株中,用花絮浸渍法进行拟南芥 植株的遗传转化,并用抗生素筛选转化株,以期观察该转基因植株在硒胁迫下的表型,并研 究其功能。 0020 本发明的VSE1基因在构建到植物表达载体中时,在其转录起始核苷酸前可加上 任何一种增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛 选,可对所使用的载体进行加工,如加入植物可选择性标记(GUS基因、萤光素酶基因等)或 具有抗性的抗生素标记物(庆大霉。

14、素,卡那霉素等)。被转化的植物宿主既可以是单子叶 植物,也可以是双子叶植物。从转基因植物的安全性考虑,可不加任何选择性标记基因,直 接以植物耐硒症状来筛选转化植株。携带有本发明VSE1基因的表达载体可通过使用Ti质 粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法 转化植物细胞或组织,并将转化的植物经组织培育成植株。 0021 本发明的植物耐硒相关基因为农作物耐硒育种提供基因与技术的支持。 0022 下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明。 说 明 书CN 102603877 A 3/5页 5 附图说明 0023 图1是本发明以40mg/LNa 2。

15、 SeO 3 作为筛选的临界浓度,获得耐硒突变体vse1 0024 图2是本发明突变体vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较 0025 图3是本发明突变vse1在不同Na 2 SeO 3 浓度下发芽率比较 0026 图4是本发明突变体vse1和野生型植株对硒盐耐受性比较 0027 图5是本发明vse1和野生型主根长、鲜重、蛋白质、GSH-Px、APX、硒含量等比较 0028 图6是本发明vse1突变体在硒盐胁迫下相关基因的表达 0029 图7是本发明T-DNA插入位点图谱分析 0030 图8是本发明VSE1基因基因表达模式分析 具体实施方式 0031 下述实施例中的实验方法如无特别说明,。

16、均为常规方法。 0032 实施例1、VSE1基因的获得 0033 利用正向遗传学手段从化学诱导型激活标签子系统构建的突变体库中通过对野 生型和突变体拟南芥在20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na 2 SeO 3 浓度梯度选择培养基中进行 培养,在40mg/L Na 2 SeO 3 浓度下,WT完全不能存活而突变体有三株能够生长,得到疑似耐硒 突变体,并通过表型和生理生化鉴定得到功能获得型耐硒突变体vse1,用经典的CTAB法提 取vse1基因组DNA,以提取出来的DNA为模板,进行如下Tail-PCR反应:20l反应体系, 内含10PCR缓冲液、dNTPs(2.5mM)混合物、巢式引。

17、物(2M)和随机引物(50M)、Taq酶 (5U/l),其余加双蒸水至20l。其中,巢式引物1:LexA2、LexA3、LexA4、LexA5、LexA6以 及随机引物2:AD1、AD2、AD3、AD4见表一。 0034 Tail-PCR所用的引物序列 0035 0036 将获得的PCR产物进行1琼脂糖凝胶电泳。将PCR得到的DNA片段连接于pGEM-T 载体,得到含有目的片段的载体pT-VSE1,进行测序鉴定,结果表明PCR得到的DNA片段具有 序列表中序列SEQ ID No:1的DNA序列,为VSE1的DNA基因,由2106个碱基组成,其编码 序列为自5端第446位碱基到第1876位碱基,。

18、编码具有序列表中序列SEQ ID No:2的氨 基酸残基序列的蛋白质。 说 明 书CN 102603877 A 4/5页 6 0037 实施例2、培育对硒耐受性增强的拟南芥 0038 1、耐硒突变体vse1的获得 0039 设定20mg/L、30mg/L和40mg/L三个Na 2 SeO 3 浓度梯度进行耐硒突变体筛选实验, 发现在40mg/L Na 2 SeO 3 浓度下野生型全部不能生长,而突变体有三株长势很好(图1),将 其土培移栽后只有一株存活,命名为耐硒突变体vse1。 0040 2、vse1和野生型植株在土培条件下生长状况比较 0041 正常光照条件下突变体vse1和WT(野生型植。

19、株,下同)生长发育,如图2所示,发 现在正常土培培养条件下突变体vse1与WT的形态没有显著差别,表明VSE1基因功能缺失 突变对植株生长发育没有产生显著影响。 0042 2、vse1在不同Na 2 SeO 3 浓度下发芽率比较 0043 将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS 和Na 2 SeO 3 半固体培养基),4春化3天后,置于22恒温光照下(光周期为16小时光照, 8小时黑暗)培养,14天后观察结果。从图3中我们可以看出在30mg/L Na 2 SeO 3 和40mg/ LNa 2 SeO 3 条件下突变体vse1的发芽率和野生型无明显差异,而在。

20、50mg/L Na 2 SeO 3 胁迫条件 下突变体vse1的发芽率明显高于野生型。 0044 3、突变体vse1与野生型植株对硒耐受性比较 0045 将野生型与突变体vse1同时播种于直径为90mm的平皿中(平皿中分别加有MS和 Na 2 SeO 3 半固体培养基),4春化3天后,置于22恒温光照下(光周期为16小时光照,8 小时黑暗)培养,21天后观察结果。从图4的结果我们可以看出,相对于野生型来说,突变 体vse1表现出了对硒耐受性的性状。硒胁迫条件下突变体vse1的根长明显高于野生型, 如图5-A所示。鲜重测定结果也显示,在Na 2 SeO 3 培养条件下,突变体vse1的鲜重明显高。

21、于 野生型,如图5-B所示。上述结果表明了vse1耐硒能力比野生型强。 0046 4、vse1和野生型蛋白质含量比较 0047 蛋白质的积累是植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步从生理上说明上述 现象,测定了在正常和硒盐胁迫条件下vse1和WT植株体内蛋白质含量,如图5-C所示。在 正常生长条件下,vse1和WT植株体内蛋白质积累没有显著差异。相比之下,在硒胁迫条件 下,vse1和WT植株体内蛋白质积累显著增加,但突变体vse1比WT积累得更多,进一步说 明vse1突变体较WT对硒胁迫更加耐受。这些结果表明,VSE1基因参与拟南芥对硒胁迫响 应的调控。 0048 5、vse1和野生型GSH。

22、-Px、APX活性比较 0049 硒胁迫还会使植物体内产生大量活性氧自由基,ROS水平上升,对植物体造成严重 的伤害,植物通过抗氧化系统的一系列的防御机制清除活性氧保护自身。抗氧化防御作用 可通过GSH-Px、APX等抗氧化酶来清除活性氧,又硒是GSH-Px的活性中心,GSH-Px活性大小 是植物对硒胁迫响应的一个重要指标。为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内GSH-Px、 APX等抗氧化酶活性有关,测定了在正常生长和硒胁迫条件下vse1和WT植株体内GSH-Px、 APX等抗氧化酶活性。在正常生长条件下,vse1和WT植株体内GSH-Px活性没有显著差异, 然而在硒胁迫条件下,vse1体。

23、内GSH-Px活性明显比WT高,如图5-D所示,说明vse1对硒 胁迫的耐受可能是由于相关抗氧化酶的活性升高所致。 0050 6、vse1和野生型硒含量比较 说 明 书CN 102603877 A 5/5页 7 0051 为进一步确定vse1耐硒胁迫是否与其体内硒含量有关,测定了在正常生长和硒 胁迫条件下vse1和WT植株叶和根部硒含量。在正常生长条件下,vse1和WT植株的根部 和叶部积累的硒没有显著差异。然而在硒胁迫条件下,vse1的叶部积累的硒与WT相比差 异不显著(图5-F),而根部差异极显著(图5-G),说明在硒胁迫时,突变体vse1较WT更好 地在体内转化硒,以致突变体植株受到较小。

24、的伤害,这与表型上的结果一致。 0052 7、vse1突变体在硒胁迫下相关基因的表达变化 0053 植物对硒胁迫条件的适应会涉及很多种基因,其中有许多基因对植物有效地吸收 和利用硒具有专一性,另外一些则涉及多种硒胁迫基因表达的调控。为进一步说明突变体 vse1对硒胁迫耐受的可能分子机理,采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下硒诱导4个 相关基因的表达(图6)。植物体内的AtGPX可能是多基因家族成员,它们可能在不同的胁 迫环境下调控不同的发育途径和防御反应。研究结果表明,不同的环境胁迫下,表达AtGPX 的mRNA水平稳步提高,因此AtGPX在植物氧化信号转导过程中可能起着重要作用。从图 6。

25、可以看出,它在硒诱导下的WT中转录水平很低,而在突变体中转录水平非常高;AtHMT能 够减少硒代高半胱氨酸在细胞内的浓度,这些氨基酸掺入到蛋白质后可以对植物蛋白的结 构、肽键状态产生影响并导致蛋白功能的损害,如果硒被转化为非蛋白硒代氨基酸,就可以 减少硒的掺入。从图6可以看出,它在硒诱导下的WT和vse1中转录水平无明显差异。这 些结果进一步说明突变体vse1较WT更加对硒胁迫耐受。 0054 8.T-DNA插入位点图谱分析 0055 VSE1基因测序结果在NCBI数据库Blast后结果显示,T-DNA插入了AT1G07890基 因的起始密码子ATG下游第二个内含子处(图7). 0056 9.。

26、VSE1基因基因表达模式分析 0057 为了证明VSE1基因在突变体中被敲除,采用RT-PCR的方法检测了硒胁迫条件下 VSE1基因。从图8中可以看出VSE1基因在野生型中正常表达,而在突变体中几乎不表达, 表明vse1为基因敲除型突变体。 说 明 书CN 102603877 A 1/2页 8 0001 序 列 表CN 102603877 A 2/2页 9 0002 序 列 表CN 102603877 A 1/6页 10 图1 图2 图3 说 明 书 附 图CN 102603877 A 10 2/6页 11 图4 图5-A 说 明 书 附 图CN 102603877 A 11 3/6页 12 图5-B 图5-C 说 明 书 附 图CN 102603877 A 12 4/6页 13 图5-D 图5-E 说 明 书 附 图CN 102603877 A 13 5/6页 14 图5-F 图5-G 说 明 书 附 图CN 102603877 A 14 6/6页 15 图6 图7 图8 说 明 书 附 图CN 102603877 A 15 。

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