用于治疗或预防流行性角膜结膜炎的新型抗病毒化合物 发明领域 本发明涉及新型抗病毒化合物， 包含所述化合物的抗病毒聚集体、 包含此种聚集 体的药物组合物和通过使用所述化合物来治疗或预防由病毒引起的流行性角膜结膜炎和 其它眼病的方法， 该病毒与存在于细胞表面上的末端唾液酸残基结合。
背景
流行性角膜结膜炎 (EKC) 为由 HAdV-D 种的腺病毒 HAdV-8、 HAdV-19 和 HAdV-37 以 及 HAdV-E 种的 HAdV-4 引起的严重且具传染性的眼部感染 ( 结膜和角膜 )。
此 外，已 报 道 D 种 的 HAdV-53 也 会 引 起 EKC(PLoS One， 2009， 4(6)， 1-14， doi:10.1371/journal.pone.0005635.g001)。此外， 以 HAdV-22， 37/H8 表示的腺病毒已自 EKC 患者中分离。
近 来， 已 报 道 以 HAdV-54 表 示 的 病 毒 也 会 引 起 EKC(British Journal of Ophthalmology( 英 国 眼 科 学 杂 志 )(2010)Hisatoshi Kaneko 等 人， “Epidemiological and virological features of epidemic keratoconjunctivitis due to new human adenovirus type 54in Japan( 在日本由新的人 54 型腺病毒导致的流行性角膜结膜炎的流 行病学和病毒学特征 )” ， 2010 年 6 月 8 日在线发表， doi:10.1136/bjo.2009.178772)。
EKC 的症状是结膜 ( 结膜炎 ) 和角膜 ( 角膜炎 ) 中的炎症、 疼痛、 水肿、 视力下降、 流泪、 对光敏感、 感觉眼内有异物和形成假膜。在疾病的急性期 ( 约两至三周 ) 期间， 病毒 存在且复制。通常一只眼首先被感染且在两至三天内蔓延至另一只眼。第一只眼中的感染 通常更严重。 在约 30％的患者中， 导致眼视力退化的角膜混浊持续数周、 数月或甚至数年。
因为该疾病在本质上常为流行性的， 所以其被称为流行性角膜结膜炎 (EKC)。
归因于该疾病的症状和高度传染性， 患者不能工作或上学或医生建议其不工作或 上学。在患者的密切环境中， 有约 45％的人 ( 例如家庭成员 ) 被感染。复发率在首次感染 后为 25％ ( 在五年内 ) 且在第二次感染后为 50％。
EKC 经由身体接触而在个体之间转移， 例如自眼至手， 自手至门把手， 自门把手至 另一人的手， 接着至未感染的眼。引起 EKC 的病毒可在例如门把手、 毛巾等上存活数月。随 后必须采取充分的感染控制措施以防止且减少流行性爆发。
用局部类固醇治疗急性期感染已被广泛采用。 然而， 新近的发现得出结论， 即类固 醇可延长在角膜中的存留 (persistence) 且频繁使用可导致持久的干眼症状。建议在该疾 病的急性期和慢性期中均应避免使用类固醇。
可在世界各地发现此高度传染性疾病， 但在亚洲的人口稠密国家更为普遍。腺病 毒结膜炎在日本尤其成问题， 在日本每年报道约有一百万 EKC 病例。
EKC 以散发方式和流行方式在世界范围内发生且在东亚 ( 包括日本、 韩国和台湾 ) 为地方病。已认可其为这些区域中的主要健康问题。此区域型流行病的经济和社会成本也 较高。在流行病爆发后必须关闭工作场所、 公共机构， 诸如学校和托儿所。每年由于该疾病 而损失许多工时。
尽管 EKC 通常在 2 至 3 周内痊愈， 但由 EKC 的高度传染性所导致的健康护理费用
和生产损失方面的社会成本极其巨大。该疾病也长期牵涉视力和复发。
引起 EKC 的腺病毒经由自病毒颗粒延伸的纤维蛋白而与其细胞受体相互作用。每 个颗粒皆具有 12 种同源三聚纤维蛋白， 因此纤维的受体结合结构域 ( 钮 (knob) 结构域 ) 呈现三个单独的结合位点。
已发现， HAdV-37 的细胞受体是糖缀合物， 其携带至少一个经由 α2， 3 糖苷键连接 至邻近糖链的末端唾液酸结构部分。因此， 腺病毒 HAdV-8、 HAdV-19、 HAdV-37 以及其它可能 引起严重形式的 EKC 的腺病毒 ( 诸如 HAdV-53、 HAdV-54、 和 HAdV-22， 37/H8) 的能力与其结 合于细胞表面上的唾液酸的能力密切相关。因此， 基于唾液酸的抗病毒药物可具有阻断病 毒附着的潜力。因此， 此类药物可能可用于治疗罹患 EKC 的患者。此外， 其也可能用于预防 EKC。
WO 01/037846 公开可通过施用治疗有效量的干扰病毒与唾液酸受体间相互作用 的物质 ( 诸如唾液酸 ) 来治疗或减轻腺病毒感染， 具体地眼部腺病毒感染， 例如角膜结膜 炎。
不幸的是， 碳水化合物与蛋白质之间的弱相互作用会限制碳水化合物作为药物使 用。已通过使用具有连接至人血清白蛋白的唾液酸衍生物的糖缀合物 (SA-HSA) 来尝试克 服这些限制 (Johansson， S.M.C 等， Antiviral Research( 抗病毒研究 )73(2007)92-100)。 然而， 所述多价糖缀合物因为一些原因而不宜作为药物。
SA-HSA 的准确结构和组成将在不同分子之间变化。因此， SA-HSA 表示一类难以在 结构上定义的结构。此外， 即使以相同方式产生， SA-HSA 衍生物的组成也将在不同批次之 间变化。从安全性和调控观点来看， 此为显著缺点。
此外， 使用源自人血浆的蛋白质 ( 即 HSA) 也为主要缺点。HSA 的来源使得难以产 生较大量的基于 HSA 的药物。此外， 在源自人血浆的 HSA 中可能无法排除由传染原 ( 诸如 病毒或朊病毒 ) 导致的污染。
因此， 基于 HSA 的产品不宜作为药物产物， 且将高度需要多价替代物。
当前， 没有可用来缩短感染过程、 改善痛苦的临床症状、 终止病毒复制、 或防止形 成角膜混浊的临床上可应用的特定抗病毒疗法。
因此， EKC 是缺乏有效治疗且不能大量满足医疗需要的疾病。可用于治疗 EKC 以 及防止其传播的药物将因此高度合乎需要。
发明概述
本发明寻求缓和、 减轻、 防治或消除至少一种、 诸如一种或多种上文鉴定的缺陷。
因此， 根据本发明的一个方面， 提供一种可用通式 (I) 表示的化合物
其中 R1 为甲基或乙基 ； R2 为 R3、 R4 或 R8 ； X 为 O、 S 或 NH ； 并且如果 R2 为 R3， 则“A” 为 C3-7 烷二基， 如果 R2 为 R4 或 R8， 则 “A” 为 C2-7 烷二基， 其中 “X” 和 R2 连接至所述 烷二基的不同碳原子且其中所述不同碳原子是所述烷二基中间隔最远的碳原子 ； R3 选自 由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)R5、 OC(O)R5、 C(O)N(C0-3 烷基 )R5 和 C(O)OR5， 其中 R5 是包含 14 至 30 个碳原子的直链碳链 ； 所述碳链是饱和碳链或包含一个或多个双键和 / 或 三键 ； 此外， 所述碳链未被取代或被一或多个 C1-C5 烷基取代 ； R4 为根据式 (II) 的取代基，
D(CH2)m(OCH2CH2)n(CH2)pER7(II)
其中 “D”连接至 “A”且选自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O) N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O ； 整数 “m” 为0至3； 整数 “n” 为 1 至 15 ； 整数 “p” 为0至3； “E” 选 自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O)N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O ； 且 R7 选自由 以下组成的组 ： 如上文所定义的 R5， 和 R6， 其中 R6 是根据式 (III) 的取代基
其中每个 R5 独立地如上文所定义， 且 C2-5 烷基连接至 “E” ； 且 R8 选自由以下组 成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)R9、 OC(O)R9、 C(O)N(C0-3 烷基 )R9 和 C(O)OR9， 其中 R9 是根据 式 (IV) 的取代基
其中每个 R5 独立地如上文所定义 ； 所述化合物作为不带电荷的质子化形式的酸， 药用加成盐， 溶剂化物或其盐的溶剂化物存在。
根据本发明的另一个方面， 提供一种包含多个根据式 (I) 的化合物和多个与所述 化合物分离且能够在水中形成双分子层的两亲性分子的聚集体。
根据本发明的另一个方面， 提供一种包含如上文所公开的聚集体和至少一种药用 赋形剂的药物组合物。
根据本发明的另一个方面， 如上文所公开的根据式 (I) 的化合物、 聚集体或如上 文所公开的药物组合物可用于治疗。
根据本发明的另一个方面， 如上文所公开的根据式 (I) 的化合物、 聚集体或如上 文所公开的药物组合物可用于治疗和 / 或预防由病毒引起的眼部感染， 如流行性角膜结膜 炎， 所述病毒与存在于所述病毒欲感染的细胞的细胞表面上的末端唾液酸残基结合。所述 病毒的实例包括 HAdV-8， HAdV-19， HAdV-37， HAdV-53， HAdV-54， 和 HAdV-22， 37/H8。
此外， 将本发明的各种实施方案的有利特征在从属独立权利要求中和下文详细描 述中限定。
附图简述
图 1 描述了根据本发明的聚集体导致 HAdV37 聚集的能力。
图 2 和图 3 描述了根据本发明的聚集体在不同的浓度下抑制 HAdV37 感染 HCE 细 胞的能力。
优选实施方案的详细描述
术语 “加成盐” 意为由添加药用酸 ( 诸如有机或无机酸 ) 或药用碱所形成的盐。有 机酸可为 ( 但不限于 ) 乙酸、 丙酸、 甲磺酸、 苯磺酸、 乳酸、 苹果酸、 柠檬酸、 酒石酸、 丁二酸或 顺丁烯二酸。无机酸可为 ( 但不限于 ) 盐酸、 氢溴酸、 硫酸、 硝酸或磷酸。碱可为 ( 但不限 于 ) 氨水和碱金属或碱土金属的氢氧化物。术语 “加成盐” 也包含水合物和溶剂加成形式， 诸如水合物和醇化物。
如本文所用， 单独或作为字尾或前缀使用的 “烷基” 意欲包括具有指定数目碳原子 的支链和直链饱和脂族烃基两者。例如， “C1-6 烷基” 表示具有 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个碳原子的 烷基。
如本文所用， 单独或作为字尾或前缀使用的 “烷二基” 意欲包括具有指定数目碳原 子的支链和直链饱和脂族烃基两者。
例如， “C1-6 烷二基” 表示具有 1、 2、 3、 4、 5 或 6 个碳原子的烷二基。 如本文所用， 如果未指示， 则由烷二基连接的基团可连接至该烷二基的任一碳原子。 烷基的实例包括 ( 但不限于 ) 甲基、 乙基、 正丙基、 异丙基、 正丁基、 异丁基、 仲丁 基、 叔丁基、 戊基和己基。
烷二基的实例包括 ( 但不限于 ) 亚甲基、 亚乙基 ( 乙二基 )、 亚丙基 ( 丙二基 ) 和 亚丁基 ( 丁二基 )。
化合物
本发明的一个实施方案涉及根据式 (I) 的化合物
其中 R1 为甲基或乙基 ； R2 为 R3、 R4 或 R8 ； X 为 O、 S 或 NH ； 且 如果 R2 为 R3， 则 “A” 为 C3-7 烷二基， 并且如果 R2 为 R4 或 R8， 则 “A” 为 C2-7 烷二基， 其中 “X” 和 R2 连接 至所述烷二基的不同碳原子且其中所述不同碳原子是所述烷二基中间隔最远的碳原子 ； R3 选自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)R5、 OC(O)R5、 C(O)N(C0-3 烷基 )R5 和 C(O)OR5， 其 中 R5 是包含 14 至 30 个碳原子的直链碳链 ； 所述碳链是饱和碳链或包含一个或多个双键和 / 或三键 ； 此外， 所述碳链未被取代或被一个或多个 C1-C5 烷基取代 ； R4 为根据式 (II) 的取 代基，
D(CH2)m(OCH2CH2)n(CH2)pER7(II)
其中 “D”连接至 “A”且选自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O)
N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O ； 整数 “m” 是0至3； 整数 “n” 是 1 至 15 ； 整数 “p” 是0至3； “E” 选 自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O)N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O ； 且 R7 选自由 以下组成的组 ： 如上文所定义的 R5， 和 R6， 其中 R6 为根据式 (III) 的取代基
其中每个 R5 独立地如上文所定义， 且 C2-5 烷基连接至 E ； 且 R8 选自由以下组成 的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)R9、 OC(O)R9、 C(O)N(C0-3 烷基 )R9 和 C(O)OR9， 其中 R9 是根据式 (IV) 的取代基
其中每个 R5 独立地如上文所定义 ； 所述化合物作为不带电荷的质子 化形式的 酸， 药用加成盐， 溶剂化物或其盐的溶剂化物存在。此外， 所述化合物可作为纯立体异构体 存在或存在于包含所述化合物的外消旋、 非对映、 非外消旋 (scalemic) 或端基异构混合物 中。所述化合物优选地作为纯立体异构体存在或存在于端基异构混合物中。
如上文所公开， 式 (I) 的 R1 为甲基或乙基。R1 优选地为甲基。此外， 如上文所公 开， 式 (I) 的 “X” 可选自 O、 S 或 NH。X 优选地为 O。如上文所公开， 如果 R2 为 R3， 则式 (I) 中的 “A” 为 C3-7 烷二基， 或如果 R2 为 R4 或 R8， 则 “A” 为 C2-7 烷二基。优选地， 所述 C3-7 烷二基和所述 C2-7 烷二基是非支链的直链烷二基， 诸如为戊 -1， 5- 二基。
本发明的一个实施方案涉及根据式 (I) 的化合物， 其中 “A” 为非支链的直链 C3-5 烷二基， 诸如戊 -1， 5- 二基， R1 为甲基， X 为 O 且 R5 为未被取代的直链碳链。
本发明的一个实施方案涉及根据式 (I) 的化合物， 其中 R1 为甲基， “X” 为 O， R5 为 未被取代的直链碳链， R2 为 R4 或 R8 且 “A” 为非支链的直链 C2-5 烷二基， 诸如乙 -1， 2- 二 基或戊 -1， 5- 二基。
如上文所公开， 式 (I) 的 R2 为 R3、 R4 或 R8。R2 优选地为 R4 或 R8， 且最优选地， R2 为 R4。然而， R2 也可为 R3。
如上文所公开， 式 (I) 的 R5 为包含 14 至 30 个碳原子的直链碳链。碳链可任选地 包含一个或多个双键和 / 或三键。此外， 所述碳链可任选地被一个或多个， 诸如 1 至 3 个 C1-C5 烷基 ( 诸如甲基 ) 取代。R5 优选地包含 20 至 30 个碳原子， 诸如 24 至 26 个碳原子。 尽管 R5 可被取代， 但优选 R5 未被取代的情形。
根据一个实施方案， R5 包含至少一个双键或三键。R5 优选地包含至少一个三键， 更优选地包含两个共轭三键。因此， R5 可例如是 9， 11- 二十四烷二炔基。
根据一个实施方案， R5 为包含 20 至 30 个碳原子和两个共轭三键的直链碳链， 诸 如 R5 为 9， 11- 二十四烷二炔基。
如上文所公开， R4 是根据式 (II) 的取代基。尽管整数 “p” 可为 0 至 3， 但如果 “p” 为 0， 则是优选的。整数 “m” ， 可为 0 至 3， 优选地为 2 或 3。尽管整数 “n” 可为 1 至 15， 但 “n” 优选地为 3 以上， 诸如 4 以上或 5 以上。此外， 尽管整数 “n” 可多达 15， 但 “n” 优选地 为 12 以下。
根据一个实施方案， R2 为 R4 且整数 “n” 为 4 至 15。这些聚乙二醇接头的存在可 能会增强包含根据式 (I) 的化合物的聚集体的抗病毒活性， 这在下文进一步论述。
在 “n” 为 4 以上的化合物中， 如果 R5 包含 20 个以上的碳原子， 这是优选的。
如上文所公开， 式 (II) 的 “D” 选自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O)N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O。优选地， “D” 选自由以下组成的组 ： N(C0-1 烷基 )C(O) 和 C(O) N(C0-1 烷基 )。 “D” 最优选地为 NHC(O)。
如上文所公开， “E” 选自由以下组成的组 ： N(C0-3 烷基 )C(O)、 OC(O)、 C(O)N(C0-3 烷基 ) 和 C(O)O。 “E” 优选地选自由以下组成的组 ： N(C0-1 烷基 )C(O) 和 OC(O)。如果 “E” 选自由 N(C0-1 烷基 )C(O) 和 OC(O) 组成的组， 则 R5 为羧酸残基的一部分。最优选地， “E” 为 NHC(O)。
尽管 R7 可选自 R5 和 R6， 但 R7 优选地为 R5。 如果 R2 为 R4 且 R7 为 R6， 则 R6 的 C2-5 烷二基优选地为乙 -1， 2- 二基 ( 亚乙基 ) 且 “E” 优选地为 C(O)NH。
根据一个实施方案， R2 为 R4， “D” 为 NHC(O) 或 OC(O)， 整数 “m” 为 2， 整数 “p” 为 0， “E” 为 NHC(O) 或 OC(O) 且 R7 为 R5。在所述实施方案中， 如果 R1 为甲基且如果 X 为 O， 这是优选的。此外， 如果” A” 是直链 C2-C5 烷二基 ( 诸如乙 -1， 2- 二基或戊 -1， 2- 二基 )， 这是优选的。此外， 在所述实施方案中整数 “n” 优选地为 3 以上。
根据一个实施方案， R2 为 R4， “D” 为 C(O)NH 或 C(O)O， 整数 “m” 为 2， 整数 “p” 为 0， “E” 为 NHC(O) 或 OC(O)， 且 R7 为 R5。在所述实施方案中， 如果 R1 为甲基且 X 为 O， 则这 是优选的。此外， “A” 优选地为直链 C2-C5 烷二基， 诸如乙 -1， 2- 二基或戊 -1， 2- 二基。此 外， 整数 “n” 在所述实施方案中优选地为 3 以上。
尽管如上文所公开， R2 优选地为 R4 或 R8， 但本发明的一个实施方案涉及根据式 (I) 的化合物， 其中 R2 为 R3 且 R3 为 NHC(O)R5 或 OC(O)R5。R3 在所述实施方案中优选地为 NHC(O)R5。
根据一个实施方案， 根据式 (I) 的化合物可选自由以下组成的组 ： 6， 19- 二氮 杂 -10， 13， 16- 三 氧 杂 -7， 20- 二 氧 代 - 四 十 三 烷 基 5- 乙 酰 氨 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸 (nonylopyranosylonic acid)、 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 - 四十九烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半 乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二 氧杂 -7， 47- 二氧代 - 六十四烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬 基吡喃糖酸、 6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧代 -29， 31- 四十四烷 - 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 -35， 37- 五十烷二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸和 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二氧杂 -7， 47- 二氧代 -56， 58- 七十一烷 - 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱
氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸。根据式 (I) 的化合物可选自由以下组成的 组： 6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧代 -29， 31- 四十四烷 - 二炔基 5- 乙酰 氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸、 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 -35， 37- 五十烷二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸和 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二氧杂 -7， 47- 二氧代 -56， 58- 七十一烷 - 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱 氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸。
如上文所公开， 本发明的一些实施方案涉及根据式 (I) 的化合物， 其作为不带电 荷的质子化形式的酸， 药用加成盐 ( 诸如呈其去质子化形式的酸 )， 溶剂化物或其盐的溶剂 化物存在。此外， 根据式 (I) 的化合物可作为纯立体异构体存在或存在于端基异构混合物 中。
如果存在于端基异构混合物中， 则如果 α- 端基异构体占优势， 这是优选的。因 此， 优选 75 ％以上， 诸如 90 ％以上、 95 ％以上、 99 ％以上或甚至 99.9 ％以上的化合物作为 α- 端基异构体存在的情形。
聚集体 因为引起 EKC 的腺病毒用以粘附细胞的细胞膜的细胞受体部分具有 末端唾液酸 残基， 所以多个如本文所述的化合物结合到包含多个能够在水中形成双分子层且与所述化 合物分离的两亲性分子的两亲性聚集体中。 发现所述聚集体与单价形式的化合物相比更有 效抑制 HAdV-37 与人角膜细胞的结合。
包含能够在水中形成双分子层的两亲性分子的聚集体可以作为具有亲脂性内部 的双分子层存在。
不受任何理论约束， 似乎此类聚集体可表征为关于单一聚集体中可用于结合腺病 毒的唾液酸残基数目的多价聚集体。因此， 所述聚集体与相应唾液酸残基或其唾液酸本身 相比， 更有效用于治疗和 / 或预防 EKC。
因此， 所述聚集体可克服使用 SA-HSA 的一些缺点。具体地， 所述聚集体的组分为 充分定义的分子且聚集体将不含任何传染原。
因此， 本发明的一个实施方案涉及包含多个如本文公开的化合物和多个与所述化 合物分离的分子的聚集体。所述分子可以是能够在水中形成双分子层的两亲性分子。聚集 体可包含由所述分子形成的双分子层。 因为聚集体包含能够在水中形成双分子层的两亲性 分子， 所以其可类似于细胞膜。因此， 具有较大亲脂性部分的化合物， 诸如如本文公开的化 合物， 可插入聚集体中。
当插入至水溶液中的所述聚集体中时， 如本文公开的化合物的唾液酸残基被呈递 给周围水性介质。包含式 (I) 的 R5 的化合物的亲脂性部分埋藏于聚集体中。
所述聚集体可包含至少 40mol％的能够在水中形成双分子层的两亲性分子。优选 地， 其包含 50mol％以上， 诸如 65mol％、 75mol％或甚至 85mol％以上的所述分子。
类似地， 所述两亲性分子的含量也可以在重量基础上确定。因此， 如本文公开的 聚集体可以包含 40wt ％以上的能够在水中形成双分子层的两亲性分子。优选地， 其包含 50wt％以上， 诸如 65wt％、 75wt％或甚至 85wt％以上的所述两亲性分子。
如本文公开的聚集体可以包含 50mol％以下的如本文公开的化合物。所述化合物
的含量可以为 25mol％、 15mol％、 10mol％或 5mol％以下。
过高含量的所述化合物可赋予该聚集体稳定性。此外， 过高含量可使 向周围水 性介质呈递唾液酸残基的离散化合物彼此接近。相反， 过低含量可导致不令人满意的与 病毒的结合。因此， 根据一个实施方案， 所述化合物含量可以为 0.1 至 25mol％， 诸如 5 至 15mol％。根据另一个实施方案， 含量为约 10mol％。
类似地， 根据一个实施方案， 所述化合物含量可以为 0.1 至 25wt ％， 诸如 1 至 15wt％或 5 至 15wt％。根据另一个实施方案， 含量为约 10wt％。
典型地， 能够在水中形成双分子层的两亲性分子包含至少一个， 诸如一个或两个 亲脂性碳链。所述链可为饱和链。此外， 所述链可为不饱和链， 因此包含一个或数个双键和 / 或三键。 尽管此碳链可为支链碳链， 但优选所述碳链为直链的情形。 碳链典型地构成所述 两亲性分子亲脂性部分的较大部分。其可包含 12 个以上的碳原子。根据一个实施方案， 碳 链包含 16 个以上的碳原子， 诸如 20 个以上的碳原子。
尽管可使用能够在水中形成双分子层的任何分子， 但可以有利地使用包含直链碳 链的分子， 其中所述碳链包含至少一个三键， 诸如两个共轭三键。
根 据 一 个 实 施 方 案， 能 够 在 水 中 形 成 双 分 子 层 的 所 述 分 子 可 选 自 包 含 9， 11- 二十四烷二炔基的分子。此类分子的一个实例为 10， 12- 二十五烷二炔酸。 如果聚集体组分包含共轭三键， 诸如 10， 12- 二十五烷二炔酸就包含共轭三键， 则 聚集体组分可通过 UV- 辐射而聚合。因此， 本发明的一个实施方案涉及此类聚集体， 其中所 述聚集体已用 UV- 辐射处理来导致聚合。
存在于如本文公开的聚集体中且包含共轭三键 ( 诸如式 (I) 的 R5 为 9， 11- 二十四 烷二炔基 ) 的式 (I) 化合物， 可以是 UV- 辐射处理所形成的此类聚合网络的一部分。
根据一个实施方案， 所述聚集体中的聚合程度可为至少 50 ％以上， 诸如 60 ％、 70％或甚至 80％以上。在此情形下， 聚合程度意为已成为所聚合的聚合物网络的一部分的 三键的百分比。
根据另一个实施方案， 可诸如通过用 UV- 辐射处理而聚合的聚集体已诸如通过避 免暴露于 UV- 辐射而小心处理来避免聚合。根据一个实施方案， 可以聚合的聚集体中的 10％以下， 诸如 5％、 1％或甚至 0.1％以下的 成分已经聚合。
在一个实施方案中， 式 (I) 的 R5 选自也存在于作为聚集体的一部分的两亲性分子 中的结构部分。例如， 如果 R5 是 9， 11- 二十四烷二炔基， 则所述分子可以是 10， 12- 二十五 烷二炔酸。此外， 如果所述分子是作为甘油二酯的磷脂， 则 R5 可选自所述酯中脂肪酸残基 的一种中的碳链。
典型地， 能够在水中形成双分子层的两亲性分子包含亲水性结构部分。所述亲水 性结构部分的实例包括羧基、 磷酸酯基、 磷酸的酯， 诸如胆碱， 丝氨酸和甘油酯、 硫酸酯基、 胺、 糖 ( 诸如单糖和双糖 ) 和羟基。
如上文所公开， 聚集体应包含能够在水中形成双分子层的两亲性分子。所述分子 可选自包含 12 个以上碳原子的羧酸、 磷酸甘油酯， 诸如磷脂酰胆碱、 磷脂酰丝氨酸和磷脂 酰乙醇胺和鞘磷脂。
根据一个实施方案， 能够在水中形成双分子层的两亲性分子可选自转变温度为 40℃以上， 诸如 50℃或 60℃以上的两亲性分子。如本领域技术人员所熟知， 在此情形下的
转变温度意为由两亲性分子在水中形成的双分子层的有序相 ( 也称为凝胶相 ) 转变为无序 液晶相时的温度。
在水中形成双分子层的两亲性分子的聚集体可作为脂质体存在 ( 也即一个或多 个球形双分子层， 其涵盖脂质体在其中形成的一部分水溶液 )。 所述聚集体也可以以片状形 式的双分子层存在。此外， 两亲性分子也可在水中形成胶束。然而， 胶束不包含任何双分子 层。
根据一个实施方案， 如本文公开的聚集体是包含一个或多个， 诸如 1 至 5 个双分子 层的片状物。
与脂质体相比， 具有单一双分子层的片状物中的双分子层的两侧将面向周围水性 介质。因而， 片状物中化合物的所有唾液酸残基将可用于结合病毒。
此外， 包含一个或数个双分子层的片状形式聚集体似乎对 HAdV-37 结合于人类角 膜细胞产生更有效抑制。
所述片状物的尺寸可视制备程序而变化。
根据一个实施方案， 片状物的平均宽度可多达数微米， 诸如多达 10 至 100μm。
可以片状物存在的聚集体的尺寸可通过声处理而减小。所述声处理可 以在将聚 集体配制为药物之前进行。根据一个实施方案， 所述具有减小尺寸的片状物的平均宽度可 以为 1μm 以下。
从胶体稳定性来看， 聚集体尺寸减小是优选的， 因为较小聚集体与较大聚集体相 比， 在更小程度上倾向于聚集和沉降。 可通过特别使聚集体进行超声处理、 挤压或高压均质 化 ( 诸如通过使用 Emulsifix C50 高压均质机 (F160)) 来减小尺寸。这些程序优选地在构 成双分子层的两亲性分子的转变温度以上进行。
形成聚集体的两亲性分子的转变温度不仅可影响双分子层的流动性， 而且可以影 响聚集体的实际形式。转变温度在环境温度以上的两亲性分子将更易于形成片状物， 而转 变温度在环境温度以下的两亲性分子将更易于形成脂质体。
因此， 根据一个实施方案， 作为如本文公开的聚集体的一部分的两亲性分子可以 选自转变温度在室温以上的两亲性分子， 诸如转变温度为 40 ℃、 50 ℃或甚至 60 ℃或高于 60℃。
两亲性分子的转变温度不仅受碳链长度影响， 而且也受双键和 / 或三键的存在的 影响。 已知双键会降低转变温度， 因为所述键破坏否则会形成的规则周期性结构， 由此负面 影响范德华相互作用。关于三键的作用， 具且体地共轭三键的作用了解较少。
不受任何理论约束， 由包含 10， 12- 二十五烷二炔酸的聚集体获得的良好活性可 能至少部分归因于所述聚集体看上去呈现为片状物而非脂质体。 可能共轭三键偏爱此类形 式。
根据一个实施方案， 如本文公开的聚集体可进一步包含另外的组分。作为一个实 例， 可使用影响聚集体流动性和稳定性的组分。 该组分的一个实例是胆固醇。 此类其它组分 的存在量典型地将等于或小于两亲性分子的量。根据一个实施方案， 诸如另外的组分 ( 诸 如胆固醇 ) 的含量可为 1 ∶ 1 至 1 ∶ 10( 另外的组分 ( 诸如胆固醇 ) ： 两亲性分子 )。
聚集体的形成
如本文公开的聚集体可通过为本领域技术人员所熟知的方法来获得。 所述方法包括声处理和 / 或挤压包含如本文公开的化合物和如本文公开的 两亲性分子的水溶液或混 悬液。
此外， 所述方法的实例包括在水溶液中溶解干膜。
根据一个实施方案， 如本文公开的聚集体可通过以下方式来获得 ：
- 将如本文公开的化合物和如本文公开的两亲性分子溶解于有机溶剂中， 所述有 机溶剂诸如氯仿、 二氯甲烷、 甲醇、 乙醇、 烃 ( 诸如己烷和庚烷 ) 或其混合物 ；
- 将所述溶液涂覆至表面 ；
- 蒸发有机溶剂 ； 和
- 将所得薄膜分散于水溶液中 ； 任选地可接着声处理所述溶液。所述声处理步骤 优选地在室温以上的温度 ( 诸如在 40℃或 40℃以上 ) 下进行。
制剂
本发明的另一个实施方案涉及包含聚集体的药物组合物， 例如用于治疗和 / 或预 防 EKC 的药物， 如上文中所述的聚集体包含根据式 (I) 的化合物。所述药物组合物可进一 步包含药用赋形剂， 诸如载体、 稀释剂和 / 或稳定剂。
“药用” 意为赋形剂在所用剂量和浓度下不会造成施用其的患者中的任何不合需 要的作用。所述药用赋形剂在本领域中是公知的。
根据一个实施方案， 所述如本文公开的药物组合物是适于施用于眼部的药物组合 物。
在无限制下， 适于施用于眼部的典型例示性药物组合物包含滴眼剂、 软膏、 喷雾 剂、 敷料和凝胶。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物包含 0.001 至 10mg/ml， 诸如 0.01 至 5mg/ml 或 0.01 至 1mg/ml 的聚集体， 如上文中所述的聚集体包含根据式 (I) 的物质。
此外， 如本文公开的药物组合物可包含 0.001 至 10mM， 诸如 0.01 至 1mM 的根据式 (I) 的物质。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可为水性组合物。所述水性组合 物的水含量可为 90wt ％或 90wt ％以上水， 诸如 90wt ％至 99.9wt ％、 95wt ％至 99wt ％或 95wt％至 98wt％水。
此外， 水性组合物可包含提供等渗溶液的药剂。 因此， 水性组合物可包含选自由以 下组成的组的药剂 ： 氯化钠、 甘油、 聚乙二醇、 糖， 诸如单糖 ( 例如葡萄糖和甘露糖醇 ) 和双 糖 ( 例如蔗糖 )。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物是包含电解质 ( 诸如氯化钠 ) 的水 性组合物。所述含量优选地应接近等渗浓度， 诸如约 0.9wt％。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物是包含甘油的水性组合物。甘油含 量可以为 2wt％至 3wt％， 诸如 2.3wt％至 2.3wt％或 2.5wt％至 2.7wt％。所述含量优选地 应接近等渗浓度， 诸如约 2.6wt％。
根据一个实施方案， 如本文公开的水性药物组合物的 pH 值约为 6.5 至 8。所述 pH 值优选地应接近生理 pH 值， 诸如约 7.2 至 7.8。
因为根据式 (I) 的化合物包含羧酸结构部分， 所以所述药物组合物可包含药用酸 和 / 或碱以将 pH 值调整至所需水平。 类似地， 药物组合物也可以包含缓冲物质， 诸如 HCO3-/CO32- 或 H2PO4-/HPO42-。
根据另一个实施方案， 药物组合物的 pH 值在已经添加如本文公开的聚集体之后 不进行调整。因此， 所述实施方案涉及如本文公开的水性药物组合物， 其 pH 值为约 5 至 7。 具有酸性 pH 值 ( 即 7 以下 ) 的组合物可具有不易受微生物生长影响的优点。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可以包含防腐剂。所述防腐剂的实 例为苯扎氯铵、 苯甲酸、 丁羟茴醚、 对羟基苯甲酸酯 ( 诸如对羟基苯甲酸丁酯、 对羟基苯甲 酸丙酯、 对羟基苯甲酸乙酯、 对羟基苯甲酸甲酯和其混合物 )、 苯氧乙醇、 苯乙醇或山梨酸。 包含防腐剂的药物组合物可更适于储存。
此外， 如本文公开的药物组合物可诸如通过加热灭菌或通过无菌过滤而灭菌。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物也可包含其它药用赋形剂， 诸如防 腐剂、 抗氧化剂、 其它等渗剂、 着色剂等。
在关于水性混悬液的实施方案中， 如本文公开的药物组合物可包含悬浮剂和稳定 剂， 诸如非离子表面活性剂、 亲水性聚合物等。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可包含增稠剂。可使用增稠剂来产 生稠化溶液、 凝胶、 糖浆、 霜剂或软膏。 为了形成稠化溶液或 凝胶， 可使用水凝胶形成物质。 所述水凝胶形成物质可选自由合成聚合物、 半合成聚合物和天然胶组成的组。 根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物为稠化水溶液。所述溶液的典型粘 度范围可为 1 至 100mPas， 更典型为 5 至 50 或 10 至 25mPas。
合成聚合物的实例包括聚乙烯醇、 聚乙烯吡咯烷酮、 聚丙烯酸、 聚乙二醇、 泊洛沙 姆 (poloxamer) 嵌段共聚物。
半合成聚合物的实例包括纤维素醚， 诸如羧甲基纤维素、 羟乙基纤维素、 羟丙基纤 维素、 甲基纤维素、 羟丙基甲基纤维素和乙基羟乙基纤维素。
天然胶的实例包括阿拉伯胶、 藻酸盐、 角叉菜胶、 壳聚糖、 果胶、 淀粉、 黄原胶。
可通过使用已知强烈粘着至粘膜的物质 ( 诸如透明质酸和其衍生物、 卡波姆 (carbomer) 型和聚卡波非 (polycarbophil) 型的交联聚丙烯酸和容易形成凝胶的聚合物 ) 而使稠化溶液或凝胶具有粘膜粘着性。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可以包含泊洛沙姆型嵌段共聚物。 使用泊洛沙姆型嵌段共聚物 ( 诸如包含聚乙二醇和聚丙二醇嵌段的聚合物 ) 是有利的， 因 为分散于水中的某些泊洛沙姆具有热可逆性。热可逆性泊洛沙姆的实例为泊洛沙姆 188 和 泊洛沙姆 407。
分散于水中的热可逆性泊洛沙姆具有低粘度但在高温下展示显著粘度增加， 导致 在体温下形成凝胶。因而， 可延长施用于相对温热的角膜的药物制剂的接触时间。因此， 本 发明的一个实施方案涉及如本文公开的药物组合物， 其具有热可逆性。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可以包含另一抗病毒化合物。所述 化合物的实例包括 N- 氯妥林 (N-chlorotaurin) 和聚维酮 - 碘 (Povidone-iodine， PVP-I)。
N- 氯妥林 (Cl-HN-CH2-CH2-SO3H) 为内源抗微生物剂。其为粒细胞和单核细胞 在氧化爆发期间产生的轻度活性氯化合物。由于其非特异性反应机制即氧化氨基、 硫代 和芳族化合物， 所以其具有类似于防腐剂的广谱杀微生物活性。已展示 N- 氯妥林的钠盐 (Cl-HN-CH2-CH2-SO3Na) 溶液可在体外杀死细菌和真菌。此外， 已证实杀病毒作用。聚维
酮 - 碘是聚乙烯吡咯烷酮 ( 聚维酮， PVP) 与元素碘的稳定化学络合物。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可以包含另一抗病毒化合物， 其中 所述抗病毒化合物是适用于局部治疗由疱疹引起的感染的化合物。 所述化合物的实例包括 鸟苷类似物阿昔洛韦 (aciclovir)、 伐昔洛韦 (valaciclovir)、 喷昔洛韦 (penciclovir) 和 泛昔洛韦 (famciclovir)、 和膦甲酸盐 ( 膦甲酸钠六水合物 )。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物可包含局部麻醉剂。因为 EKC 可以 是极疼痛的疾病， 所以宜包括提供疼痛减轻的局部麻醉剂。 此外， 尽管施用本身可能是疼痛 的， 但该疼痛减轻可具有鼓励患者继续治疗的优点。 此外， 使用速效局部麻醉剂可使患者有 可能实际上睁开眼以允许进一步直接将组合物施用角膜。 有用的局部麻醉剂的实例包括利 多卡因、 丙胺卡因和罗哌卡因。
治疗
根据另一个实施方案， 如本文公开的化合物、 聚集体或药物组合物可用于治疗。
眼部感染的治疗
如上文已公开， 发现如本文公开的聚集体抑制 HAdV-37 结合于人类角膜细胞。
因此， 本发明的一个实施方案涉及用于治疗和 / 或预防由病毒引起的眼部感染的 如本文公开的化合物、 聚集体或药物组合物， 所述病毒与存在于所述病毒欲感染的细胞的 细胞表面上的末端唾液酸残基结合。 类似地， 本发明的一个实施方案涉及如本文公开的化合物、 聚集体或药物组合物 用于制备治疗和 / 或预防由病毒引起的眼部感染的药物的用途， 所述病毒与存在于所述病 毒欲感染的细胞的细胞表面上的末端唾液酸残基结合。
根据一个实施方案， 所述病毒可选自由以下组成的组 ： HAdV-8、 HAdV-19、 HAdV-37、 HAdV-53、 HAdV-54 和 HAdV-22， 37/H8。所述病毒也可选自 HAdV-8、 HAdV-19 和 HAdV-37， 诸 如为 HAdV-37。
根据一个实施方案， 待治疗和 / 或预防的眼部感染可以是流行性角膜 结膜炎 (EKC)。
根据一个实施方案， 被治疗和 / 或预防的眼部感染可以是急性出血性结膜炎。 急性出血性结膜炎由病毒 ( 诸如柯萨奇病毒 A 24 变种 (Coxsackievirus-A24variant， CVA24v) 和 70 型肠病毒 (EV70)) 引起。
另一个实施方案涉及预防和 / 或治疗由病毒引起的眼部感染 ( 诸如 EKC) 的方法， 所述病毒与存在于所述病毒欲感染的细胞的细胞表面上的末端唾液酸残基结合， 所述方法 包括向需要该预防和 / 或治疗的哺乳动物 ( 包括人 ) 施用治疗有效量的如本文公开的化合 物或聚集体或包含治疗有效量的如本文公开的化合物的药物组合物。所述化合物、 聚集体 或药物组合物优选地以该方法施用于眼部。
可以将药用有效剂量的根据本文实施方案的药物组合物施用于患者。 “药用有效 剂量” 意为足以产生关于施用所针对的病症的需要作用的剂量。精确剂量可取决于化合物 活性、 施用方式、 病症和 / 或疾病的性质和严重性和一般状况， 诸如患者年龄和体重。
根据一个实施方案， 如本文公开的药物组合物将每天施用一次或数次。 典型地， 所 述药物组合物将一天施用三次。
当用于本文中时， “预防” 不应解释为意为病症和 / 或疾病在使用本文公开的实施
方案的化合物或药物组合物进行预防后决不可能再次发生。此外， 所述术语也不应解释为 意为在预防所述病症的使用后， 病症至少在某种程度上不可能发生。事实上， “预防” 意为尽 管如此使用仍发生需要预防的病症， 但其严重性将比没有如此使用要小。
根据一个实施方案， 治疗也涵盖预治疗， 也即预防性治疗。
一般说明
尽管上文已参考特定说明性实施方案描述了本发明， 但并不意欲将本发明限于本 文阐述的特定形式。上述实施方案的任何组合皆应视为在本发明的范畴内。事实上， 本发 明仅受随附权利要求限制且除上文指定外的其它实施方案同样可能在这些随附权利要求 范围的范畴内。
在权利要求范围中， 术语 “包含” 不排除存在其它物质或步骤。另外， 尽管个别特 征可包括在不同申权利要求范围中， 但这些特征可能有利地加 以组合， 且包括在不同权利 要求范围中并不暗示特征的组合不可行和 / 或不有利。此外， 单数参考物不排除复数。术 语 “一” 、 “第一” 、 “第二” 等不排除复数。
实验
化合物
使用嵌段合成法来合成化合物 A-K( 参见方案 1)。因此， 使用在 DMF 中的哌啶对 与 Fmoc 保护的氨基戊醇偶联的唾液酸 1 进行脱保护 (Johansson， S.M.C ； Nilsson， E.C ； Elofsson， M. ； Ahlskog， N. ； Kihlberg， J. ； Arnberg， N.Antiviral Res.( 抗病毒研究 )2007， 73， 92-100)。使用 EDC·HCl， 使粗产物与 Fmoc 保护的聚乙二醇接头 (PEG 2、 4 或 11) 偶联 得到化合物 2-4， 或与 PDA(10， 12- 二十五烷二炔酸 ) 或十六烷酸偶联分别得到化合物 14 和 15。 使用在 DMF 中的哌啶对化合物 2-4 进行脱保护。 接着使用 EDC· HCl， 使粗化合物与硬脂 酸偶联 ( 以得到化合物 5-7)、 与二十四烷酸偶联 ( 以得到化合物 8-10) 或与 10， 12- 二十五 烷二炔酸偶联 ( 以得到化合物 11-13)。接着通过 NaOMe(0.05M 于 MeOH 中 ) 处理 1h， 随后 添加 5 当量 NaOH 再持续 18h 来对化合物 5-15 进行脱保护。通过使用 CH2Cl2:MeOH:H2O 系统 在 SiO2 上进行柱色谱法来纯化最终化合物 (A-K)。嵌段合成法易于通过简单改变接头 ( 例 如接头长度、 接头类型、 键类型 ) 和酸来合成新颖化合物。
方案 1 ： 化合物 A 至 K 的合成
下文公开化合物 A 至 K 的实验详情。
一般而言 ；
i. 除非另有说明， 否则操作在环境温度 ( 即在 17 至 25℃的范围内 ) 下进行 ；
ii. 经由旋转蒸发在真空内进行蒸发 ；
iii. 使用标准硅胶 (35-70nm， ) 玻璃柱进行柱色谱法 ( 根据快速程序 (flash procedure)) ；
iv. 产量 ( 当存在时 ) 未必为可获得的最大产量 ；
v. 一般而言， 经由核磁共振 (NMR) 和 / 或质谱 (MS) 技术来确认终产物的结构 ； 使 用 Micromass Q-Tof(ESI) 获得质谱数据 ； NMR 化学位移值基于 δ 标度测量 [ 使用在 400MHz 场强下操作的 Bruker DRX 400 分光计来确定质子磁共振谱 ] ； 已使用下列缩写 ： s， 单峰 ； d， 双重峰 ； t， 三重峰 ； m， 多重峰 ；
vi. 不必完全纯化中间体但其结构和纯度经由薄层色谱法和 / 或 NMR 分析来评 估；
vii. 已使用下列缩写 ：
化 合 物 2- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 19- 二氮杂 -22-(9H- 芴 -9- 基 )-10， 13， 16， 21- 四氧杂 -7， 20- 二氧代 - 二十二酯
将 1(150.9mg， 0.189mmol) 溶 解 于 无 水 DMF(5mL) 中， 接 着 添 加 哌 啶 (706μl， 7.14mmol) 至溶液中。搅拌反应混合物 2h， 此后在减压下蒸发溶剂和剩余哌啶， 产生粗中间 体。将此粗中间体 (36.3mg， 0.063mmol) 和 Fmoc-NH-(PEG)2-COOH 溶解于 DCM(1mL) 中且将 溶液冷却至 0℃。添加 EDC· HCl(18.2mg， 0.095mmol) 至溶液中。搅拌反应混合物 18h。使 粗产物进行快速柱色谱法 (DCM/MeOH 25 ∶ 1)， 产生标题化合物 (45.0mg， 71％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ1.28-1.57(m)， 1.87(s， 3H)， 1.90-1.96(m)， 2.01(s， 3H)， 2.02(s， 3H)， 2.13(s， 3H)， 2.13(s， 3H)， 2.42(t， 2H)， 2.53-2.58(m， 1H)， 3.17-3.27(m， 3H)， 3.38-3.40(m)， 3.55-3.62(m)， 3.68-3.78(m)， 4.02-4.10(m， 3H)4.21(t， 1H)， 4.29-4.33(m， 1H)， 4.40(d， 2H)， 4.79-4.86(m， 1H)， 5.19-5.22(m， 1H)， 5.29-5.32(m， 1H)， 5.37-5.44(m， 2H)， 6.37(t， 1H)， 7.28-7.32(m， 2H)， 7.39(t， 2H)， 7.60(d， 2H)， 7.76(d， 2H). +
C49H67N3O19(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1024.4266， 实测值为 1024.4921。
化 合 物 3- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 25- 二氮杂 -28-(9H- 芴 -9- 基 )-10， 13， 16， 19， 22， 28- 六氧杂 -7， 26- 二氧代 - 二十八酯
使用 Fmoc-NH-(PEG)4-COOH 代替 Fmoc-NH-(PEG)2-COOH， 以类似于化合物 2 的方式 合成以下化合物。
产量 83.4mg(61％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ1.27-1.57(m)， 1.86-2.04(m)， 2.13(s， 6H)， 2.43(t， 2H)， 2.53-2.58(m， 1H)， 3.17-3.24(m， 3H)， 3.36-3.40(m)， 3.55-3.62(m)， 3.68-3.77(m)， 4.02-4.11(m ， 3H) ， 4.21(t ， 1H) ， 4.29-4.32(m ， 1H) ， 4.39(d ， 2H) ， 4.79-4.85(m ， 1H) ， 5.23-5.25(m ， 1H) ， 5.29-5.32(m ， 1H) ， 5.36-5.40(m ， 1H) ， 5.48(t ， 1H) ， 6.47(t ， 1H) ， 7.28-7.32(m， 2H)， 7.37-7.41(m， 2H)， 7.60(d， 2H)， 7.75(d， 2H). +
C53H75N3O21(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1112.4791， 实测值为 1112.5548。
化 合 物 4- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 46- 二氮杂 -49-(9H- 芴 -9- 基 )-10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 48- 十三氧杂 -7， 47- 二氧代 - 四十九酯
使用 Fmoc-NH-(PEG)11-COOH 代替 Fmoc-NH-(PEG)2-COOH， 以类似于化合物 2 的方 式合成以下化合物。
产量 45.8mg(60％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ1.23-1.57(m)， 1.86(s， 3H)， 1.88-1.98(m)， 2.01(s， 3H)， 2.02(s， 3H)， 2.12(s， 6H)， 2.43(t， 2H)， 2.53-2.57(m， 1H)， 3.16-3.27(m， 3H)， 3.37-3.43(m， 2H) ， 3.54-3.62(m) ， 3.69-3.75(m) ， 3.75-3.77(m) ， 4.01-4.10(m) ， 4.20(t ， 1H) ， 4.28-4.32(m， 1H)， 4.34-4.39(m， 2H)， 4.78-4.85(m， 1H)， 5.24-5.31(m， 2H)， 5.35-5.39(m， 1H)， 5.43(t， 1H)， 6.50(t， 1H)， 7.27-7.31(m， 2H)， 7.36-7.40(m， 2H)， 7.58-7.63(m， 2H)， 7.74(d， 2H).
C67H103N3O28(M+Na)+ 的 HRMS 的计算值为 1420.6626， 实测值为 1420.7222。
化 合 物 5- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧 代 - 三 十 七 酯。 将 2(43.3mg， 0.043mmol) 溶 解 于 DMF(2mL) 中， 接 着 添 加 哌 啶 (162μL，1.63mmol)。搅拌反应混合物 2.5h。蒸发溶剂， 产生粗中间体。将此粗中间体等分成 2 个批 次。将来自一批次的粗中间体溶解于 DCM(1mL) 中， 接着添加硬脂酸 (9.1mg， 0.032mmol) 至 溶液中且将反应冷却至 0℃。添加 EDC·HCl(6.1mg， 0.032mmol) 至溶液中。搅拌反应混合 物 16h。用水 (2×5mL) 洗涤反应混合物， 经 MgSO4 干燥、 过滤、 且在减压下浓缩。使粗产物 进行急骤柱色谱法 (DCM/MeOH25 ∶ 1 → 20 ∶ 1)， 产生标题化合物 (6.3mg， 28％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.87(t， 3H)， 1.23-1.31(m)， 1.32-1.63(m)， 1.87(s， 3H)， 1.92-1.96(m)， 2.02(s， 3H)， 2.03(s， 3H)， 2.14-2.18(m)， 2.45(t， 2H)， 2.54-2.58(m， 1H)， 3.20-3.24(m， 3H)， 3.43-3.46(m， 2H)， 3.53-3.56(m， 2H)， 3.59-3.64(m)， 3.71-3.77(m)， 3.79(s ， 3H) ， 4.02-4.11(m) ， 4.30-4.34(m ， 1H) ， 4.79-4.86(m ， 1H) ， 5.20-5.22(m ， 1H) ， 5.29-5.32(m， 1H)， 5.36-5.41(m， 1H)， 6.13(t， 1H)， 6.42(t， 1H). +
C52H91N3O18(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1068.6195， 实测值为 1068.6290。
化 合 物 6- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二 氧代 - 四十三酯
使用 3 代替 2 以类似于化合物 5 的方式来合成以下化合物。
产量 14.2mg(52％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.88(t)， 1.25-1-42(m)， 1.46-1.67(m)， 1.79-1.83(m)， 1.88(s ， 3H) ， 1.91-1.97(m) ， 2.03 ， (s ， 3H) ， 2.04(s ， 3H) ， 2.10-2.19(m) ， 2.44-2.47(t ， 2H)， 2.54-2.60(m)， 3.18-3.33(m)， 3.42-3.46(m， 2H)， 3.54-3.56(m， 2H)， 3.61-3.65(m)， 3.71-3.77(m) ， 3.79(s ， 3H) ， 4.02-4.11(m ， 3H) ， 4.30-4.33(m ， 1H) ， 4.80-4.87(m ， 1H) ， 5.15.5.17(m， 1H)， 5.30-5.33(m， 1H)， 5.37-5.41(m， 1H)， 6.18(t， 1H)， 6.51(t， 1H). +
C56H99N3O20(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1156.6720， 实测值为 1156.7217。
化 合 物 7- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二氧杂 -7， 47- 二氧代 - 七十酯
使用 4 代替 2 以类似于化合物 5 的方式来合成以下化合物。
产量 6.0mg(42％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.88(t， 3H)， 1.25-1.42(m)， 1.46-1.63(m)， 1.88(s， 3H)， 1.90-2.00(m)， 2.03(s， 3H)， 2.04(s， 3H)， 2.10-2.18(m)， 2.45(t， 2H)， 2.54-2.59(m)， 3.18-3.33(m) ， 3.40-3.46(m ， 2H) ， 3.54-3.56(m ， 2H) ， 3.61-3.65(m) ， 3.71-3.79(m) ， 4.02-4.11(m)， 4.29-4.36(m， 1H)， 4.80-4.87(m， 1H)， 5.14-5.17(m， 1H)， 5.30-5.32(m， 1H)， 5.37-5.41(m， 1H)， 6.18(t， 1H)， 6.50(t， 1H)， +
C70H127N3O27(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1464.8555。实测值为 1464.8711。
化 合 物 8- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧 代 - 四十三酯
使用二十四酸代替硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合成以下化合 物。
产量 15.9mg(65％ )。 1
H NMR(400MHZ ，CDCl 3 ) δ 0.85-0.89(m) ， 1.15-1.41(m) ， 1.46-1.63(m) ，1.88-1.89(m)， 1.90-1.97(m)， 2.02(s， 3H)， 2.03(s， 3H)， 2.10-2.18(m)， 2.38-2.46(m)， 2.54-2.58(m) ， 3.19-3.32(m) ， 3.42-3.48(m ， 2H) ， 3.53-3.56(m ， 2H) ， 3.60-3.63(m) ， 3.71-3.79(m)， 4.03-4.11(m， 3H)， 4.30-4.34(m， 1H)， 4.80-4.86(m， 1H)， 5.19-5.21(m， 1H)， 5.30-5.32(m， 1H)， 5.37-5.41(m， 1H)， 6.14(t， 1H)， 6.42(t， 1H). +
C58H103N3O18(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1152.7134， 实测值为 1152.7108。
化 合 物 9- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二 氧代 - 四十九酯
使用 3 和二十四酸代替 2 和硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合成以下化合物。
产量 18.3mg(63％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.87(t， 3H)， 1.24-1.40(m)， 1.46-1.62(m)， 1.87(s， 3H)， 1.90-1.96(m)， 2.02(s， 3H)， 2.03(s， 3H)， 2.10-2.18(m)， 2.43-2.46(t， 2H)， 2.54-2.59(m)， 3.17-3.30(m) ， 3.41-3.45(m ， 2H) ， 3.53-3.56(m ， 2H) ， 3.60-3.64(m) ， 3.70-3.76(m) ， 3.78(s ， 3H) ， 4.02-4.11(m) ， 4.29-4.33(m ， 1H) ， 4.79-4.86(m ， 1H) ， 5.22-5.24(m ， 1H) ， 5.29-5.32(m， 1H)， 5.36-5.40(m， 1H)， 6.15(t， 1H)， 6.51(t， 1H)， C62H111N3O20(M+H)+ 的 HRMS 的计算值为 1218.7839， 实测值为 1218.7875。
化 合 物 10- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二氧杂 -7， 47- 二氧代 - 六十四酯
使用 4 和二十四酸代替 2 和硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合成以下化合物。
产量 6.2mg(41％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.86-0.89(m)， 1.25-1.44(m)， 1.46-1.63(m)， 1.88(s， 3H)， 1.90-1.99(m)， 2.02(s， 3H)， 2.04(s， 3H)， 2.10-2.18(m)， 2.41-2.47(m)， 2.54-2.58(m， 2H) ， 3.18-3.33(m) ， 3.42-3.48(m) ， 3.54-3.56(m) ， 3.61-3.65(m) ， 3.71-3.79(m) ， 4.02-4.11(m)， 4.29-4.35(m， 1H)， 4.80-4.87(m， 1H)， 5.16-5.18(m， 1H)， 5.30-5.32(m， 1H)， 5.37-5.41(m， 1H)， 6.20(t， 1H)， 6.51(t， 1H). +
C76H139N3O27(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1548.9494， 实测值为 1548.9514。
化 合 物 11- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧 代 -29， 31- 四十四烷二炔基酯
使用 10， 12- 二十五烷二炔酸代替硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合成以下化 合物。
产量 36.3mg(73％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.86(t， 3H)， 1.23-1.41(m)， 1.42-1.61(m)， 1.86(s， 3H)， 1.89-1.97(m)， 2.01(s， 3H)， 2.02(s， 3H)， 2.08-2.18(m)， 2.20-2.23(m)， 2.43(t， 2H)， 2.53-2.59(m ， 1H) ， 3.18-3.31(m) ， 3.4-3.44(m ， 2H) ， 3.52-3.55(m ， 2H) ， 3.59-3.62(m) ， 3.69-3.75(m) ， 3.77(s ， 3H) ， 4.01-4.10(m) ， 4.28-4.32(m ， 1H) ， 4.78-4.85(m ， 1H) ， 5.28-5.39(m， 3H)， 6.11(t， 1H)， 6.43(t， 1H). +
C59H97N3O18(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1158.6665， 实测值为 1158.6655。
化 合 物 12- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二 氧代 -35， 37- 五十烷二炔基酯
使用 3 和 10， 12- 二十五烷二炔酸代替 2 和硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合 成以下化合物。
产量 21.9mg(62％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.86(t， 3H)， 1.24-1.39(m)， 1.45-1.62(m)， 1.86(s， 3H) ， 1.92-1.95(m) ， 2.01(s ， 3H) ， 2.02(s ， 3H) ， 2.10-2.17(m) ， 2.20-2.24(m) ， 2.45(t ， 2H)， 2.53-2.59(m)， 3.17-3.31(m)， 3.41-3.45(m， 2H)， 3.53-3.55(m， 2H)， 3.61-3.64(m)， 3.70-3.76(m) ， 3.78(s ， 3H) ， 4.01-4.10(m) ， 4.28-4.35(m ， 1H) ， 4.78-4.85(m ， 1H) ， 5.26-5.31(m， 2H)， 5.35-5.40(m， 1H)， 6.19(t， 1H)， 6.52(t， 1H). +
C63H105N3O20(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1246.7189， 实测值为 1246.7118。
化 合 物 13- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6， 46- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十二氧杂 -7， 47- 二氧代 -56， 58- 七十一烷 - 二炔基酯
使用 4 和 10， 12- 二十五烷二炔酸代替 2 和硬脂酸以类似于化合物 5 的方式来合 成以下化合物。
产量 25.2mg(50％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.87(t， 3H)， 1.24-1.41(m)， 1.46-1.62(m)， 1.87(s， 3H) ， 1.90-2.02(m) ， 2.03(s ， 3H) ， 2.05(s ， 3H) ， 2.13-2.18(m) ， 2.21-2.24(m) ， 2.46(t ， 2H) ， 2.54-2.58(m ， 1H) ， 3.17-3.26(m) ， 3.42-3.49(m) ， 3.54-3.56(m) ， 3.62-3.65(m) ， 3.70-3.75(m) ， 3.79(s ， 3H) ， 4.02-4.11(m) ， 4.29-4.32(m ， 1H) ， 4.79-4.86(m ， 1H) ， 5.17-5.20(m， 1H)， 5.29-5.32(m， 1H)， 5.36-5.40(m， 1H)， 6.17(s， 1H)， 6.58(s， 1H). +
C77H133N3O27(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1554.9024， 实测值为 1554.9325。
化 合 物 14- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6- 氮杂 -7- 氧代 -16， 18- 三十一烷 - 二炔基酯
将 1(121.9mg， 0.153mmol) 溶解于 DMF(5mL) 中， 接着添加哌啶。在氮气氛围下搅 拌反应混合物 2h。蒸发溶剂， 产生粗中间体。将此粗中间体等分成 2 个批次。将来自所 述批次的 1 的粗中间体溶解于 DCM(1mL) 中， 接着添加 10， 12- 二十五烷二炔酸 (37.1mg， 0.099mmol) 至溶液中且将反应冷却至 0℃。添加 EDC· HCl(14.6mg， 0.076mmol) 至溶液中。 搅拌反应混合物 20h。 用 DCM 稀释反应混合物且用水 (3×5mL) 洗涤， 经 MgSO4 干燥、 过滤、 且 在减压下浓缩。 使粗产物进行急骤柱色谱法 (DCM/MeOH 25 ∶ 1)， 产生标题化合物 (47.8mg， 67％ )。根据 NMR， 其被 10， 12- 二十五烷二炔酸污染。 1
H NMR(400MHZ ，CDCl 3 ) δ 0.86(t) ， 1.23-1.35(m) ， 1.45-1.58(m) ， 1.86(s ， 3H) ， 1.90-1.93(m) ， 2.01(s ， 3H) ， 2.02(s ， 3H) ， 2.11-2.15(m) ， 2.22(t) ， 2.30(t ， 1H) ， 2.52-2.58(m ， 1H) ， 3.18-3.28(m) ， 3.70-3.73(m ， 1H) ， 3.77(s ， 3H) ， 4.00-4.08(m) ， 4.31-4.34(m， 1H)， 4.78-4.85(m， 1H)， 5.28-5.30(m， 1H)， 5.33-5.38(m， 2H)， 5.85(t， 1H). +
C50H81N2O14(M+H) 的 HRMS 的计算值为 933.5688， 实测值为 933.5718。
化 合 物 15- 甲 基 (5- 乙 酰 氨 基 -4， 7， 8， 9- 四 -O- 乙 酰 基 -3， 5- 二 脱 氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖基 ) 酸 6- 氮杂 -7- 氧代 - 二十二酯
使用 1 和十六烷酸代替 10， 12- 二十五烷二炔酸以类似于化合物 14 的方式来合成 以下化合物。
产量 37mg(48％ )。 1
H NMR(400MHZ， CDCl3)δ0.87(t， 3H)， 1.20-1.30(m)， 1.32-1.65(m)， 1.86(s， 3H)， 1.94(t， 1H)， 2.00-2.05(m)， 2.10-2.16(m)， 2.55(dd， 1H)， 3.15-3.30(m)， 3.72(dt， 1H)， 3.79(s， 3H)， 4.00-4.10(m)， 4.33(dd， 1H)， 4.79-4.87(m)， 5.15-5.20(m)5.30(dd， 1H)， 5.39(ddd， 1H)， 5.79(bt， 1H).
化合物 A-6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧代 - 三十七烷基 5- 乙酰 氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
将 5(6.0mg， 0.006mmol) 溶解于 NaOMe(600μL， 0.05M， 于 MeOH 中 ) 中。搅拌反应 2h， 接着添加 NaOH(30μL， 1M， 于水中 ) 至反应混合物中。搅拌反应混合物 24h， 接着用杜莱 特 C436(Duolite C436) 淬灭直到达到中性 pH 值。过滤反应混合物、 用 MeOH 冲洗且在减压 下浓缩。使粗产物进行快速柱色谱法 (DCM/MeOH/H2O 80 ∶ 15 ∶ 5) 以产生定量产量的标 题化合物。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t， 3H)， 1.29(m)， 1.36-1.42(m)， 1.48-1.60(m)， 1.89(m)2.01(s ， 3H) ， 2.20(t ， 2H) ， 2.43-2.46(m ， 2H) ， 2.81-2.85(m ， 1H) ， 3.17(t ， 2H) ， 3.35-3.37(m)， 3.45-3.89(m).
C43H81N3O14(M+Na)+ 的 HRMS 的计算值为 886.5616， 实测值为 886.5621。
化合物 B-6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 - 四十三烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 6 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 3.1mg(27％ )。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t， 3H)， 1.29-1.42(m)， 1.48-1.62(m)， 2.00(s， 3H)， 2.19(t， 2H)， 2.45(t， 2H)， 2.81-2.85(m， 1H)， 3.18(t， 2H)， 3.35-3.38(m)， 3.45-3.89(m). +
C47H89N3O16(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 951.6243， 实测值为。
化 合 物 C-6， 46- 二 氮 杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十 二 氧 杂 -7， 47- 二氧代 - 七十烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 --D- 半乳糖 -2- 壬基吡 喃糖酸
使用 7 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
定量产量。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t， 3H)， 1.29-1.42(m)， 1.48-1.60(m)， 2.01(s， 3H)， 2.19(t， 2H)， 2.45(t， 2H)， 2.81-2.85(m， 1H)， 3.18(t， 2H)， 3.33-3.37(m)， 3.45-3.89(m). +
C61H117N3O23(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1282.7976， 实测值为 1282.8201。
化合物 D-6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧代 - 四十三烷基 5- 乙酰 氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 8 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
定量产量。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t)， 1.29-1.42(m)， 1.48-1.60(m)， 2.01(s， 3H)，2.19(t， 2H)， 2.45(t， 2H)， 2.81-2.85(m， 1H)， 3.17(t， 2H)， 3.35-3.37(m)， 3.45-3.89(m). +
C49H93N3O14(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 970.6555， 实测值为 970.6328。
化合物 E-6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 - 四十九烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 9 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 14.8mg(95％ )。 1
H NMR(400MHZ ，MeOD) δ 0.90(t) ， 1.29-1.60(m) ， 2.01(s ， 3H) ， 2.19(t ， 2H) ， 2.45(t ， 2H) ， 2.81-2.84(m ， 1H) ， 3.12-3.19(m) ， 3.35-3.37(m) ， 3.47-3.87(m). + C53H101N3O16(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 1058.7080， 实测值为 1058.6575。
化 合 物 F-6， 46- 二 氮 杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十 二 氧 杂 -7， 47- 二氧代 - 六十四烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬 基吡喃糖酸
使用 10 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
定量产量。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t)， 1.29-1.40(m)， 1.49-1.59(m)， 2.00-2.01(s， 3H) ， 2.13-2.21(m) ， 2.45(t ， 2H) ， 2.81-2.85(m ， 1H) ， 3.12-3.19(m) ， 3.35-3.37(m) ， 3.45-3.88(m).
C67H129N3O23(M+Na)+ 的 HRMS 的计算值为 1366.8915， 实测值为 1388.9717。
化合物 G-6， 19- 二氮杂 -10， 13， 16- 三氧杂 -7， 20- 二氧代 -29， 31- 四十四烷 -4 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 11 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 22.4mg(73％ )。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(m)， 1.30-1.40(m)， 1.47-1.63(m)， 2.01(s， 3H)， 2.18-2.26(m)， 2.45(t， 2H)， 2.81-2.85(m， 1H)， 3.17(t， 2H)， 3.36(t， 2H)， 4.45-3.88(m). +
C50H87N3O14(M+Na) 的 HRMS 的计算值为 976.6086， 实测值为 976.5989。
化合物 H-6， 25- 二氮杂 -10， 13， 16， 19， 22- 五氧杂 -7， 26- 二氧代 -35， 37- 五十烷 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 12 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 16.6mg(84％ )。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t， 3H)， 1.27-1.40(m)， 1.47-1.63(m)， 2.01(s， 3H)， 2.12-2.26(m)， 2.45-2.48(m， 2H)， 2.81-2.85(m， 1H)， 3.10-3.23(m， 2H)， 3.35-3.38(m， 2H)， 3.45-3.88(m).
C54H95N3O16(M+Na)+ 的 HRMS 的计算值为 1064.6610， 实测值为 1064.6732。
化 合 物 I-6， 46- 二 氮 杂 -10， 13， 16， 19， 22， 25， 28， 31， 34， 37， 40， 43， 46- 十 二 氧 杂 -7， 47- 二氧代 -56， 58- 七十一烷 - 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘油 -α-D- 半 乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 13 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 17.2mg(98％ )。 1
H NMR(400MHZ ， MeOD) δ 0.90(t ， 3H) ， 1.30-1.40(m) ， 1.49-1.63(m) ， 2.01(s ，3H) ， 2.18-2.26(m) ， 2.46(t ， 2H) ， 2.81-2.85(m ， 1H) ， 3.18(t ， 2H) ， 3.35-3.38(m ， 2H) ， 3.45-3.88(m)
C68H123N3O23(M+Na)+ 的 HRMS 的计算值为 1372.8445， 实测值为 1372.8213。
化合物 J-6- 氮杂 -7- 氧代 -16， 18- 三十一烷 - 二炔基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱 氧 -D- 甘油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 14 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 24.2mg(63％ )。 1
H NMR(400MHZ， MeOD)δ0.90(t， 3H)， 1.30-1.41(m)， 1.47-1.62(m)， 2.03(s， 3H)， 2.18(t)， 2.24(t)， 2.80-2.84(m， 1H)， 3.14-3.18(m， 2H)， 3.45-3.90(m).C41H70N2O10(M+H)+ 的 HRMS 的计算值为 751.5103， 实测值为 751.4911。
化合物 K-6- 氮杂 -7- 氧代 -16， 18- 二十二烷基 5- 乙酰氨基 -3， 5- 二脱氧 -D- 甘 油 -α-D- 半乳糖 -2- 壬基吡喃糖酸
使用 15 代替 5 以类似于化合物 A 的方式来合成以下化合物。
产量 29mg( 定量％ )。 1
H N MR (400 MHZ ，MeOD ) δ 0.90(t ， 3H) ， 1.2 5 -1. 4 1(m ) ， 1. 4 6-1 . 63( m ) ， 1.85-1.95(m)， 2.02(s， 3H)， 2.17(t， 2H)， 2.83(dd， 1H)， 3.15(t， 2H)， 3.45-3.90(m). 聚集体 的形成及其随后在水溶液中的配制
经 由 探 头 型 声 波 震 荡 器 (50 ％ 输 出，微 小 尖 端 ) 或 由 Northern Lipids(Vancouver， BC， Canada) 制造的使用聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm 或 200nm) 的挤 出装置进行配制 ；
制剂 13( 无任何唾液酸残基的对照 )
在 DCM 中混合 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.7mg， 10μmol) 且放入玻璃瓶中。蒸发 溶剂且添加蒸馏水 (10mL)。混合物经探头声处理直至获得澄清溶液， 约 15 分钟。温热溶液 经由尼龙过滤器 (0.8μm) 过滤以移 除任何未分散脂质和来自探头的痕量钛粒子。
制剂 14H
使用化合物 H(0.1mg， 0.1μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.7mg， 9.9μmol) 以 类似于制剂 13 的方法进行配制。
制剂 15H
使用化合物 H(0.5mg， 0.5μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.6mg， 9.5μmol) 以 类似于制剂 13 的方法进行配制。
制剂 16H
使用化合物 H(1.0mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以
类似于制剂 13 的方法进行配制。
制剂 20J
使用化合物 J(0.75mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以类似于制剂 13 的方法进行配制。
制剂 24H
使 用 化 合 物 H(1.0mg， 1.0μmol)、 DPPC(3.3mg， 4.5μmol) 和 胆 固 醇 (1.7mg， 4.5μmol) 以类似于制剂 13 的方法进行配制。
制剂 41H
在 CHCl3 中混合化合物 H(2.1mg， 2.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.0mg， 8.0μmol) 且放入玻璃瓶中。 涡旋混合物且在氮气下蒸发溶剂， 在玻璃上产生脂质薄膜。 添 加 Milli-Q 水 (10mL) 且在 65℃下在搅拌下使混合物水合过夜。脂质体分散液接着通过挤 出装置在 Tm(65℃ ) 之上连续 (10 个循环 ) 通过聚碳酸酯膜滤器 (200nm 孔径 )。
制剂 42D
使用化合物 D(1.0mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。通过聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。 制剂 44F
使用化合物 F(1.3mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 47E
使用化合物 E(1.0mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 48B
使用化合物 B(1.0mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 49G
使用化合物 G(1.0mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 50I
使用化合物 I(1.4mg， 1.0μmol) 和 10， 12- 二十五烷二炔酸 (3.4mg， 9.0μmol) 以 类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 56H
使用化合物 H(1.0mg， 1.0μmol)、 s-PC/MCT(1.0mg/3.4mg) 以类似于制剂 41H 的方 法进行配制。在探头声处理 2 分钟后， 经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
制剂 59H
使用化合物 H(1.0mg， 1.0μmol) 和 s-PC(7.2mg， ～ 9.0μmol) 以类似于制剂 41H 的方法进行配制。经由聚碳酸酯膜滤器 ( 孔径 100nm) 挤出。
配制实施例 1
将化合物 H 和 PDA 分别以浓度 10.1mg/mL 和 3.41mg/mL 溶解于氯仿中。将所得溶 液储存于冰箱中。添加 100μL 化合物 A 溶液和 1mL PDA 溶液至 10mL 圆底烧瓶中。在 35℃
下在旋转蒸发仪 (Heidolph Laborota 4001， Germany) 上蒸发混合物至干燥。添加 10mL 膜 过滤水 (Milli-Q) 至所得干燥薄膜上。 将烧瓶放入声处理浴 (Bandelin Sonora Digitech， Germany) 中且在 50℃下声处理 10min 且在约 70℃下声处理 5min。这产生了略带粉色的不 透明均质分散液。
配制实施例 2
在水浴中将来自配制实施例 1 的分散液加热至约 80℃且经由孔径 100nm 的聚碳酸 酯膜 (Avestin LiposoFast， Canada) 挤出 11 次。将所得精细分散液转移至石英比色管中 且在室温下用 UV 光 (ICT Beam Boost Photoreactor， Germany) 照射 5min。此产生深蓝色 分散液。
配制实施例 3
如配制实施例 1 中所述来制备干燥脂质薄膜。添加 10mL 由 2.6％ (w/w) 甘油和 0.50％ (w/w) 羟丙甲纤维素 (Hypromellose， Sigma-Aldrich， H-3785) 组成的水溶液至所述 薄膜上。 在约 45℃下在声处理浴中水合 15min 后， 获得具有略微粘性的制剂， 其适于滴注入 眼中。
生物测试
本文中公开的化合物、 聚集体和制剂的生物活性在下文公开的各种测定法中加以 评估。
细胞
将 HCE( 人类角膜上皮 ) 细胞和 A549 细胞如先前所述生长 (Araki-Sasaki， K.， Ohasi， K.Y.， Sasabe， T.， Hayashi， K.， Watanabe， H.， Tano， Y.， Handa， H.， 1995.“An SV-40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. (SV-40- 永 生 化 的 人 角 膜 上 皮 细 胞 系 及 其 表 征 )” Invest.Ophtahlmol.36， 614-621 和 Arnberg， N.， Edlund， K.， Kidd， A.H.， Wadell， G.， 2000a.Adenovirus type 37 uses sialic acid as a cellular receptor(37 型腺病毒使用唾液酸作为细胞受体 ).J.Virol( 病毒学 杂志 ).74， 42-48.)。
病毒
如下所述产生 HAdV37( 病毒株 1477) 病毒粒子 ： 添加 0.3mL HAdV37 接种物质 ( 由 2 受感染的 A549 细胞制备 ) 至 A549 细胞中 (175em 烧瓶 ) 且在 37℃下孵育 2h。 通过洗涤移除 未内在化病毒， 且进一步在 37℃下在补充有 1％胎牛血清 (FCS ； Sigma-Aldrich) 的达尔伯 克氏改良伊格尔培养基 (Dulbecco′ s modified Eagle′ s Medium， DMEM ； Sigma-Aldrich) 中 孵育细胞。约 72h 后， 沉淀细胞， 再悬浮于 Tris-HCl(pH 7.4) 中且冻融三次。在另一 轮离心后， 将上清液装载至不连续 CsCl 梯度 ( 密度 ： 1.27g/mL、 1.32g/mL 和 1.37g/mL， 在 20mM Tris-HCl 中， pH 8.0 ； Sigma-Aldrich) 上且在 +4 ℃下在 25,000rpm 下 (SW41 转 子， Beckman Optima L-80XP 超速离心机 ； Beckman Coulter 公司 ) 离心 2.5h。收集病毒 粒 子 带 且 以 补 充 有 10 ％ 甘 油 (Sigma-Aldrich) 的 无 菌 PBS 缓 冲 液 在 NAP 柱 (Amersham Biosciences AB， Uppsala， Sweden) 上脱盐。接着将经等分的病毒粒子储存在 -80℃下直 到进一步使用。如上所述产生标记 35S 的 Ad37 病毒粒子， 除了感染后 20h， 使细胞在无甲 硫氨酸 - 半胱氨酸的 DMEM(Sigma-Aldrich) 中饥饿 2h。此后添加同位素 (1.4mCi/ 烧瓶 ； NEG-772Easytag 表达蛋白质标记混合物 ； Perkin-Elmer)。 感染后 23h 和 48h 添加 L- 半胱氨酸 ( 最终浓度 2mM ； Sigma-Aldrich ； )， 且感染后 37.5h 和 48h 添加 l- 甲硫氨酸 ( 最终浓度 1mM ； Sigma-Aldrich)。经标记病毒粒子的比放射性经测定为每个病毒粒子 4×10-6cpm。通 过用限制酶消化病毒 DNA 且与 HAdV-37 原型病毒株的已确定模式进行比较来确定 HAdV-37 的身分 (Wadell， G.， Sundell， G.， de Jong， J.C.， 1981.Characterization of candidate adenovirus 37 by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis of virion polypeptides and DNA restriction site mapping ( 通过病毒粒子多肽的 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳 和 DNA 限制性酶切图谱表征 37 型候选腺病毒 ).J.Med.Virol.( 医学和病毒学杂志 )7， 119-125.)。
抗体
如 先 前 所 述 来 制 备 兔 多 克 隆 抗 HAdV-37 血 清 (Wadell， G.， Allard， A.， Hierholzer， J.C.， 1999.Adenoviruses( 腺 病 毒 ).Murray， P.R.， Baron， E.J.， Pfaller， M.A.， Tenover， F.C.， Yolken， R.H.( 编 )， Manual of Clinical Microbiology( 临床微生 物学手册 )， 第 7 版 .ASM Press， Washington， 第 970-982 页 .)。
结合测定
用含有 0.05 ％ EDTA 的 PBS(PBS-EDTA ； Merck， Darmstadt， Germany) 分离粘附的 HCE 细胞且在 37℃下在生长培养基中恢复一小时。在洗涤后， 在 V 形 96 孔微定量板中预 5 沉淀 2×10 个 HCE 细胞， 接着再悬浮且在 4℃ 下在轻微搅拌下与每个细胞 104 个 35S 标记 的 HAdV-37 病毒粒子 ( 补充有不同浓度的测试化合物 ) 一起在 50μL pH 7.4 的结合缓冲 液 (BB ： 含有 1％牛血清白蛋白 [Roche AB， Stockholm， Sweden]、 青霉素 / 链霉素 [Gibco， Carlsbad， CA， USA] 和 HEPES[EuroClone， Milano， Italy] 的 DMEM) 中孵育。
在添加至细胞前， 象这样在 4℃下在轻微搅拌下用各种浓度的待测试聚集体在 96 孔培养板中预处理 HAdV-37 病毒粒子 1h。
又 一 小 时 后， 通 过 洗 涤 移 除 未 结 合 病 毒 粒 子， 且 用 Wallac 1409 闪 烁 计 数 器 (Perkin-Elmer) 测量细胞相关的放射性。
通过比较用不同浓度的测试聚集体处理的细胞的细胞相关放射性， 可确定 IC50。
在下表 1 中给出本文公开的一些制剂的测试结果。
表 1- 本文公开的制剂对 HAdV-37 病毒粒子与 HCE 细胞的结合的抑制
- 无抑制+ 在 50 至 100μM 下抑制大于 0％但小于 50％
++ 在 25 至 50μM 下有 50％抑制
+++ 在 5 至 25μM 下有 50％抑制
++++ 在 5μM 或小于 5μM 下有 50％抑制
如自表 1 所见， 本文公开的各种化合物和聚集体能够抑制 HAdV-37 病毒粒子与 HCE 细胞的结合。在此情形下， 应注意唾液酸的 IC50 为约 2-5mM。此外， 应注意当提及制剂 时， IC50 是指唾液酸残基在制剂中的浓度。
聚集测定法
将 35S 标记的 HAdV37 病毒粒子 ( 每孔 5×108 个 ) 与或不与制剂 16H( 含有 0.05mM 唾液酸残基 ) 一起在 +4℃下在 BB 中孵育。一小时后， 使用 Beckman Coulter Microfuge 22R 离心机 (Beckman Coulter 公司， Fullerton， CA， USA) 在不同速度 (1000rpm、 4000rpm、 7000rpm、 10,000rpm、 13,000rpm) 下离心样品。如上所述使用液体闪烁计数器测量上清液 ( 上层 90μL) 中和沉淀物 ( 下层 10μL) 中的放射性。
如自图 1 所见， 制剂 16H 使 HAdV37 聚集。S 表示上清液且 P 表示沉淀物。因此， 化 合物 H 是关于其唾液酸残基的多价物质。
感染性测定法
连同不同浓度的制剂 16H 一起在 +4℃下在 24 孔板中孵育未标记 HAdV-37 病毒粒 子 ( 每孔 4×108 个病毒粒子于 300μL BB 中 )。 1h 后， 将混合物添加到 24 孔板 (2×105 个细 胞 / 孔 ) 中的在载玻片上长成单层细胞的 HCE 细胞中且在冰上孵育。一小时后， 用 +4C 1％ SHEM( 补充有激素的上皮培养基 (Araki-Sasaki， K.， Ohasi， K.Y.， Sasabe， T.， Hayashi， K.， Watanabe， H.， Tano， Y.， Handa， H.， “An SV-40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization” (SV-40- 永生化的人角膜上皮细胞系及其表征 ) Invest.Ophtahlmol.1995， 36， 614-621)) 将孔洗涤三次以移除未结合病毒粒子， 且在 37℃ 下孵育 44h 以允许感染。 用磷酸盐缓冲盐水 (PBS， pH 7.4) 冲洗玻璃载玻片， 用甲醇 (99％ ) 固定， 且在室温下与兔多克隆抗 HAdV37 血清 ( 在 PBS 中稀释 1 ∶ 200) 一起孵育。一小时 后， 用 PBS 洗涤载玻片三次， 且在室温下与猪抗兔 FITC 标记的抗体 ( 用 PBS 稀释 1 ∶ 200) (DakoCytomation， Glostrup， Denmark) 一起孵育。用荧光封固介质 (DakoCytomation) 封 固载玻片且用免疫荧光显微镜 (Axioskop2， Carl Zeiss， Germany ； 10 倍放大 ) 检查。
如自图 2 和图 3 所见， 制剂 16H 显著抑制 HAdV-37 感染 HCE 细胞 ( 存在于聚集体 中的唾液酸残基的 IC50 为约 0.7μM)。