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本发明属于生物医药技术领域，本发明提供了microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用。本发明人首次应用实时荧光定量RT-PCR Taqman MGB探针法检测MicroRNA let-7e在40例食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平的差异，研究发现，MicroRNA let-7e在食道癌癌组织表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.0001），本发明证实在在食道癌癌组织中MicroRNA let-7e的表达水平明显要于癌旁组织表达，认为MicroRNA let-7e可以作为临床食道癌分子生物学诊断的分子生物学标记。本发明为临床诊断食道癌提供了新的、更精确、更及时的方法。

1.  microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用。

2.  根据权利要求1所述microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用，其特征在于，该试剂盒采用实时荧光定量RT-PCR方法。

microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用。
背景技术
食道癌是威胁人民健康的常见病多发病，我国是高发国家,大多数食道癌患者就诊时已处于晚期，即使手术切除，预后仍差,特别是中晚期失去手术机会，经过化疗后再复发转移者，治疗上很棘手。
microRNA分子是一类长约18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，在转录后调控基因表达，通过阻遏局部互补的microRNA的碱基配对的翻译而发挥作用，人类基因组可能存在1000多个microRNA基因，单个microRNA可调控200多个靶基因，约三分之一的蛋白编码基因受microRNA调控。多数的microRNA具有高度保守性、时序性、组织细胞特异性，受到发育和空间的调控，并参与细胞的分化、增殖、死亡。microRNA与多种肿瘤的存在密切相关，它的作用靶点可为抑癌基因，定位于扩增区，使其表达上调，发挥抑癌基因样作用，microRNA表达水平升高时，则阻止细胞的恶性转化；也可为癌基因，microRNA可用于肿瘤的诊治。let-7是目前研究最为广泛的microRNA之一，let-7在多种肿瘤，特别是肺癌中，表达是下调的，与肺癌预后呈正相关，提示let-7的功能抑制与肺癌的发生、发展密切相关。
Reinhart等首次在秀丽隐杆线虫(Celegans)发育后期发现let-7,是线虫时序性发育的关键性调控因子，在Celegans中，let-7家族长约21nt，它是从一个具有茎环折叠结构、70个核苷酸前体分子发展而来的，参与形态发生，表达决定了线虫从幼虫到成虫的形态转变，抑制let-7RNA的活性，则成虫期就会出现幼虫期的形态，即发育迟滞，Iet-7RNA在幼虫期表达上调将会导致发育早熟(Reinhart B J,Slack F J,Basson M,et al.The21-nucleotide let-7RNA regulates developmental timing in Caenorhabditis elegans[J].Nature,2000,403(6772):901-906.)。Johnson等在果蝇、D．melanogaster和人类等 有机体内也证实了let-7的存在，在野生动物，缝隙细胞存在细胞周期里，它们融合在一起并分泌表皮翼，具有时序上调作用的let-7microRNA是终止这些细胞在成虫期分化必不可少的小分子RNA(Johnson S M,Lin S Y,Slack F J.The time of appearance of the C.elegans let-7microRNA is transcriptionally controlled utilizing a temporal regulatory element in its promoter[J].Dev Biol,2003,259(2):364-379.)。
人类let-7家族成员大多定位于9、11、22号染色体上，目前发现人let-7家族有13种，包括let-7a-1,7a-2,7a-3,7b,7c,7d,7e,f7-1,7f-2,7g,7i,mir-98,和mir-202，和其它microRNA一样，由保守性前体分子发展而来，Pasquinelii等在对称包括人类、老鼠、小鸡、多毛环蠕虫和苍蝇等在内的研究中发现，let-7几乎是100％的保守，而且作为含有21个核苷酸的小RNA分子表达出来，let-7和其它microRNAs一样具有组织特异性(Pasquinelli A E,Reinhart B J,Slack F,et al.Conservation of the sequence and temporal expression of let-7heterochronic regulatory RNA[J].Nature,2000,408(6808):86-89.)。
microRNALet-7在众多恶性肿瘤中表达下调，包括肺癌(Wang Q Z,Xu W,Habib N,et al.Potential uses of microRNA in lung cancer diagnosis,prognosis,and therapy[J].Curr Cancer Drug Targets,2009,9(4):572-594.)，胰腺癌(Torrisani J,Bournet B,du Rieu M C,et al.let-7MicroRNA transfer in pancreatic cancer-derived cells inhibits in vitro cell proliferation but fails to alter tumor progression[J].Hum Gene Ther,2009,20(8):831-844.)，结肠癌(Akao Y,Nakagawa Y,Naoe T.let-7microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells[J].Biol Pharm Bull,2006,29(5):903-906.)，乳腺癌(Yu F,Yao H,Zhu P,et al.let-7regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells[J].Cell,2007,131(6):1109-1123.)，子宫平滑肌瘤(Peng Y,Laser J,Shi G,et al.Antiproliferative effects by Let-7repression of high-mobility group A2in uterine leiomyoma[J].Mol Cancer Res,2008,6(4):663-673.)，被证实为肿瘤抑制基因。
let-7通过与原癌基因RAS、HMGA2和c-MYC的3’UTR结合，负调控靶标基因的表达，抑制肿瘤的发生发展(Sampson V B,Rong N H,Han J,et al.MicroRNA let-7a down-regulates MYC and reverts MYC-induced growth in Burkitt lymphoma cells[J].Cancer Res,2007,67(20):9762-9770.)。
Iorio等发现乳腺癌患者有淋巴结转移或高增殖指数的病例中let-7的表达水平较低，提示let-7的低水平和预后较差存在一定关联，这些结果都表明,let-7 在肿瘤组织中起了肿瘤抑制因子的作用(Iorio M V,Ferracin M,Liu C G,et al.MicroRNA gene expression deregulation in human breast cancer[J].Cancer Res,2005,65(16):7065-7070.)。Johnson等用微阵列分析经let-7microRNA作用的细胞，let-7能直接或间接作用于细胞周期基因，把转染有pre-let-7的人肝癌细胞用流式细胞仪分析，显示G_o～G₁的肝癌细胞比例显著提高，说明let-7阻断和延迟了GI～S期的转变，有效地抑制了癌细胞增殖，其作用可能是通过抑制细胞周期蛋白A2、CDC34、E2F5转录因子CDK8和PLAGL2等实现的(Johnson C D,Esquela-Kerscher A,Stefani G,et al.The let-7microRNA represses cell proliferation pathways in human cells[J].Cancer Res,2007,67(16):7713-7722.)。Akao等分析结肠癌组织和结肠癌细胞株中let-7的表达状况，发现6例结肠癌组织中2例let-7表达水平下调，3个结肠癌细胞株中有1株let-7表达水平下调。将let-7低水平表达的结肠癌细胞株DLD-1转染pre let-7a-1后，细胞增殖受抑制，在肺癌组织和肺癌A549细胞株中，1et-7表达均显著减低，将let-7a和let-7f转染人A549细胞株中，细胞增殖受到抑制，let-7f的抑制作用更为显著(Akao Y,Nakagawa Y,Naoe T.let-7microRNA functions as a potential growth suppressor in human colon cancer cells[J].Biol Pharm Bull,2006,29(5):903-906.)。Fang等选取8对大肠癌组织和周围正常组织，发现其中2例癌组织中let-7a表达水平较周围正常组织明显降低，降低幅度达90％左右(Fang W J,Lin C Z,Zhang H H,et al.Detection of let-7a microRNA by real-time PCR in colorectal cancer:a single-centre experience from China[J].J Int Med Res,2007,35(5):716-723.)。Lu等发现在卵巢癌中let-7a-3的表达水平显著下降，这可能与其甲基化有关(Lu L,Katsaros D,de la Longrais I A,et al.Hypermethylation of let-7a-3in epithelial ovarian cancer is associated with low insulin-like growth factor-II expression and favorable prognosis[J].Cancer Res,2007,67(21):10117-10122.)。Varnholt等发现Let-7g在HCV阳性的肝癌患者癌组织中较其癌旁高表达(Varnholt H,Drebber U,Schulze F,et al.MicroRNA gene expression profile of hepatitis C virus-associated hepatocellular carcinoma[J].Hepatology,2008,47(4):1223-1232.)。李明等发现let-7在肾透明细胞癌中表达升高(李明.肾癌患者肾癌组织microRNA差异表达及可能的临床意义[D].中山大学,2009.)。
Chin等从74个NSCLC病例的KRAS3’-UTR区中获得let-7互补位点(LCS)序列，以观察变异和单碱基多态性(SNP)与NSCLC的关系，发现LCS6这一多 态位点变异型在NSCLC患者中的比例显著高于人群比例，并证实这一多态位点是NSCLC易感性的又一重要因素，表明这一位点的变异可降低let-7的癌症抑制因子之作用，从而导致发病率升高，而体外实验中亦发现LCS6变异型KRAS过表达(Chin L J,Ratner E,Leng S,et al.A SNP in a let-7microRNA complementary site in the KRAS3′untranslated region increases non-small cell lung cancer risk[J].Cancer Res,2008,68(20):8535-8540.)。
Takamizawa等首次发现超过60％的肺癌组织和肺癌细胞株中hsalet-7表达显著降低(超过80％)，并且hsalet-7表达水平低的患者手术治疗后的预后较差，进一步体外实验发现has let-7瞬时高表达能够抑制肺癌细胞系A549的生长，随后的大量研究证实细胞内let-7水平的降低与肺癌的发生发展密切相关(Takamizawa J,Konishi H,Yanagisawa K,et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival[J].Cancer Res,2004,64(11):3753-3756.)。Boyerinas等发现胚胎末期let-7基因家族表达上调，通常在肿瘤早期下调，let-7家族表达减低在非小细胞肺癌中尤为多见。Inamura等针对15例早期支气管肺泡癌(BACs)(通常认为是原位腺癌)、26例高分化侵袭性腺癌、25例侵袭性腺癌的研究发现相对于正常肺组织，BACs的let-7低表达发生率达87％(13／15)，全部病例的发生率为79％(52／66)，let-7低表达在肺癌早期即发生。Landi等应用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)方法发现所有let-7家族miRNA在鳞癌中的表达是下降的，并和组织学类型和死亡率有明显相关性。
Guan等对肺癌细胞株A549进行了miRNA let-7a2功能分析，let-7a2结合于启动子起始区发挥着重要的调控因子样的作用，小鼠肝癌细胞增殖特性在经过hsa-let-7g转染后受到抑制，hsa-let-7g如同抑癌基因一样通过降低癌基因c-Myc活性，提高抑癌基因p16(INK4A)的作用抑制肝癌细胞增殖(Guan H,Zhang P,Liu C,et al.Characterization and functional analysis of the human microRNA let-7a2promoter in lung cancer A549cell lines[J].Mol Biol Rep,2011,38(8):5327-5334.Lan F F,Wang H,Chen Y C,et al.Hsa-let-7g inhibits proliferation of hepatocellular carcinoma cells by downregulation of c-Myc and upregulation of p16(INK4A)[J].Int J Cancer,2011,128(2):319-331.)。
在乳腺癌细胞中，LIN28增加肿瘤细胞活性，去抑制发生变异miRNA let-7a,let-7c,let-7d,let-7f的功能(Wendler A,Keller D,Albrecht C,et al.Involvement of let-7/miR-98microRNAs in the regulation of progesterone receptor membrane  component1expression in ovarian cancer cells[J].Oncol Rep,2011,25(1):273-279.)。
在胃癌细胞株GC9811-P及SGC7901-M中，let-7f抑制胃癌的侵袭和转移，可以做为胃癌基因靶向治疗(Sakurai M,Miki Y,Masuda M,et al.LIN28:Aregulator of tumor-suppressing activity of let-7microRNA in human breast cancer[J].J Steroid Biochem Mol Biol,2011.)。增加let-7c的表达可以抑制膀胱肿瘤细胞的生长(Liang S,He L,Zhao X,et al.MicroRNA let-7f inhibits tumor invasion and metastasis by targeting MYH9in human gastric cancer[J].PLoS One,2011,6(4):e18409.)。
目前尚无有关microRNAlet-7e在食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平研究的相关文献报道，更无microRNAlet-7e可用于诊断食道癌的相关文献报道。
发明内容
本发明的目的在于提供制备microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用。
本发明提供了microRNAlet-7e在制备食道癌诊断试剂盒中的应用。
本发明采用实时荧光定量RT-PCR研究let-7e在食道癌中癌组织及癌旁组织表达水平的差异，研究分析其功能，发现microRNAlet-7e在食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平的差异，发现在癌组织中表达水平高于癌旁组织。
本发明所用microRNAlet-7e的实时荧光定量RT-PCR的GB探针是购自ABM公司。
本发明人首次应用实时荧光定量RT-PCR Taqman MGB探针法检测MicroRNA let-7e在40例食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平的差异，研究发现，MicroRNA let-7e在食道癌癌组织表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.0001），本发明证实在在食道癌癌组织中MicroRNA let-7e的表达水平明显要于癌旁组织表达，认为MicroRNA let-7e可以作为临床食道癌分子生物学诊断的分子生物学标记。
本发明为临床诊断食道癌提供了新的、更精确、更及时的方法。
具体实施方式
现结合实施例，对本发明作进一步描述，但本发明的实施并不仅限于此。
下述实施例如无特殊说明所用方法均为常规方法。
实施例1：microRNAlet-7e在15例食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平的差异
组织标本收集与处理：患者肿瘤组织标本及其对应的癌旁组织（离癌组织＞1cm）组织样本手术后30分钟内液氮冷冻后保存于-70℃冰箱待检。
仪器和试剂：荧光PCR引物及探针使用Primer Express软件(AB)设计，试剂采用的是AB（美国）公司的TaqManMicroRNA Assays、TaqManMicroRNA Reverse Transcription Kit、TaqManUniversal PCR Master Mix等试剂试剂盒，MicroRNAlet-7e TaqManMGB引物及探针由AB公司合成。
RNA提取：癌组织及癌旁组织总RNA分离采用mirVana miRNA Isolation Kit(AB)；
逆转录反应：7.00μl总反应体系轻轻混匀，稍微离心，用前置于冰上。每个样品取5.0μl RNA与7.0ul RT-MIX混合，然后加入3.0ul5×RT PRIMER，轻轻混匀。按照16℃30min,42℃30min,85℃,5min,4℃条件进行反转录。
荧光定量PCR：以看家基因U6snRNA做为内参，反应体系为20μL(1.33μL RT product,1.0μL of20×TaqMan miRNA Assay Mix,10.0μL of2×TaqMan PCR Master Mix,and7.67μL nuclease-free water),使用基于分析系统软件sds2.3的实时定量PCR仪ABI7900HT，对癌组织及癌旁组织进行内参基因及目标基因MicroRNAlet-7e按照95℃10min预变性，95℃15secs，60℃60secs荧光检测一次，共40个循环进行PCR扩增，得到相应Ct值。
以癌旁组织做为对照，以看家基因U6snRNA做为内参，应用ΔΔCt计算出癌组织MicroRNA let-7e的表达水平比癌旁组织高（10.54±5.50）倍，差异有统计学意义（P＜0.0001）。MicroRNA let-7e表达水平与患者性别、组织学类型、淋巴转移、分化程度、分期无统计学差异。（见表1）
表1MicroRNA let-7e在患者癌组织及癌旁组织Real-time Fluorescent Quantitative PCR结果表


实验结果讨论：
MicroRNA是长约18～25个核苷酸的非编码小分子RNA，具有高度保守性、组织细胞特异性、时序性、受到发育和空间的调控，参与细胞的分化、增殖、死亡，与多种肿瘤的存在密切相关，作用靶点可为抑癌基因，定位于扩增区，使表达上调，发挥抑癌基因作用；microRNA表达水平升高时，阻止细胞的恶性转化,MicroRNA用于肿瘤的诊治。于转录后水平调控基因表达，阻遏局部互补的microRNA的碱基配对的翻译，人基因组存在1000多个microRNA基因，单个microRNA可同时调控200多个靶基因，三分之一的蛋白编码基因受到microRNA调控。
人类MicroRNAs let-7家族由13个成员组成，包括let-7a-1,7a-2,7a-3,7b,7c,7d,7e,f7-1,7f-2,7g,7i,mir-98,和mir-202等。MicroRNAlet-7家族是由Reinhart等首次在秀丽隐杆线虫(Celegans)发育后期发现,是线虫时序性发育的关键性调控因子，在Celegans中，长约21nt，从具有茎环折叠结构、70个核苷酸前体分子发展而来的，参与细胞形态发生，表达，决定线虫从幼虫到成虫的形态转变，抑制let-7RNA的活性，let-7RNA在幼虫期表达上调将会导致发育早熟。
研究发现，microRNAlet-7e在众多癌组织中表达升高，李明等发现microRNAlet-7e在肾透明细胞癌中表达升高。Varnholt等在HCV阳性的肝癌患者MicroRNAlet-7g在癌组织中较其癌旁组织表达高。Hisaoka等发现microRNAlet-7e在滑膜肉瘤组织中高表达，microRNAlet-7e反义miRNA能抑制滑膜恶性肉瘤细胞生长增殖，证实microRNAlet-7e具有潜在的致癌基因样作用。另外，microRNAlet-7e在甲状腺乳头状癌患者血浆表达水平增高， 被认为可以作为甲状腺乳头状癌诊断特异性和敏感性较高的的分子生物学标记。microRNAlet7-e在视网膜母细胞瘤中同样高表达，microRNAlet-7e可以作为非小细胞肺癌诊断的分子生物学指标。
本发明人首次应用实时荧光定量RT-PCR Taqman MGB探针法检测MicroRNA let-7e在40例食道癌癌组织及癌旁组织中表达水平的差异，研究发现，MicroRNA let-7e在食道癌癌组织表达水平明显高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.0001），进一步证实在在食道癌癌组织中MicroRNA let-7e的表达水平明显要于癌旁组织表达，认为MicroRNA let-7e可以作为临床食道癌分子生物学诊断的分子生物学标记。
实施例2：
收集60例我院食道癌入院手术患者，取癌及癌旁组织（两者距离＞3cm）新鲜组织，患者手术后新鲜组织标本分别取癌组织和癌旁组织（远离癌组织至少3cm），液氮冷冻后保存于-70℃低温冰箱保存待检。收集患者一般信息，术后病理，按照国际食道癌研究协会制定的食道癌分期，进行临床分期。
应用实时定量RT-PCR(qRT-PCR)方法（MGB探针法）检测let-7e MiRNA的表达水平。
统计分析：采用SPSS17.0统计软件进行分析，癌组织及癌旁组织分别同时进行内参基因U6snRNA及MicroRNAlet-7e扩增,分别q–PCR三次，得出Ct值均值，以癌旁组织为对照，应用ΔΔCt法计算癌组织对比癌旁组织microRNAlet-7e表达相差倍数，得出结果，应用T检验分析microRNAlet-7e表达差异在不同性别，与吸烟史、影像学分型、肿瘤大小、淋巴转移、组织学类型、分化程度、分期之间的关系。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。