具有长中空件的电穿孔装置.pdf

一种电穿孔装置，包括长的中空件，以便在电穿孔过程中提供均匀的电场，其中特别是，执行电穿孔是通过在中空件充满包括细胞和将要注入细胞的物质的流体样本之后，由一对电极从长的中空件两个末端施加电脉冲。

1.  一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件；贮存器，所述贮存器连接成与样本填充件的一个末端流体连通；以及压力保持装置，所述压力保持装置通过具有电极插入部分的接头连接到中空样本填充件的另一末端以形成流体连通，
所述贮存器具有接触样本或电解液的电极，样本填充件通过压力保持装置充满样本，填充在贮存器中的样本或电解液连接到样本填充件末端形成流体连通，并且将一个电脉冲或多个电脉冲施加到与填充在贮存器中的样本或电解液接触的一个电极以及插入到接头的电极插入部分的另一个电极上，从而将样本填充件中填充的样本中的细胞实施电穿孔。

2.  根据权利要求1所述的系统，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

3.  根据权利要求1或2所述的系统，其中，所述中空样本填充件是毛细管、管或通道。

4.  根据权利要求1或2所述的系统，其中，并行排列有两个以上的电穿孔装置。

5.  一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件；压力保持装置，所述压力保持装置连接到中空样本填充件的一个末端形成流体连通；贮存器，其连接到样本填充件的另一个末端形成流体连通，并具有接触样本或电解液的电极；以及贮存夹持器，所述贮存夹持器装有用于固定压力保持装置的固定部分、电连接到固定部分的电极端子以及电连接到装在贮存器上的电极的电极端子，
其中，所述压力保持装置为在其部分主体上具有导电接触的移液管，并且插入置于样本填充件内的可运动电极以与活塞连通；以及
其中，中空样本填充件直接装在移液管尖端安装轴上并可以分离，可运动电极通过移液管的按钮上升或下降到样本填充件末端，以使样本填充到样本填充件或将其取回，移液管插入并固定在贮存夹持器内管，移液管主体的接触体通过贮存夹持器内管的固定部分电连接到电极端子，定位样本填充件使得与贮存器中贮存的样本或电解液流体连通，并且将一个电脉冲或多个电脉冲施加到与贮存器中贮存的样本或电解液接触的电极上，从而将填充在样本填充件中的样本中的细胞实施电穿孔。

6.  根据权利要求4所述的系统，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

7.  根据权利要求5或6所述的系统，其中，中空样本填充件是毛细管或管。

8.  根据权利要求5或6所述的系统，其中，可运动电极是表面涂覆有导电材料的塑料件。

9.  根据权利要求5或6所述的系统，其中并行排列有两个以上的电穿孔装置。

10.  一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件；在与中空样本填充件的基板相同的基板上形成的一对井，所述井连接到样本填充件的两个末端形成流体连通；以及将脉冲发生器的一个电脉冲或多个电脉冲施加到样本上的电极，以及
其中，电极插在所述井中，对所述井施加电脉冲，从而将样本填充件中的细胞实施电穿孔。

11.  根据权利要求10所述的系统，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

12.  根据权利要求10或11所述的系统，其中，中空样本填充件由一个微通道或多个微通道制成。

13.  根据权利要求10或11所述的系统，其中并行排列有两个以上的电穿孔装置。

14.  一种电穿孔系统，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该系统包括：
电穿孔装置；以及
用于产生电脉冲的脉冲发生器，
其中，所述电穿孔装置还包括：不导电材料的长中空样本填充件；一对贮存器，与样本填充件两个末端连接以形成流体连通；以及
贮存器具有与样本或电解液接触的电极，一个电脉冲或多个电脉冲被施加到与贮存器中贮存的样本或电解液接触的电极上，从而将填充在样本填充件中的样本中的细胞实施电穿孔。

15.  根据权利要求14所述的系统，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

16.  根据权利要求14或15所述的系统，其中，中空样本填充件是毛细管或管。

17.  根据权利要求14或15所述的系统，其中并行排列有两个以上的电穿孔装置。

18.  一种电穿孔装置，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该装置包括：
不导电材料的长中空样本填充件；连接到样本填充件的一个末端以形成流体连通的贮存器；以及连接到样本填充件的另一个末端以形成流体连通的压力保持装置。

19.  根据权利要求18所述的电穿孔装置，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

20.  根据权利要求18或19所述的电穿孔装置，其中，中空样本填充件是毛细管、管或通道。

21.  根据权利要求18或19所述的电穿孔装置，其中，压力保持装置通过接头连接，所述接头具有用于插入电极的电极插入部分。

22.  根据权利要求21所述的电穿孔装置，其中，电极插入所述电极插入部分以施加电脉冲，如果样本填充件中填充有样本，则电极接触该样本。

23.  根据权利要求21所述的电穿孔装置，其中，所述接头是一个圆盘，所述圆盘中形成有用于流过样本的孔，并且电极插入部分形成在圆盘的侧面。

24.  根据权利要求18或19所述的电穿孔装置，其中，压力保持装置是泵、注射器或移液管。

25.  一种电穿孔装置，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞，该装置包括：
不导电材料的长中空样本填充件；压力保持装置，其连接到中空样本填充件的一个末端以形成流体连通；贮存器，其连接到样本填充件的另一个末端以形成流体连通，并具有与样本或电解液接触的电极；以及贮存夹持器，该贮存夹持器包括用于固定压力保持装置的固定部分、电连接到固定部分的电极端子以及电连接到装在贮存器上的电极的电极端子。

26.  根据权利要求25所述的电穿孔装置，其中，压力保持装置是移液管，在其部分移液管主体上具有导电接触，并且插入可运动电极以形成与活塞的连通，并且中空样本填充件直接装在移液管尖端安装轴上并且可以与之分离。

27.  根据权利要求25或26所述的电穿孔装置，其中，中空样本填充件是毛细管或管。

28.  根据权利要求25或26所述的电穿孔装置，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在50到10000的范围内。

29.  一种电穿孔装置，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔并使外来物质进入细胞，该装置包括：
不导电材料的长中空样本填充件；以及连接在样本填充件两个末端以形成流体连通的一对贮存器。

30.  根据权利要求29所述的电穿孔装置，其中样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

31.  根据权利要求28或29所述的电穿孔装置，其中，中空样本填充件是毛细管或管。

32.  一种电穿孔装置，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔并使外来物质进入细胞，该装置包括：
不导电材料的长中空样本填充件；以及在与中空样本填充件的基板相同的基板上形成的一对井，所述井连接到样本填充件的两个末端以形成流体连通。

33.  根据权利要求32所述的电穿孔装置，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

34.  根据权利要求32或33所述的电穿孔装置，其中，中空样本填充件包括微通道。

35.  根据权利要求32或33所述的电穿孔装置，其中，中空样本填充件的两个以上的通道连接到一对井以形成流体连通。

36.  根据权利要求35所述的电穿孔装置，其中，所述通道的每个通道长度是不同的。

37.  根据权利要求35所述的电穿孔装置，其中，所述通道的每个通道宽度是不同的。

38.  根据权利要求35所述的电穿孔装置，还包括上基板和下基板，其中，上基板形成孔，所述孔中形成井，并且上基板或下基板形成有凹陷的通道。

39.  一种电穿孔方法，用于通过对包括细胞的样本施加一个电脉冲或多个电脉冲将细胞膜电穿孔并使外来物质进入细胞，其中：使长和中空的不导电材料样本填充件充满样本，并且将一个电脉冲或多个电脉冲施加到其两个末端，从而使电流流过样本。

40.  根据权利要求39所述的方法，其中，样本填充件具有的纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm²)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000的范围内。

41.  根据权利要求39或40所述的方法，其中，中空样本填充件是毛细管、管或通道。

42.  根据权利要求39或40所述的方法，其中，样本填充件中的电穿孔是连续进行的。

具有长中空件的电穿孔装置
技术领域
本发明涉及具有长中空件的电穿孔装置以及电穿孔方法，由此将一个电脉冲或多个电脉冲施加到包括细胞的样本，将细胞膜电打孔，从而使外来物质可以进入细胞。
背景技术
一般地，电穿孔是一种通过电脉冲使不能穿透细胞膜的大分子进入细胞的技术。电穿孔是直接应用于细胞试验和基因治疗的广泛使用并且强烈推荐的方法。如果施加强的电场，则细胞膜暂时变成多孔的，对外来物质表现出渗透性。
所述的电通透作用(electropermeabilization)取决于多种因素，例如脉冲宽度、脉冲持续时间、脉冲数量和其它试验条件。为了理解电穿孔的机理并加强转染效果，很多研究者对于上述参数进行了多方面的研究。据报导，电场强度对于穿透细胞膜并控制传染发生的细胞区域的范围，是起到决定性参数的作用。当然，对其它参数的研究也取得进步。但是，对细胞相对电脉冲的响应以及转染的机理知道很少。由于对电穿孔理论的缺乏和不足，清楚地看见电穿孔已经成为一项重要事情。
参看图1，为了将电场作用于细胞悬浮液和基因的混合物，通常使用装有两个平行电极板200的试管。如果对电极板200施加强电场，可以使基因进入细胞。一次性试管使用铝电极。
但是，据报导，从铝电极溶解的Al³⁺离子对细胞有不利影响。此外，如果使用铝电极，由于电极氧化层之间的电压下降会使电场强度改变。因此，优选地使用铂电极或金电极。但是，这些材料的电极很贵，因此实际上难以使用这些材料的电极作为一次或几次使用后丢弃的试管的电极。图2是代表传统电穿孔装置的方波电穿孔装置(ECM830，BTX，USA)的照片。
但是，所示的电穿孔装置具有以下缺点，首先，试管太贵，因为使用铝块作为电极。电穿孔装置的制造商推荐试管使用一次，但是，很多用户反复多次进行试验，因此出现试验误差的几率高。其次，因为电极材料(Al)在溶液中是反应的，并且相对产生氢的超电势(overpotential)低，因此由于水在电极表面分解所述电极容易生成气泡。第三，产生的离子(Al³⁺)对细胞具有不利作用。第四，由于生成氧化层(Al₂O₃)，表面电阻明显增大。第五，电场不均匀。这是因为大量电流流过电极的角，从而形成电场扭曲。第六，样本体积变大，使其不适合分析少量细胞。第七，样本装入和倒出试管需要多个步骤的样品处理。第八，因为不容易将试管处理过程集成到自动化系统中，所以不可能进行高通量的电穿孔。第九，水在电极表面的分解引起严重的pH值变化，这对细胞有害。因此，对开发克服上述不足的新电穿孔装置的需求上升。
为了解决上述问题，本发明的发明人已经使用了具有不导电材料的长中空样本填充件的电穿孔装置，其中对样本填充件的两个末端施加电脉冲，从而电流流过填充在样本填充件中的样本。本发明的发明人已经使用这种电穿孔仪并进行电穿孔，并将其生物学结果与传统电穿孔法对比，以完成本发明。
发明内容
本发明的目的是提供一种使用长中空样本填充件的电穿孔法。
本发明的另一个目的是提供一种电穿孔装置。
本发明的再一个目的是提供一种电穿孔系统。
本发明涉及一种电穿孔法，其中通过对样本施加电场使细胞膜电穿孔而使外来物质进入细胞。更具体地，本发明涉及一种电穿孔法、一种电穿孔装置和一种电穿孔系统，其中使用不导电材料的长中空样本填充件执行电穿孔，并通过从电极两个末端由电极施加电脉冲，使样本填充件内有效地实现电穿孔。
在本发明一个优选实施例中，提供一种电穿孔装置，包括中空样本填充件、贮存器和压力保持装置，压力保持装置连接到样本填充件的一个末端，与该末端流体连通，并提供适当的压力使样本保持在样本填充件中，从而将样本供应到样本填充件。根据本发明的电穿孔装置的构成方式为样本填充件末端和压力保持装置可以直接连接或通过接头(例如，T形接头或Y形接头)连接。
如果压力保持装置通过接头连接到样本填充件，则接头侧面具有用于插入电极的电极插入部分，并且如果样本填充件中填充样本，则插入电极插入部分的电极接触样本。根据本发明的电穿孔装置的压力保持装置可以是泵、注射器或移液管。在使用根据本发明的电穿孔装置进行电穿孔时，通过使用压力保持装置，首先将含有细胞的样本填充到样本填充件中。将电解液注入已经插入电极的贮存器，并连接电穿孔装置的中空样本填充件的末端，使其与贮存器的电解液流体连通。另外，对贮存器的电极以及插入接头的电极施加电脉冲，从而使填充在样本填充件中的样本中的细胞电穿孔。
在本发明的另一个优选实施例中，电穿孔装置根据本发明包括中空样本填充件、贮存器、贮存夹持器和压力保持装置，其构成方式是，压力保持装置是移液管；所述移液管在其主体上形成导电接触；并且处于样本填充件内的可运动电极与活塞配合，并且容易拆卸和安装。可运动电极起到柱塞的功能，将样本注入样本填充件，同时作为通过导电接触电连接样本的电极。移液管尖端包括样本填充件和可运动电极，可运动电极在移液管尖端中往复运动，并直接连接到安装移液管尖端的轴。如果移液管活塞的工作使可运动电极在移液管尖端内部水平运动并且使样本注入样本填充件中，则样本接触可运动电极并电连接到移液管主体的导电接触。在优选实施例中，另一个电极处于贮存器的底部表面，在此处电极接触贮存的电解液或样本，并且该电极可以装到圆柱形贮存夹持器内管并与之分离。贮存夹持器上面具有固定移液管和贮存器的固定部分，通过内管连接到贮存器电极的电极端子。贮存夹持器的构成可以分开成为主体和盖，或者可以按整体方式构成。
如上所述，本发明提供包括电穿孔装置和电脉冲发生器的电穿孔系统。
在根据本发明的电穿孔系统中，如果电脉冲施加到接触贮存器中贮存的电解液或样本的一个电极以及插入接头或与活塞配合工作的另一个电极，则将样本填充件中填充的样本包含的细胞电穿孔。
此外，根据本发明的中空样本填充件可以按通道结构制成。通道是通过结合上板和下板整体形成的，其中通道的两个末端按流体连通方式连接到一对井形的贮存器。如果样本注入一个井中并通过毛细管作用、水头压力或抽吸作用填充在通道中，并且过量的样本填充到另一井，则对通道内的细胞电穿孔的方式是，将一对电极插入相应井中，由此将电场施加到通道中。
优选地，根据本发明的电穿孔方法包括以下步骤：利用压力保持装置、毛细管作用或水头压力将样本填充到样本填充件内；将电穿孔装置的样本填充件的两个末端按流体连通方式连接到贮存器中贮存的样本或电解液中；以及将电极插入每个贮存器并对插入的电极施加电脉冲，将样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及将样本电连接到电极之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
优选地，样本填充件和贮存器是不导电材料，从而使用透明塑料或玻璃。因此，聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(Cyclicolefin Copolymer，COC)、聚苯乙烯(PS)、聚乙烯(PE)、共聚酯热塑性合成橡胶(Copolyster Thermoplastic Elastomer，TPC)、聚酰亚胺、聚丙烯、硅、玻璃、石英或类似物质用作样本填充件和贮存器的材料，但不限于此。此外，具有上述微通道样本填充件的电穿孔装置，可以容易地与混合、过滤、聚合酶链式反应或毛细管电泳的其它系统集成。
典型的塑料作为中空样本填充件和贮存器的材料具有明显的优点。通过使用这些材料，容易制造根据本发明的微通道装置。此外，这些材料成本合理，透明并且适于活体。如果使用透明塑料，则可以实时观察物质被吸入细胞的过程。结果，可以直观观察到基因转移到活细胞中的过程。
并且，根据本发明的另一种电穿孔方法包括以下步骤：使用压力保持装置，例如注射器或泵，用样本填充该样本填充件内部；将电穿孔装置的样本填充件末端按流体连通方式连接到样本或电解液；通过将一个电极插入贮存器，将另一电极插入用于连接压力保持装置和样本填充件的接头的电极插入部分，并对插入的电极施加电脉冲，将样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及接触样本之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
根据本发明的再一个电穿孔方法包括以下步骤：使用移液管型压力保持装置将样本填充到样本填充件内；用电解液填充贮存器并将其插入贮存夹持器；将移液管型压力保持装置插入贮存夹持器并通过固定部分将其固定，并样本填充件的末端按流体连通方式连接到样本或电解液；以及通过对装在贮存器的电极和移液管中的可运动电极施加电脉冲，对样本填充件中填充的样本的细胞电穿孔。如果样本太少，优选地，在将电极插入贮存器以及接触样本之前，将装有样本的贮存器替换为仅装有电解液的贮存器。
此外，通过调节样本的维持和取出以便使中空样本填充件内连续执行，本发明可以连续执行电穿孔。
在根据本发明的电穿孔装置、电穿孔系统或电穿孔方法中，电极可以由任何的导电材料制成，并且优选地使用铂电极、金电极、银电极、铜电极或镀有上述金属的塑料。此外，压力保持装置可以是泵、注射器或移液管。中空样本填充件优选的是毛细管、管或通道。在通道的情况下，优选的是微通道。特别是，样本填充件具有样本填充件纵向长度(L，cm)与水平截面积(A，cm)之比(R，cm^-1)在1/50到1/10000范围内。
通过容易地测量流过样本填充件的电流，可以电测量与细胞的电穿孔状态有关的信息。根据本发明的电穿孔装置可以有效地用于DNA传递第一步的电穿孔，并能有助于研究电穿孔机理。并且，电穿孔装置可以在基因操作中小型化。
附图说明
图1表示根据传统电穿孔装置装有平行铝电极板的试管；
图2是方波电穿孔装置(ECM830，BTX，USA)的传统电穿孔装置的照片；
图3表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图4表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图5表示根据本发明电穿孔装置中圆盘状接头和毛细管之间的连接状态；
图6表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图7表示根据本发明电穿孔系统另一个实施例的结构；
图8表示根据本发明电穿孔系统再一个实施例的结构；
图9表示用于本发明电穿孔装置的移液管的结构；
图10表示图9移液管的部分放大图；
图11(a)和11(b)表示用于图9移液管的样本填充件和可移动电极；
图12表示用于根据本发明电穿孔装置的贮存器和贮存夹持器的结构：
图13表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构；
图14表示根据本发明具有通道结构的电穿孔装置的透视图；
图15是图14电穿孔装置的剖视图；
图16、17和18表示根据本发明电穿孔装置的一个实施例；
图19是用本发明的电穿孔装置电穿孔后的细胞显微照片，其中细胞是用明场观察的；
图20是用荧光观察到的、与图19相同区域的细胞的照片；
图21是用现有技术电穿孔装置电穿孔后的细胞显微照片，其中细胞是用明场观察的；
图22是在荧光下观察到的、与图21相同区域的细胞照片；
图23是表示使用本发明的电穿孔装置电穿孔时，样本填充件形状与电穿孔效率之间关系的曲线；
图24到33是表示使用本发明的电穿孔装置电穿孔时，样本填充件形状与电穿孔效率之间关系的显微照片；
图34是表示根据本发明对不同细胞进行电穿孔并通过绿色荧光蛋白(GFP)表达得到转染率(荧光表达的细胞数/存活细胞数)的曲线；
图35是表示图34结果的显微照片；
图36表示通过本发明的电穿孔同时将GFPsiRNA和pEGFP转染到细胞中以及显微镜测得的其GFP表达的结果；
图37表示当使用装有传统Al电极的试管执行电穿孔时施加电脉冲之前(a)和之后(b)的Al电极表面；
图38表示在100微米(μm)宽的微通道中的碘化丙锭(propidium iodide，PI)注射过程；
图39是借助两个微通道的电穿孔通过PI注射的细胞的显微照片，其中两个微通道分别具有100μm(a)和500μm(b)的不同通道宽度；
图40是对比不同通道宽度的PI光散射强度的曲线；
图41表示两个微通道电穿孔之前和之后的细胞尺寸变化，两个微通道分别具有150μm(a)和500μm(b)的不同通道宽度；
图42表示分别在50μm(a)、150μm(b)、200μm(c)和250μm(d)不同通道宽度的微通道中将细胞培养七天得到的结果；
图43(a)是0.75千伏/厘米(kV/cm)电场作用10毫秒(ms)和24小时后通过细胞明场观察到的照片，图43(b)是0.4kV/cm电场作用10ms和24小时后通过重叠细胞明场和荧光观察到的照片；以及43(c)是荧光下观察到的图43(b)细胞的照片。
具体实施方式
下面将参考附图详细说明根据本发明的电穿孔装置、电穿孔系统和电穿孔方法。在所有附图中，为了避免繁琐，不再重复对相似或等价部分或零件的解释。虽然联系某些优选实施例描述了本发明，但应该理解的是，本发明包含的主旨不并限于这些具体的实施例。相反，本发明的主旨包括权利要求精神和范围内包含的替换、修改和等价条款。本发明引用的文件作为参考文献结合在本发明中。
图3表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构。该电穿孔系统包括：用于产生电脉冲的脉冲发生器100；贮存样本的一对贮存器(reservoir)300；以及样本填充件400，例如其中填充样本的毛细管或管子。这对贮存器300通过样本填充件400连接使流体连通。在这对贮存器300中分别插入连接脉冲发生器100的电极200。通过对电极200施加电场，将填充在样本填充件400中的样本的细胞电穿孔。此时，样本填充件400可以是两个末端都开口，或者仅在任一个末端开口。换句话说，只要样本填充件400适于填充样本并且可以在其两个末端施加电场，样本填充件的任何部分开口都是可以的。
图4表示根据本发明电穿孔系统一个实施例的结构。该电穿孔系统包括：单个贮存器(未图示)；诸如毛细管或管子的中空样本填充件400；以及压力保持装置的注射器600，该注射器连接在样本填充件400的末端，用于保持适当的压力，使样本填充件可以在其内部填充样本。在图4的电穿孔系统中，样本填充件400的末端和压力保持装置600通过T形接头510连接。T形接头510具有电极插入部分512，电极200插入该电极插入部分中以施加电脉冲。向样本填充件400中填充样本，并且电极200接触样本。适配器511将样本填充件400末端连接到接头510，并将接头510连接到压力保持装置600。
图5表示根据本发明的圆盘形接头520和样本填充件400之间的连接状态，其中圆盘形接头520用于在电穿孔装置中连接样本填充件和压力保持装置。图5的圆盘形接头520中具有孔521，样本可以经过这个孔。在圆盘侧面形成电极插入部分512。L形电极220插入电极插入部分512，从而如果在样本填充件400中填充样本，则电极接触样本。
图6表示根据本发明电穿孔系统的一个实施例。该电穿孔系统包括：贮存器300、如图4所示的电穿孔装置，以及用于产生电脉冲的脉冲发生器100。样本包括贮存在贮存器300中的细胞或电解液。电极200插入贮存器300以接触样本。此外，形成连接的方式是，样本填充件400的末端流体地连通贮存器的样本。在执行电穿孔时，泵620控制的注射器600作为压力保持装置，使样本填充件400内部充满样本。此时，在样本填充件400充满样本后，可以用填充电解液的贮存器替换填充样本的贮存器。通过在接触贮存器400中贮存的样本或电解液的电极200和插入接头520的电极之间施加电脉冲，将填充在样本填充件400中的样本的细胞电穿孔。
图7表示本发明电穿孔系统的另一个实施例，其中泵620作为压力保持装置，其连接是与样本填充件的末端流体地相通。因此，样本填充件400通过接头520连接到泵620。
图8表示根据本发明的电穿孔系统的另一个实施例，其中移液管630作为压力保持装置，与样本填充件流体地相通。在此图中，样本填充件400通过接头520连接到移液管630。
图9表示用于根据本发明的电穿孔装置的移液管的结构，其中移液管630作为压力保持装置，与样本填充件流体地相通。图10表示与可运动电极230b和样本填充件440的移液管630连接的局部放大图。样本填充件440直接连接到移液管尖端安装轴631。作为压力保持装置的移液管630在其主体上具有导电接触632，可运动电极230b插入样本填充件并装在移液管中，从而与移液管的活塞634相通，并在样本填充件中往复运动。图11(a)和(b)表示用于移液管的样本填充件440和可运动电极230b。
图12表示用于本发明电穿孔装置的贮存器330和贮存夹持器340的结构。贮存夹持器340在上内管壁形成固定移液管的移液管固定部分640，而且还具有电连接到固定部分640的电极端子250b和在其底部形成的其它电极端子250a。贮存器在其下方装有接触电解液或样本的电极230a。如果移液管630固定在贮存夹持器的移液管固定部分640上，则可运动电极230b、移液管接触632和移液管固定部分640电连接在一起。在执行电穿孔时，用移液管吸取样本并填充到样本填充件440，装有电解液的贮存器330插入贮存夹持器340的内管，移液管固定地插在移液管固定部分640中，使移液管的末端与贮存器的电解液流体地相通，并通过贮存夹持器340的电极端子250a、250b对两个电极230a、230b施加电脉冲，使样本填充件中的细胞电穿孔。在电穿孔之后，将移液管与贮存器和贮存夹持器分离，并按下移液管按钮633，以便容易重新吸取电穿孔的细胞。贮存夹持器340可以制成上盖340a和主体340b之间可分离(见图12)，或者可以制成整体。样本填充件可拆卸地连接到移液管尖端安装轴631，从而可以制成一次性的(见图10)。此外，可以使用所述穿孔仪器和电脉冲发生器制成自动电穿孔系统。图13表示根据本发明的电穿孔系统的另一个实施例，其中并行排列有一个或多个电穿孔装置，每个包括连接到注射器型压力保持装置的样本填充件。
图14是根据本发明具有微通道结构的样本填充件和井形贮存器的电穿孔装置的透视图。该电穿孔装置包括由上板350a和下板350b构成的基体，上面形成微通道中空样本填充件和成对的井，所述井与样本填充件的两个末端流体地相通连接。图15是沿图14的线A-A’截取的剖视图。该电穿孔装置在其两侧形成用于插入脉冲发生器电极的一对或多对井(351a-355a，351b-355b)，从而对包括细胞的样本施加电脉冲，其中形成微通道(451-455)以连接相应的井(351a-351b，352a-352b，353a-353b，354a-354b，355a-355b)。通过将电极插入井中并施加电脉冲，可以对细胞膜电穿孔，并且使外来物质可以进入细胞。在上述电穿孔装置中，每个通道的通道长度不同。因此即使向脉冲发生器的电极施加相同电压，每个通道的电场强度也是不同的。
电场强度可以通过下面的式1得到：
                 E＝V/L                               (1)
式中，E是施加的电场强度，
V是电极两端的电压差，以及
L是通道长度。
结果，即使在微通道两端施加相同电压，由于通道长度不同也得到相互不同的电场。
具有微通道样本填充件的上述电穿孔装置可以制成整体，或者可以通过连接玻璃基体或塑料基体制成。在通过连接塑料基体制成电穿孔装置时，优选地，电穿孔装置应包括上基板350a和下基板350b，其中上基板具有形成井的孔，上或下基板形成凹陷的通道。
优选地，根据本发明的电穿孔装置形成的样本填充件的长度为1毫米(mm)-10厘米(cm)。更优选地，样本填充件的长度为1cm-5cm。优选地，如果样本填充件具有通道结构，则其通道的高度为2μm-2mm，其宽度为10μm-10mm。更优选地，通道的高度为20μm-200μm，其宽度为100μm-5mm。根据本发明具有通道结构的电穿孔装置可以通过微型电子机械系统(Micro Electronic Mechanical System，MEMS)技术制造。
图16(a)、(b)、(c)和(d)表示根据本发明的电穿孔装置的各种结构。图16(a)到(c)表示在其两侧形成用于插入脉冲发生器的电极的几对井的结构，并且每对井形成一个通道，通道形成连接多对井的空间并填充样本。特别是，图16(c)表示的电穿孔装置中的井的排列方式是：每对井的距离不同。
图16(d)所示的电穿孔装置在其两侧形成插入脉冲发生器电极的一对井，还形成连接这对井并填充样本的多个通道。
图17所示的电穿孔装置在其两侧形成插入脉冲发生器电极的成对井，并且每对井形成一个通道，其中每个通道的宽度彼此不同。如果样本填充件的每个通道的通道长度不同，则每个通道可以施加不同的电场。
图18(a)和18(b)所示的电穿孔装置是，连接相应井的每个通道的长度和宽度都不同。根据本发明的电穿孔装置是，在相同电场下，与传统电穿孔装置相比，流过很小的电流，因为电流仅流过中空的样本填充件。结果，可以减小功率消耗，并且如果需要，可以为了便携目的制成使用电池作为电源。
下面将说明使用根据本发明的电穿孔装置和电穿孔系统的电穿孔实验和生物学结果。
优选实施例1：使用移液管型电穿孔装置的人胚肾HEK-293细胞株(cell line)的电穿孔实验
1-1细胞制备
HEK-293细胞株(ATCC，CRL-1573)在25平方厘米(cm²)培养瓶中贮存在补充10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的培养基中，在CO₂培养箱中培养，并培养到70％汇集(confluency)。接着，移去上述培养基，用磷酸缓冲溶液(PBS)清洗细胞，并胰蛋白酶处理。加入补充FBS的培养基并离心，然后用PBS缓冲溶液清洗细胞，并再次在补充10％FBS的培养基中悬浮，制成细胞样本。
1-2电穿孔
将在1-1中制备的约100微升(μl)HEK-293细胞样本在室温下装入贮存器。在100μl样本中插入5微克(μg)质粒DNApEGFP(来源：GenBankAccession：U55762；CLONTECH Lab.)作为转染物并混合。将根据本发明的电穿孔装置的样本填充件末端(见图8)插入贮存器中的混合溶液中。使用移液管型压力保持装置在样本填充件内部填充样本，同时样本填充件的末端连接成与贮存器中贮存的混合溶液流体连通。将此贮存器替换为仅含有电解液的贮存器，并将样本填充件的末端浸在含有电解液的贮存器中形成流体连通。另外，设置电场施加条件，例如脉冲电压、脉冲持续时间和脉冲重复频率，等等。在本实验中，电场设置成，施加0.57kV/cm的电场一次，脉冲持续30ms。接着，在上述电场条件下，向插入连接到电穿孔装置外部的接头中的电极以及仅含有电解液的贮存器施加电脉冲。
1-3取出电穿孔的细胞
使用移液管将样本填充件中的样本移到培养盘，并添加培养基。在CO₂培养箱中将细胞培养24-48小时。计数细胞数量并测量其转染率。
1-4结果
图19和图20是根据本发明的电穿孔装置插入质粒DNA pEGFP的HEK-293细胞的显微照片。图19是明场(bright field)照片，图20是荧光下观察到的照片。实验的结果是，如照片所示，转染率(荧光表达的细胞数/存活细胞数)在90到95％范围内，并且细胞的存活率超过90％。图21和图22是使用图1所示的传统电穿孔装置在相同条件下得到的实验结果的显微照片，其中HEK-293细胞转染了质粒DNA pEGFP。图21是明场照片，图22是荧光下观察到的照片。实验结果是，转染率约50％，观察到的细胞存活率小于本发明。需要注意的是，经常在现有技术中观察到的死细胞或生长很少的细胞(图21中的圆形细胞)在本发明结果中大大减少(图19和图20)。因此，可以说，当使用根据本发明的电穿孔装置时，转染率和存活率明显改善。此外，如果使用根据本发明的电穿孔装置，容易取回渗入特殊物质的细胞。
1-5基于样本填充件几何结构变化的影响分析
将1-1中制备的约100μl HEK-293细胞样本倒入室温的贮存器。将5μg质粒DNA pEGFP作为转染物加入100μl样本并混合，并且使用图8的电穿孔装置进行实验。用移液管型压力保持装置吸取样本，并将该贮存器替换为仅含有电解液的贮存器。将样本填充件的末端浸入含有电解液的贮存器形成流体连通。电场条件的设置方式是，425V/cm的电场施加三次，脉冲持续时间10ms。在这样的方式下执行穿孔，毛细管样本填充件固定成截面直径0.135cm，而末端之间的长度从0.4cm变到4cm。表1表示几何条件和实验条件。
表1