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1、(10)申请公布号 CN 102776229 A (43)申请公布日 2012.11.14 C N 1 0 2 7 7 6 2 2 9 A *CN102776229A* (21)申请号 201210263008.8 (22)申请日 2012.07.26 C12N 15/82(2006.01) C12N 15/84(2006.01) A01H 5/00(2006.01) (71)申请人首都师范大学 地址 100048 北京市海淀区西三环北路105 号 (72)发明人崔素霞 何奕騉 路铁刚 李利 张治国 陈希 李幼英 蔺平亮 (74)专利代理机构北京纪凯知识产权代理有限 公司 11245 代理人关。
2、畅 任凤华 (54) 发明名称 苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植 物抗旱性中的应用 (57) 摘要 本发明公开了一种苔藓PpDHN-31蛋白及其 编码基因在提高植物抗旱性中的应用。实验证明， 转PpDHN-31基因株系与转空载体对照株系和野 生型水稻日本晴（WT）植株相比，具有抗渗透胁迫 能力，且在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重 干旱，复水30天后的植株存活率达92.9%100%， 明显高于转空载体对照株系植株和野生型水稻 日本晴（WT）的27.3%；经上述开花灌浆期干旱处 理后转PpDHN-31基因各株系主茎单穗总粒重为 9.720.5克，而野生型对照平均为1.1克。本发 明。
3、为培育抗旱植物提供了一种新的途径，在农业 领域具有广阔的应用空间和市场前景。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书5页 序列表6页 附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 5 页 序列表 6 页 附图 4 页 1/1页 2 1.序列表序列1所示蛋白在提高目的植物耐旱性中的应用。 2.一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列1所示蛋白的编码基因导入目的植物 中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述序列表序列1所示蛋白的编码基因 为如下1）或2）或3）或4）的基因： 1）其核苷酸。
4、序列是序列表序列2所示的DNA分子； 2）其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA分子； 3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有 85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子； 4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示蛋白 的DNA分子。 4.根据权利要求1-3中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述目的植物为单子叶 植物或双子叶植物。 5.根据权利要求4所述的应用或方法，其特征在于：所述单。
5、子叶植物为水稻。 权 利 要 求 书CN 102776229 A 1/5页 3 苔藓 PpDHN-31 蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的 应用 技术领域 0001 本发明涉及一种苔藓PpDHN-31蛋白及其编码基因在提高植物抗旱性中的应用。 背景技术 0002 干旱严重制约植物的生长发育,常常造成各类农作物的大规模减产。在有限的水 资源供给下，选择种植高耐逆性作物非常必要。分子育种是培育高耐逆性作物的一种行之 有效的方法。该方法中最关键的技术瓶颈问题是有效抗旱基因的筛选与功能发现。 0003 苔藓植物是5亿年前出现的陆地先锋植物，生活史中配子体阶段较长，为主要营 养组织。在配子体阶段，以具。
6、有假根、茎、叶的“茎叶体”为主。“茎叶体”叶片由单层细胞组 成，仅在其“中肋”处由少数几层细胞组成，无输导组织和气孔等调控水分代谢的组织结构， 保留着明显的水生植物的特征。由于缺乏水分输导和调控系统，因此，当原始“苔藓植物”离 水登陆时，必然首先面对两大胁迫：水分亏缺、温度骤变。巨大的选择压力迫使苔藓植物进 化出不同于维管植物（蕨类、种子植物）的干旱应对机制。事实表明：苔藓植物的抗旱性远 远高于维管植物，其细胞内的一些基因承担着应对严重干旱的责任。实验已经证明，这些基 因可以保护细胞在脱水80%时免于干旱伤害。因此，这些苔藓基因是抗旱作物分子育种的 重要“候选分子”。 发明内容 0004 本发。
7、明的一个目的是提供苔藓PpDHN-31蛋白的新用途，该蛋白质的氨基酸序列 如序列表序列1所示，所述新用途为序列表序列1所示蛋白可用于提高植物耐旱性，或提高 序列表序列1所示蛋白表达量的物质或方法可用于提高植物耐旱性。 0005 本发明的另一个目的是提供一种提高植物耐旱性的方法，是将序列表序列1所示 蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐旱性高于所述目的植物的转基因植物。 0006 在上述方法中，所述序列表序列1所示蛋白的编码基因为如下1）或2）或3）或4） 的基因： 0007 1）其核苷酸序列是序列表序列2所示的DNA分子； 0008 2）其核苷酸序列是序列表序列2中第62-934位所示的DNA。
8、分子； 0009 3）与1）或2）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具 有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有 99%同一性且编码序列表序列1所示蛋白的DNA分子； 0010 4）在严格条件下与1）或2）或3）限定的DNA序列杂交且编码序列表序列1所示 蛋白的DNA分子。 0011 序列表序列2的核苷酸序列长1008bp，是苔藓PpDHN-31蛋白的部分cDNA序列，序 列表序列2中第62-934位为开放阅读框，编码序列表序列1所示的苔藓PpDHN-31蛋白。 0012 所述严格条件可为如下：50，在。
9、7十二烷基硫酸钠（SDS）、0.5M Na3PO4和1mM 说 明 书CN 102776229 A 2/5页 4 EDTA的混合溶液中杂交，在50，2SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50，在7SDS、0.5M Na 3 PO 4 和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50，1SSC，0.1% SDS中漂洗；还可为：50，在 7 SDS、0.5M Na 3 PO 4 和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50，0.5SSC，0.1% SDS中漂洗； 还可为：50，在7 SDS、0.5M Na 3 PO 4 和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50，0.1SSC， 0.1% SDS中漂洗。
10、；还可为：50，在7 SDS、0.5M Na 3 PO 4 和1mM EDTA的混合溶液中杂交， 在65，0.1SSC，0.1%SDS中漂洗；也可为：在6SSC，0.5%SDS的溶液中，在65下杂交， 然后用2SSC，0.1% SDS和1SSC，0.1% SDS各洗膜一次。 0013 在上述方法中，所述目的植物为单子叶植物或双子叶植物。 0014 在上述方法中，所述单子叶植物为水稻。 0015 实验证明，3个转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10的水稻幼苗在 含15%PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基中(模拟轻度干旱)处理2天，再转移至含 25%PEG-。
11、8000的1/2 Hogland液体培养基中(增加干旱强度)继续处理3天，复水5天 后可以恢复正常生长，而转空载体对照株系和野生型水稻日本晴（WT）植株大部分不能恢 复生长；在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干旱，复水30天后的植株存活数分别为 92.9%、100%和100%，而转空载体对照株系植株和野生型水稻日本晴（WT）的存活率均为 27.3%；经上述开花灌浆期的干旱处理后转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10的主 茎单穗总粒重分别为9.7、12.6和20.5克，而野生型对照平均为1.1克。本发明为培育抗 旱植物提供了一种新的途径，在农业领域具有广阔的应用空间和市。
12、场前景。 附图说明 0016 图1为小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体的荧光差异凝胶电泳（DIGE）图 谱。其中，图A为对照未经干旱处理，图B为经过干旱处理。 0017 图2为重组载体pCU-PpDHN-31的T-DNA片段结构示意图。其中，LB和RB分别 代表左边界和右边界，Hygromycin为潮霉素磷酸转移酶基因，35S为花椰菜病毒的启动子， Ubiquitin为玉米泛素启动子，PpDHN-31为插入的目的基因。 0018 图3为转PpDHN-31株系的PCR电泳图。其中，M为Marker，从上到下的片段依次 为2000bp、1000bp、750bp、500bp。
13、和250bp。 0019 图4为转PpDHN-31株系幼苗期的株高统计结果。 0020 图5为转PpDHN-31株系幼苗期的耐渗透胁迫结果。其中，图A为未经PEG-8000 处理的对照结果，图B为经过PEG-8000处理结果。 0021 图6为转PpDHN-31株系成熟期的株高统计结果。 0022 图7为转PpDHN-31株系成熟期的植株生长状态。 0023 图8为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的存活率统计结果。 0024 图9为成熟期的转PpDHN-31株系耐旱性的主茎单株总粒重统计结果。 0025 图39中，WT为野生型水稻日本晴，L11-6、L14-7、L14-10分别代表3个转 。
14、PpDHN-31的株系。 具体实施方式 0026 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 说 明 书CN 102776229 A 3/5页 5 0027 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 0028 小立碗藓（Physcomitrella patens）：Cui et al.Proteome analysis of Physcomitrella patens exposed to progressive dehydration and rehydration. Journal of Experimental Botany,2012,63(2):。
15、711-726；公众可从首都师范大学获得。 0029 水稻品种日本晴（Oryza sativa L.sppjaponica，cv.Nipponbare）：Goff et al.A Draft Sequence of the Rice Genome(Oryza sativa L.ssp.japonica). Science.2002,296:92-100；公众可从首都师范大学获得。 0030 根癌农杆菌LBA4404（Agrobacterium tumefaciens strain LBA4404）：中国质粒 载体菌株细胞株基因保藏中心（Biovector Scicnce Lab Inc.）. 。
16、0031 实施例1、苔藓抗旱相关蛋白PpDHN-31及其编码基因的获得 0032 将生长在BCD培养基上的小立碗藓（Physcomitrella patens）茎叶体转移至浸湿 的滤纸上，放入500ml烧杯中，用吸水纸封口。在温度241，相对湿度305%的培养室 内进行干旱处理，3天后，取出干旱的茎叶体利用酚抽提法进行蛋白质提取，以未经干旱处 理在正常条件下生长的茎叶体为对照。来自正常条件下和干旱条件下的蛋白质通过荧光差 异凝胶电泳（DIGE）分离（具体步骤按照Amersham Bioscience提供的实验操作指南进行）， 获得的蛋白质图谱用DeCyder 2D Software，Versi。
17、on 6.5（Amersham Bioscience）进行分 析。 0033 结果在干旱条件下有5个蛋白点在荧光差异凝胶电泳（DIGE）图谱中分别上调 3.75、3.01、2.90、1.94、1.59倍（图1）。将这5个蛋白点分别用胰蛋白酶处理，经质谱仪 （MALDI TOF/TOF MS）和数据库（NCBI，小立碗藓基因组）鉴定后确认它们来自于同一个基 因。该基因被命名为PpDHN-31，其编码的蛋白质命名为PpDHN-31。 0034 根据基因序列设计引物，以获得全长的cDNA。首先提取经上述干旱处理后的小立 碗藓茎叶体总RNA，将RNA用逆转录酶合成cDNA。根据上述检索获得基因的CDS。
18、序列设计 引物如下：5-GGGGTACCACCGCATCCTGACATTT-3（下划线部分碱基为Kpn I识别序列）和 5-CGCGGATCCACAACCGCATACACACA-3（下划线部分碱基为BamH I识别序列）。以反转录得 到的cDNA为模板，进行PCR扩增,对PCR产物进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，得到分子量 约为1kb的条带，与预期结果相符。用琼脂糖凝胶回收试剂盒（TIANGEN）回收该片段。将 该回收片段与pMD19-T Simple（Takara）连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5感受态细 胞，根据pMD19-T Simple载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有。
19、回收片段 的重组质粒。以该重组质粒载体上的通用引物M13对其进行核苷酸序列测定，测序结果表 明扩增得到序列表序列2所示的1008bp序列（命名PpDHN-31），其开放阅读框(ORF)为序列 表中序列2的自5末端第62至934位脱氧核糖核苷酸，编码序列表序列1所示的蛋白质 PpDHN-31。 0035 实施例2、转PpDHN-31基因培育耐旱植物 0036 1、表达目的基因的重组载体构建 0037 将序列表中序列3所示的玉米Ubiquitin启动子插入植物双元表达载体 pCAMBIA1390（Cambia）的Hind和Pst位点间，构成中间载体pC1390-Ubi。将实施例1 PCR扩增获得约。
20、为1kb的DNA片段用Kpn I和BamH1双酶切，正向插入中间载体pC1390-Ubi 的Kpn I和BamH 位点间（插入的基因刚好位于Ubiquitin启动子后），得到重组载体。将 说 明 书CN 102776229 A 4/5页 6 经测序证实含有序列表中序列2的自5末端第1-1008位脱氧核糖核苷酸的PpDHN-31基 因的重组载体命名为pCU-PpDHN-31（其T-DNA片段的结构示意图如图2所示）。该载体具 有卡那霉素和潮霉素两个筛选标记。 0038 2、转PpDHN-31基因植株的获得和鉴定 0039 将pCU-PpDHN-31载体用电击法转入根癌农杆菌LBA4404（Agr。
21、obacterium tumefaciens strain LBA4404）中。挑取阳性克隆28培养。待农杆菌浓度达到OD600值 为0.1200.140之间时，用该菌液侵染水稻品种日本晴（Oryza sativa L.sppjaponica， cv.Nipponbare）愈伤组织，侵染30min，期间不时用手轻摇。将愈伤组织转移到共培养培养 基上，避光共培养34d。共培养结束后，将愈伤组织转移到选择培养基上培养1015d 后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的潮霉素抗性愈伤组织，转移到预分化 培养基上，28黑暗下预分化培养7d。选择奶白色、表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基 上，28。
22、分化培养：先在黑暗下培养3d，然后在持续冷光照下培养1520d。将从抗性愈伤 组织再生出的幼苗转移到根诱导培养基上，持续光照培养15d，生长状况良好的幼苗直接转 移到大田种植。当年秋季收获转基因水稻种子。 0040 种子收获后，播于含潮霉素（30mg/L）的MS筛选培养基上筛选。待T1代植株长至 4-6叶时移到大田中生长。将T1代单株收获后，各单株种子分别播种，用潮霉素继续筛选以 观察T2代的分离情况，如此重复数代直至获得稳定的转PpDHN-31株系。 0041 按照获得转PpDHN-31株系的方法将空载体pC1390-Ubi导入水稻品种日本晴（Or yza sativa L.sppjapon。
23、ica，cv.Nipponbare）中，制备得到稳定的转空载体对照株系。 0042 3、转PpDHN-31株系植株的PCR鉴定 0043 选择稳定遗传的转PpDHN-31株系中的3个株系（L11-6,L14-7和L14-10），进 行PCR验证。用CTAB法提取水稻基因组DNA，使用正向引物（5-GAATGAGAACTTCGGTGG GT-3）和反向引物（5-ATTGACAGAAGAGTGGAGGAGCCCG-3）进行PCR扩增。上述3个株 系中均可扩增出497bp的目的条带（图3）。 0044 4、转PpDHN-31株系植株的耐旱性鉴定 0045 以转空载体对照株系和野生型水稻品种日本晴（O。
24、ryza sativa L.sppjaponica， cv.Nipponbare）（WT）为对照株系，在水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系（L11-6,L14-7 和L14-10）的株高和耐渗透胁迫性，在成熟期检测水稻幼苗期检测转PpDHN-31基因株系 （L11-6,L14-7和L14-10）的株高和抗旱性，方法和结果如下： 0046 1）幼苗期植株性状及耐渗透胁迫性鉴定 0047 培养室内，在1/2 Hogland液体培养基中培养水稻幼苗，统计2周龄幼苗株高。结 果：在幼苗期，转PpDHN-31株系L11-6,L14-7和L14-10植株表现出的非常好的生长一致 性，但株高比转空载体。
25、对照株系和野生型对照植株分别下降约3.5%、12.5%、7.3%（图4，空 载体对照和野生型对照植株表型一致，省略了空载体对照图）。 0048 培养室内，将2周龄水稻幼苗在含15% PEG-8000的1/2 Hogland液体培养基（即 每100ml培养液含15g PEG-8000）中处理2天，再转移至含25% PEG-8000的1/2 Hogland 液体培养基（即每100ml培养液含25g PEG-8000）中继续处理3天，观察复水5天后的植 株状态，以未经PEG-8000处理在1/2 Hogland液体培养基中生长的处理为对照。结果：在 幼苗期，转空载体对照株系和野生型水稻（日本晴）（W。
26、T）植株大部分不能恢复生长，而3个 说 明 书CN 102776229 A 5/5页 7 转PpDHN-31基因株系L11-6,L14-7和L14-10可以恢复正常生长（图5），表明在幼苗期，转 PpDHN-31基因株系植株表现出较好的抗渗透胁迫能力。 0049 2）成熟期植株性状及抗旱性鉴定 0050 在田间大棚中种植水稻于营养土中，于灌浆期统计株高。结果：在灌浆期，2个转 PpDHN-31株系植株L11-6和L14-7的株高比野生型对照植株下降约11.3%、15.6%，但另1 个转PpDHN-31株系植株（L14-10）的株高却比野生型对照植株增加了7.8%（图6，图7）。 0051 在田。
27、间大棚中种植水稻于营养土中，在开花灌浆期停止浇水15天至土壤严重干 旱，水稻叶片全部因缺水而卷曲。复水30天后统计植株存活数和主茎的单穗总粒重。实验 共设三次重复，每次重复中，所测试的各株系植株分别为15株。结果：转空载体对照株系 植株和野生型水稻（日本晴）（WT）的存活率均为27.3%，而转PpDHN-31基因的株系L11-6、 L14-7和L14-10的存活率分别为92.9%、100%、100%（图7和图8，转空载体对照株系植株和 野生型对照植株表型一致，省略了转空载体对照株系植株图）。统计水稻主茎单穗总粒重， 野生型对照平均为1.1克，而上述3个转PpDHN-31基因的株系L11-6、L。
28、14-7和L14-10的 平均主茎单穗总粒重分别为9.7、12.6和20.5克（图9）。 0052 上述结果表明：转PpDHN-31基因植株的株形、抽穗时期与转空载体对照株系和野 生型对照并没有明显差别，但其耐旱性明显优于转空载体对照株系和野生型对照植株。苔 藓PpDHN-31蛋白及其编码基因PpDHN-31可明显提高植物的耐旱性。 说 明 书CN 102776229 A 1/6页 8 0001 0002 序 列 表CN 102776229 A 2/6页 9 0003 序 列 表CN 102776229 A 3/6页 10 0004 序 列 表CN 102776229 A 10 4/6页 11 0005 序 列 表CN 102776229 A 11 5/6页 12 0006 0007 序 列 表CN 102776229 A 12 6/6页 13 序 列 表CN 102776229 A 13 1/4页 14 图1 图2 图3 说 明 书 附 图CN 102776229 A 14 2/4页 15 图4 图5 说 明 书 附 图CN 102776229 A 15 3/4页 16 图6 图7 图8 说 明 书 附 图CN 102776229 A 16 4/4页 17 图9 说 明 书 附 图CN 102776229 A 17 。