以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法.pdf

摘要
申请专利号：	CN201110408234.6	申请日：	2011.12.09
公开号：	CN102487825A	公开日：	2012.06.13
当前法律状态：	终止	有效性：	无权
法律详情：	未缴年费专利权终止IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20111209授权公告日:20130731终止日期:20141209\|\|\|授权\|\|\|实质审查的生效IPC(主分类):A01H 4/00申请日:20111209\|\|\|公开
IPC分类号：	A01H4/00	主分类号：	A01H4/00
申请人：	西南林业大学
发明人：	蓝增全; 吴田; 谢江; 张婷婷
地址：	650224 云南省昆明市盘龙区白龙寺300号
优先权：
专利代理机构：	昆明科阳知识产权代理事务所 53111	代理人：	孙山明
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内容摘要

以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，属于用植物离体外植体的培养方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行愈伤组织诱导。结果表明，最适合的愈伤组织诱导培养基是MS+1.5mg/L6-BA，诱导出的愈伤组织多数为土黄色，颗粒状，硬度适中；最适合愈伤组织继代的培养基也是MS+1.5mg/L6-BA，成活率达91.25%；愈伤组织在6-BA浓度为1.0mg/L、1.5mg/L的MS培养基中，不定芽分化率分别为24.13%和23.64%；愈伤组织上诱导出的芽可长成健壮的完整植株。

权利要求书

1：以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，步骤包括：（1）愈伤组织的诱导：将诺丽无菌苗的根切下，剪成 0.5cm ～ 1cm 的小段作为外植体，轻轻接入培养基中，并使外植体充分与培养基接触，培养基为 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5mg/L 6-BA，接种约 15 天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；（2）愈伤组织上不定芽的诱导：于 20 天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约 1cm 时将其切下，于 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.0 mg/L 6-BA 或 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5 mg/L 6-BA 下培养 35 天～ 40 天；（3）不定芽的再生：当步骤（2）中长出的不定芽长到 1cm ～ 2cm 时，将其剪下，接入 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.0 mg/L 6-BA 的中培养约 30 天；（4）壮苗生根：从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约 1 cm 的其它带芽茎段，接种于 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +0.3 mg/L NAA 中诱导生根，培养 30 ～ 50 天，得到完整植株；（5）移栽：将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率 75% 的温室中炼苗 7 天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；以上 MS 培养基 pH 值为 5.8 ；培养基均在 1.1 kg/cm2 的压力、 121℃下灭菌 20 min ；愈伤组织的诱导培养试验均在 25±2℃和 2000 lx 光照强度下进行，每天光照 12h。2：如权利要求 1 所述的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，其特征是将步骤（1）培养诱导约 28 天的愈伤组织颗粒转入 MS（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5mg/L 6-BA 培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤（2）～（5）进行操作。

说明书

以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法
     技术领域
     本发明属于用植物的外植体离体培养的方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。背景技术诺丽（Morinda citrifolia ）是一种生长于热带、亚热带的茜草科巴戟天属的常绿小乔木或灌木。诺丽是一种天然的水果，营养成分十分丰富，包含了人体所需的几乎所有的营养元素。诺丽在全球范围内的分布地区十分稀少，我国诺丽资源短缺，仅分布于海南及西沙群岛、台湾，近年在云南热带地区引种栽培。诺丽离体再生体系的建立对于后续的基因工程操作非常重要，但国内外的研究大多还停留在引种育苗阶段，国内外鲜见离体再生方面的报道。 “诺丽 (Morinda citrifolia L.) 离体快速繁殖研究” 是我们在中国知网 CNKI 数据库所检索到的文章，按照该文取诺丽种子发芽后，胚的子叶和下胚轴作为实验材料，并根据其介绍的方法，我们反复实验了 3 次均未诱导出愈伤组织。而对诺丽的愈伤组织诱导及植株再生进行研究，将可为产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础。
     发明内容本发明目的是以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度 6-BA 的 MS 培养基上进行离体培养，进行诺丽离体快速繁殖，提供一种诺丽的愈伤组织诱导及植株再生的方法。
     本发明的目的通过以下方式实现，步骤包括：（1）愈伤组织的诱导：将诺丽无菌苗的根切下，剪成 0.5cm ～ 1cm 的小段作为外植体，轻轻接入培养基中，并使外植体充分与培养基接触，培养基为 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5mg/L 6-BA，接种约 15 天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；（2）愈伤组织上不定芽的诱导： 20 天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约 1cm 时将其切下，于 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.0 mg/L 6-BA 或 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5 mg/L 6-BA 下培养 35 天～ 40 天；（3）不定芽的再生：当步骤（2）中长出的不定芽长到 1cm ～ 2cm 时，将其剪下，接入 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.0 mg/L 6-BA 的中培养约 30 天；（4）壮苗生根：从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约 1 cm 的其它带芽茎段，接种于 MS 培养基（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +0.3 mg/L NAA 中诱导生根，培养 30 ～ 50 天，得到完整
     植株；（5）移栽：将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率 75% 的温室中炼苗 7 天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；以上 MS 培养基 pH 值为 5.8 ；培养基均在 1.1 kg/cm2 的压力、 121℃下灭菌 20 min ；愈伤组织的诱导培养试验均在 25±2℃和 2000 lx 光照强度下进行，每天光照 12h。
     所述的方法进一步是将步骤（1）培养诱导约 28 天的愈伤组织颗粒转入 MS（附加 3% 蔗糖和 6‰琼脂粉） +1.5mg/L 6-BA 培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤（2）～（5）进行操作。
     本发明具有的效果和意义是：多数植物在离体培养诱导愈伤组织时，通常需要添加 NAA、 IAA、 2,4- 天等多种生长调节剂。由于本发明取诺丽试管苗的根部为外植体，根部自身含有较多的生长激素，为离体培养的外植体提供了植物个体正常发育的生物学基础。因而，本发明在 MS 培养基只加入 6-BA 一种生长调节剂，也能对根部愈伤组织产生诱导，得到数量较多、质量较好的愈伤组织。并且，在 6-BA 的三个浓度梯度中，高浓度的 6-BA 更利于诱导诺丽根部愈伤组织。特别是当采用 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 时，对根部愈伤组织达到 95.65% 的诱导率，且时间较短，只需要 15 天左右就开始有愈伤组织的发生。
     在愈伤组织诱导发芽试验中，愈伤组织在 6-BA 浓度较高的培养基中培养，发芽率也较高，说明 6-BA 浓度高有利于芽的分化；这是由于在上一步骤中 6-BA 浓度较高的培养基诱导出的愈伤组织质量较好，因此，在诱导发芽中有利于芽的分化。另外，愈伤组织在不更换新鲜培养基、置于原培养基中持续培养的情况下， 40 天左右，愈伤组织上也能陆续分化出小芽，但发芽率较低。
     本发明从根的愈伤组织的诱导、不定芽的诱导、壮苗生根到移栽获得诺丽完整植株，整个过程大约 4 个月，与目前已知的以诺丽种子发芽后的胚子叶和下胚轴为实验材料的诺丽离体快速繁殖方式所需时间或基本相同，甚或短于目前方式。
     因而，本发明达到了一种产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础的目的。附图说明
     图 1 为本发明根部形成愈伤组织生长示意图。图 2 为本发明愈伤组织继代培养生长示意图。图 3 为本发明愈伤组织上长出的芽生长示意图。图 4 为本发明诺丽完整植株生长示意图。以下结合附图对本发明做进一步说明。本发明包括但不限制于以下实施例。具体实施方式
     （一）本发明方法所用诺丽取自西南林业大学园林学院组织培养室的组培苗，取健康、无菌诺丽苗的根部为外植体。
     在以下方法中，进行对比的培养基分别是 MS+0.5 mg/L 6-BA ； MS+1.0 mg/L 6-BA ； MS+1.5 mg/L 6-BA。其中， MS 培养基 pH 值为 5.8，并附加蔗糖 3%、琼脂 0.6%。培养基均在 2 1.1 kg/cm 的压力、 121℃下灭菌 20 min。愈伤组织的诱导培养试验均在 25±2℃和 2000 lx 光照强度下进行，每天光照 12h。药品均为国产分析纯，实验用水为超纯水。
     （1）不同浓度的 6-BA 对愈伤组织的诱导将诺丽无菌苗的根切下，剪成 0.5-1cm 的小段，轻轻接入培养基中，确保充分与培养基接触。记录开始形成愈伤的时间，计算愈伤组织的诱导率，并观察愈伤组织的颜色和质地。其中，诱导率 = 产生愈伤组织的外植体数 ÷ 所接种的不污染的外植体数。
     接种 15 天后，陆续有细小颗粒状愈伤形成， 30 天后愈伤变大，颜色呈土黄色和浅绿色。试验结果表明（表 1），当 6-BA 浓度为 0.5 mg/L 时，愈伤组织的诱导率仅为 75.51%，愈伤组织的外观颜色为土黄色，颗粒较松散；当 6-BA 浓度为 1.0 mg/L 时，愈伤组织的诱导率为 85.11%，愈伤组织的外观颜色大部分为土黄色、少部分为浅绿色；当 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 时，愈伤组织的诱导率最高，达 95.65%，愈伤组织的外观颜色多为浅绿色，质地松紧合适（图 1）。
     表 1．不同浓度的 6-BA 对根部愈伤组织诱导的影响接种数（个） 49 47 46 产生愈伤数（个） 37 40 44 诱导率（%） 75.51 85.11 95.65 颜色与质地土黄色，较疏松，颗粒状多数为土黄色，少量浅绿色，较疏松，颗粒状多数为土黄色，部分浅绿色，较密实，颗粒状6-BA（mg/L） 0.5 1 1.5（2）愈伤组织上不定芽的诱导当步骤（1）中产生愈伤组织后，将部分愈伤组织顺序地对应转移至与步骤（1）三种培养基相同的、新鲜培养基中持续培养，统计出芽率。
     如图 3， 20 天左右观察，愈伤组织上陆续长出小芽。 35 天后，小芽长到约 1 cm。结果表明（表 3），愈伤组织在 6-BA 浓度为 0.5 mg/L 的培养基中，发芽率最低，为 10.9% ；在 6-BA 浓度为 1.0 mg/L、 1.5 mg/L 的培养基中，发芽率分别为 24.13% 和 23.64%，发芽率均较高。
     表 3．更换新鲜培养基后不同浓度的 6-BA 对愈伤组织长芽的影响6-BA（mg/L） 0.5 1 1.5 愈伤数（个） 55 58 55 发芽数（个） 6 14 13 发芽率（%） 10.9 24.13 23.64（3）不定芽的再生当步骤（2）中长出的不定芽长到 1 ～ 2cm 时，将其剪下，接入 MS+1.0 mg/L 6-BA 的芽再生培养基中培养，观察芽生长的情况。
     接种的芽数量为 20 棵，芽接入培养基 7 天后，平均高度为 2.5 cm ； 15 天后，芽明显长高，长出新叶，平均高度 3.6cm ； 20 天后，茎变得粗壮，茎下部颜色微红，平均高度 4.2cm ； 30 天后，植株生长健壮，平均高度 5.1cm。
     （4）壮苗生根从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约 1cm 的其它带芽茎段，接种于 MS+0.3 mg/L NAA 的生根培养基中，观察生根情况。
     30 天后，茎尖切口附近发生不定根，根须状，纤细且多分枝，浅黄色，形成密集的根群，形成完整植株（图 4）； 50 天后，诺丽其它带芽茎段的切口附近也开始有不定根形成。在茎段的切口处容易形成疏松的愈伤组织，部分根系是从愈伤组织上发生的。在发生不定根的过程中，植株生长较为缓慢。50 天后，植株的平均高度仅为 3.2cm。从实验结果可知，茎尖发生不定根的时间最短，且长势最强。
     （5）移栽将诺丽根系已发育良好的培养瓶移置遮光率 75% 的温室中炼苗 7 天。将诺丽试管苗从培养瓶中移出，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，视情况适量喷水保持叶片及土壤湿润。在自然光照下正常管理。
     在诺丽试管苗移栽到苗盘里的开始的 3~4 天，幼苗叶片容易变软萎蔫，要经常喷水以保持叶面湿润； 5 天后，幼苗叶片逐渐变硬，颜色变深； 7 天后，幼苗能够保持挺立，可停止叶面喷雾，只需保持土壤湿润； 15 天后，植株开始长高，且长出新叶。 30 天后统计，成活率达 81.25%。
     实施例 2 ：本实施例中，除将实施例 1 之步骤（1）诱导出的愈伤组织对应地转入与步骤（1）三种培养基配方相同的新鲜培养基上继代培养外，其余按照实施例 1 的步骤（2）～步骤（5）进行，即分化不定芽，进而使不定芽成长为完整植株。
     继代培养结果如表 2 所示。在附加 6-BA 浓度为 0.5 mg/L 的培养基上，愈伤组织呈土黄色，有少部分褐化死亡，成活率为 81.82% ；在附加 6-BA 浓度为 1.0 mg/L 的培养基上，大部分愈伤组织呈土黄色，少数呈浅绿色，较疏松，成活率为 89.66% ；而在附加 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 的培养基上，大部分愈伤组织呈土黄色至黄色，部分呈黄绿色至浅绿色，较密实（见图 2），成活率达 91.25%。将愈伤组织转移至 MS 附加 6-BA 浓度分别为 0.5 mg/L、 1.0 mg/L、 1.5 mg/L 的培养基上继代培养均有较好的继代效果，其中 6-BA 浓度为 1.5 mg/L 的培养基的愈伤组织继代效果及成活率最佳。
     表 2．不同浓度的 6-BA 对愈伤组织继代生长的影响

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1、(10)申请公布号 CN 102487825 A (43)申请公布日 2012.06.13 C N 1 0 2 4 8 7 8 2 5 A *CN102487825A* (21)申请号 201110408234.6 (22)申请日 2011.12.09 A01H 4/00(2006.01) (71)申请人西南林业大学地址 650224 云南省昆明市盘龙区白龙寺 300号 (72)发明人蓝增全吴田谢江张婷婷 (74)专利代理机构昆明科阳知识产权代理事务所 53111 代理人孙山明 (54) 发明名称以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法 (57) 摘要以根为外植体的诺丽。

2、愈伤组织的诱导及植株再生的方法，属于用植物离体外植体的培养方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行愈伤组织诱导。结果表明，最适合的愈伤组织诱导培养基是MS+1.5mg/ L6-BA，诱导出的愈伤组织多数为土黄色，颗粒状，硬度适中；最适合愈伤组织继代的培养基也是 MS+1.5mg/L6-BA，成活率达91.25%；愈伤组织在 6-BA浓度为1.0mg/L、1.5mg/L的MS培养基中，不定芽分化率分别为24.13%和23.64%；愈伤组织上诱导出的芽可长成健壮的完整植株。 (51)Int.Cl. 权利。

3、要求书1页说明书4页附图4页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请权利要求书 1 页说明书 4 页附图 4 页 1/1页 2 1.以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，步骤包括：（1）愈伤组织的诱导：将诺丽无菌苗的根切下，剪成0.5cm1cm的小段作为外植体，轻轻接入培养基中，并使外植体充分与培养基接触，培养基为MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA，接种约15天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；（2）愈伤组织上不定芽的诱导：于20天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约1cm时将其切。

4、下，于MS 培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA或MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.5 mg/L 6-BA下培养35天40天；（3）不定芽的再生：当步骤（2）中长出的不定芽长到1cm2cm时，将其剪下，接入MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA 的中培养约30天；（4）壮苗生根：从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约1 cm的其它带芽茎段，接种于MS 培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+0.3 mg/L NAA中诱导生根，培养3050天，得到完整植株；（5）移栽：将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率75。

5、%的温室中炼苗7天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；以上MS培养基pH值为5.8；培养基均在1.1 kg/cm 2 的压力、121下灭菌20 min；愈伤组织的诱导培养试验均在252和2000 lx光照强度下进行，每天光照12h。 2.如权利要求1所述的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法，其特征是将步骤（1）培养诱导约28天的愈伤组织颗粒转入MS（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤（2）（5）进行操作。权利要求书CN。

6、 102487825 A 1/4页 3 以根为外植体的诺丽愈伤组织的诱导及植株再生的方法 0001 技术领域 0002 本发明属于用植物的外植体离体培养的方法，特别是诺丽的外植体离体培养的方法。背景技术 0003 诺丽（Morinda citrifolia）是一种生长于热带、亚热带的茜草科巴戟天属的常绿小乔木或灌木。诺丽是一种天然的水果，营养成分十分丰富，包含了人体所需的几乎所有的营养元素。诺丽在全球范围内的分布地区十分稀少，我国诺丽资源短缺，仅分布于海南及西沙群岛、台湾，近年在云南热带地区引种栽培。诺丽离体再生体系的建立对于后续的基因工程操作非常重要，但国内外的研究大多还停留在引。

7、种育苗阶段，国内外鲜见离体再生方面的报道。“诺丽(Morinda citrifolia L.)离体快速繁殖研究”是我们在中国知网CNKI数据库所检索到的文章，按照该文取诺丽种子发芽后，胚的子叶和下胚轴作为实验材料，并根据其介绍的方法，我们反复实验了3次均未诱导出愈伤组织。而对诺丽的愈伤组织诱导及植株再生进行研究，将可为产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础。发明内容 0004 本发明目的是以诺丽试管苗的根为外植体，在添加不同浓度6-BA的MS培养基上进行离体培养，进行诺丽离体快速繁殖，提供一种诺丽的愈伤组织诱导及植株再生的方法。 0005 本发明的目的通过以下。

8、方式实现，步骤包括：（1）愈伤组织的诱导：将诺丽无菌苗的根切下，剪成0.5cm1cm的小段作为外植体，轻轻接入培养基中，并使外植体充分与培养基接触，培养基为MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA，接种约15天陆续形成细小颗粒状愈伤，颜色呈土黄色或绿色，硬度适中；（2）愈伤组织上不定芽的诱导： 20天时观察，愈伤组织上陆续分化出不定芽，待不定芽长到约1cm时将其切下，于MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA或MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉） +1.5 mg/L 6-BA下培养35天40天；（3）不定芽的再生：当步骤（2）中长出。

9、的不定芽长到1cm2cm时，将其剪下，接入MS培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+1.0 mg/L 6-BA 的中培养约30天；（4）壮苗生根：从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约1 cm的其它带芽茎段，接种于MS 培养基（附加3%蔗糖和6琼脂粉）+0.3 mg/L NAA中诱导生根，培养3050天，得到完整说明书CN 102487825 A 2/4页 4 植株；（5）移栽：将诺丽根系已发育良好的培养瓶移至遮光率75%的温室中炼苗7天后，从培养瓶中移出诺丽试管苗，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，适量喷水保持叶片及土壤湿润，在自然光照下正常管理；以。

10、上MS培养基pH值为5.8；培养基均在1.1 kg/cm 2 的压力、121下灭菌20 min；愈伤组织的诱导培养试验均在252和2000 lx光照强度下进行，每天光照12h。 0006 所述的方法进一步是将步骤（1）培养诱导约28天的愈伤组织颗粒转入MS（附加 3%蔗糖和6琼脂粉）+1.5mg/L 6-BA培养基上进行愈伤组织的继代培养，再按照以上所述的步骤（2）（5）进行操作。 0007 本发明具有的效果和意义是：多数植物在离体培养诱导愈伤组织时，通常需要添加NAA、IAA、2,4-天等多种生长调节剂。由于本发明取诺丽试管苗的根部为外植体，根部自身含有较多的生长激素，为离体培养的。

11、外植体提供了植物个体正常发育的生物学基础。因而，本发明在MS培养基只加入6-BA 一种生长调节剂，也能对根部愈伤组织产生诱导，得到数量较多、质量较好的愈伤组织。并且，在6-BA的三个浓度梯度中，高浓度的6-BA更利于诱导诺丽根部愈伤组织。特别是当采用6-BA浓度为1.5 mg/L时，对根部愈伤组织达到95.65%的诱导率，且时间较短，只需要15 天左右就开始有愈伤组织的发生。 0008 在愈伤组织诱导发芽试验中，愈伤组织在6-BA浓度较高的培养基中培养，发芽率也较高，说明6-BA浓度高有利于芽的分化；这是由于在上一步骤中6-BA浓度较高的培养基诱导出的愈伤组织质量较好，因此，在诱导发芽。

12、中有利于芽的分化。另外，愈伤组织在不更换新鲜培养基、置于原培养基中持续培养的情况下，40 天左右，愈伤组织上也能陆续分化出小芽，但发芽率较低。 0009 本发明从根的愈伤组织的诱导、不定芽的诱导、壮苗生根到移栽获得诺丽完整植株，整个过程大约4个月，与目前已知的以诺丽种子发芽后的胚子叶和下胚轴为实验材料的诺丽离体快速繁殖方式所需时间或基本相同，甚或短于目前方式。 0010 因而，本发明达到了一种产业化方式诺丽离体快速繁殖和后续的诺丽基因工程研究奠定基础的目的。附图说明 0011 图1为本发明根部形成愈伤组织生长示意图。 0012 图2为本发明愈伤组织继代培养生长示意图。 0013 图。

13、3为本发明愈伤组织上长出的芽生长示意图。 0014 图4为本发明诺丽完整植株生长示意图。 0015 以下结合附图对本发明做进一步说明。本发明包括但不限制于以下实施例。具体实施方式 0016 （一）本发明方法所用诺丽取自西南林业大学园林学院组织培养室的组培苗，取健康、无菌诺丽苗的根说明书CN 102487825 A 3/4页 5 部为外植体。 0017 在以下方法中，进行对比的培养基分别是MS+0.5 mg/L 6-BA；MS+1.0 mg/L 6-BA； MS+1.5 mg/L 6-BA。其中，MS培养基pH值为5.8，并附加蔗糖3%、琼脂0.6%。培养基均在 1.1 kg/cm 2。

14、的压力、121下灭菌20 min。愈伤组织的诱导培养试验均在252和2000 lx光照强度下进行，每天光照12h。药品均为国产分析纯，实验用水为超纯水。 0018 （1）不同浓度的6-BA对愈伤组织的诱导将诺丽无菌苗的根切下，剪成0.5-1cm的小段，轻轻接入培养基中，确保充分与培养基接触。记录开始形成愈伤的时间，计算愈伤组织的诱导率，并观察愈伤组织的颜色和质地。其中，诱导率=产生愈伤组织的外植体数所接种的不污染的外植体数。 0019 接种15天后，陆续有细小颗粒状愈伤形成，30天后愈伤变大，颜色呈土黄色和浅绿色。试验结果表明（表1），当6-BA浓度为0.5 mg/L时，愈伤组织的诱。

15、导率仅为75.51%，愈伤组织的外观颜色为土黄色，颗粒较松散；当6-BA浓度为1.0 mg/L时，愈伤组织的诱导率为85.11%，愈伤组织的外观颜色大部分为土黄色、少部分为浅绿色；当6-BA浓度为1.5 mg/L时，愈伤组织的诱导率最高，达95.65%，愈伤组织的外观颜色多为浅绿色，质地松紧合适（图1）。 0020 表1不同浓度的6-BA对根部愈伤组织诱导的影响 6-BA（mg/L）接种数（个）产生愈伤数（个）诱导率（%）颜色与质地 0.5 49 37 75.51土黄色，较疏松，颗粒状 1 47 40 85.11多数为土黄色，少量浅绿色，较疏松，颗粒状 1.5 46 44 95.65多数。

16、为土黄色，部分浅绿色，较密实，颗粒状（2）愈伤组织上不定芽的诱导当步骤（1）中产生愈伤组织后，将部分愈伤组织顺序地对应转移至与步骤（1）三种培养基相同的、新鲜培养基中持续培养，统计出芽率。 0021 如图3，20天左右观察，愈伤组织上陆续长出小芽。35天后，小芽长到约1 cm。结果表明（表3），愈伤组织在6-BA浓度为0.5 mg/L的培养基中，发芽率最低，为10.9%；在6-BA 浓度为1.0 mg/L、1.5 mg/L的培养基中，发芽率分别为24.13%和23.64%，发芽率均较高。 0022 表3更换新鲜培养基后不同浓度的6-BA对愈伤组织长芽的影响 6-BA（mg/L）愈伤数（。

17、个）发芽数（个）发芽率（%） 0.5 55 6 10.9 1 58 14 24.13 1.5 55 13 23.64 （3）不定芽的再生当步骤（2）中长出的不定芽长到12cm时，将其剪下，接入MS+1.0 mg/L 6-BA的芽再生培养基中培养，观察芽生长的情况。 0023 接种的芽数量为20棵，芽接入培养基7天后，平均高度为2.5 cm；15天后，芽明显长高，长出新叶，平均高度3.6cm；20天后，茎变得粗壮，茎下部颜色微红，平均高度4.2cm； 30天后，植株生长健壮，平均高度5.1cm。 0024 （4）壮苗生根从步骤（3）培养得到的健壮植株中，切取茎尖或长约1cm的其它带芽。

18、茎段，接种于 MS+0.3 mg/L NAA的生根培养基中，观察生根情况。 0025 30天后，茎尖切口附近发生不定根，根须状，纤细且多分枝，浅黄色，形成密集的根说明书CN 102487825 A 4/4页 6 群，形成完整植株（图4）；50天后，诺丽其它带芽茎段的切口附近也开始有不定根形成。在茎段的切口处容易形成疏松的愈伤组织，部分根系是从愈伤组织上发生的。在发生不定根的过程中，植株生长较为缓慢。50天后，植株的平均高度仅为3.2cm。从实验结果可知，茎尖发生不定根的时间最短，且长势最强。 0026 （5）移栽将诺丽根系已发育良好的培养瓶移置遮光率75%的温室中炼苗7天。将诺。

19、丽试管苗从培养瓶中移出，洗去琼脂，剪去根部附近的叶片，移植到苗盘中，视情况适量喷水保持叶片及土壤湿润。在自然光照下正常管理。 0027 在诺丽试管苗移栽到苗盘里的开始的34天，幼苗叶片容易变软萎蔫，要经常喷水以保持叶面湿润；5天后，幼苗叶片逐渐变硬，颜色变深；7天后，幼苗能够保持挺立，可停止叶面喷雾，只需保持土壤湿润；15天后，植株开始长高，且长出新叶。30天后统计，成活率达81.25%。 0028 实施例2：本实施例中，除将实施例1之步骤（1）诱导出的愈伤组织对应地转入与步骤（1）三种培养基配方相同的新鲜培养基上继代培养外，其余按照实施例1的步骤（2）步骤（5）进行，即分化不。

20、定芽，进而使不定芽成长为完整植株。 0029 继代培养结果如表2所示。在附加6-BA浓度为0.5 mg/L的培养基上，愈伤组织呈土黄色，有少部分褐化死亡，成活率为81.82%；在附加6-BA浓度为1.0 mg/L的培养基上，大部分愈伤组织呈土黄色，少数呈浅绿色，较疏松，成活率为89.66%；而在附加6-BA浓度为1.5 mg/L的培养基上，大部分愈伤组织呈土黄色至黄色，部分呈黄绿色至浅绿色，较密实（见图2），成活率达91.25%。将愈伤组织转移至MS附加6-BA浓度分别为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L的培养基上继代培养均有较好的继代效果，其中6-BA浓度为1.5 mg/L的培养基的愈伤组织继代效果及成活率最佳。 0030 表2不同浓度的6-BA对愈伤组织继代生长的影响说明书CN 102487825 A 1/4页 7 图1 说明书附图CN 102487825 A 2/4页 8 图2 说明书附图CN 102487825 A 3/4页 9 图3 说明书附图CN 102487825 A 4/4页 10 图4 说明书附图CN 102487825 A 10 。

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