生物类黄酮浸渍的材料.pdf

本发明描述了纤维素纤维材料，所述纤维素纤维材料使用生物类黄酮组合物进行浸渍，所述组合物中的所述生物类黄酮内容物至少包含柚皮苷和新橙皮苷。还描述了这些浸渍材料的应用例如作为纸张或者竹毛巾和纸板的应用以及用于浸渍所述材料的方法。

权利要求书1.  一种干燥的纤维素纤维材料，所述干燥的纤维素纤维材料使用生物 类黄酮组合物进行浸渍，所述组合物的生物类黄酮内容物至少包含柚皮苷和 新橙皮苷。 2.  根据权利要求1所述的材料，其中，所述柚皮苷和所述新橙皮苷一 起占所述生物类黄酮内容物的至少50％。 3.  根据权利要求2所述的材料，其中，所述柚皮苷和所述新橙皮苷一 起占所述生物类黄酮内容物的至少70％。 4.  根据权利要求3所述的材料，其中，所述柚皮苷和所述新橙皮苷一 起占所述生物类黄酮内容物的至少75％。 5.  根据权利要求4所述的材料，其中，所述柚皮苷和所述新橙皮苷一 起占所述生物类黄酮内容物的75％至80％。 6.  根据前述权利要求中任一项所述的材料，其中，所述组合物中的所 述生物类黄酮内容物进一步包含选自由新圣草苷、异柚皮苷、橙皮苷、新地 奥明、柚皮素、枸橘苷和野漆树苷组成的组中的一种或者多种化合物。 7.  根据权利要求6所述的材料，其中，所述组合物中的所述生物类黄 酮内容物进一步包含新圣草苷、异柚皮苷、橙皮苷、新地奥明、柚皮素、枸 橘苷和野漆树苷。 8.  根据前述权利要求中任一项所述的材料，其中，所述生物类黄酮组 合物在整个所述材料中是均一的。 9.  根据前述权利要求中任一项所述的材料，其中，所述材料是纸张。 10.  根据前述权利要求中任一项所述的材料，其中，所述材料是竹料纤 维。 11.  根据权利要求9或10所述的材料，其中，所述纸张或竹料为毛巾 或者布料的形式。 12.  根据权利要求9或10所述的材料，其中，所述纸张或竹料是食物 垫的形式。 13.  根据权利要求9或10所述的材料，其中，所述纸张或竹料是呼吸 面具的形式。 14.  根据权利要求10所述的材料，其中，所述竹料是服装的形式，例 如袜子或住院服的形式。 15.  根据权利要求1至8中任一项所述的材料，其中，所述材料是纸板。 16.  一种用于使用生物类黄酮组合物浸渍纤维素纤维材料的方法，所述 方法包括如下步骤： a)使用权利要求1至7中任一项所定义的所述生物类黄酮组合物浸没 或者喷洒所述材料或者材料纤维； b)对所述材料进行机械干燥。 17.  一种减少表面上的细菌载量的方法，所述方法包括如下步骤： a)使用湿气润湿权利要求9、10或者11中任一项所定义的材料；和 b)将所述材料放置在表面上和/或横跨所述表面擦拭所述材料。 18.  根据权利要求17所述的方法，其中，所述细菌载量由选自由金黄 色葡萄球菌(S.aureus)、大肠杆菌(E.coli)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、 枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、沙门氏菌(Salmonella)、耐甲氧西林金黄色葡 萄球菌(MRSA)、难辨梭状芽孢杆菌(c.diff)和幽门螺旋杆菌(H.pylori) 组成的组中的细菌构成。 19.  一种包装产品，所述包装产品包含权利要求1至8中任一项所定义 的干燥的纤维素纤维材料。 20.  根据权利要求19所述的产品，其中，纤维素纤维材料如权利要求9、 10或15中任一项所定义。 21.  根据权利要求19或20所述的产品，其中，所述产品是毛巾或者布 料的形式。 22.  根据权利要求19或20所述的产品，其中，所述产品为食物垫的形 式。 23.  根据权利要求19或20所述的产品，其中，所述产品为呼吸面具的 形式。 24.  根据权利要求19或20所述的产品，其中，所述产品为服装的形式， 例如为袜子的形式。

说明书生物类黄酮浸渍的材料
技术领域
本发明涉及生物类黄酮浸渍的纤维素纤维材料，用于浸渍所述材料的方 法以及它们的应用。特别是，本发明涉及生物类黄酮浸渍的纤维素纤维材料， 例如纸张、纸巾、竹料纤维和纸板和由这些材料形成的制品。
背景技术
诸如纸张等纤维素纤维材料在广泛的各种不同的应用中使用，从家具应 用到商业应用，例如，在医院、学校、厨房和实验室中以例如纸巾、面罩、 甚至是服装例如竹料纤维袜子的形式的应用。
一些材料将得益于具有抗微生物性能。这些材料包括例如纸板、纸张、 清洁抹布、纸巾或面罩或者甚至是服装。
GB2468836公开了包含生物类黄酮化合物的组合物和它们的抗细菌、抗 真菌和抗病毒活性，但是没有提示它们可以用于浸渍纤维和材料。
发明内容
本发明涉及纤维素纤维材料，所述纤维素纤维材料使用生物类黄酮组合 物进行浸渍。
根据本发明的第一方面，提供了使用生物类黄酮组合物浸渍的材料，所 述组合物的所述生物类黄酮内容物至少包含柚皮苷和新橙皮苷。
特别优选的是当所述组合物的所述生物类黄酮内容物的大部分包含柚 皮苷和新橙皮苷。优选的是，所述柚皮苷和所述新橙皮苷一起占所述组合物 的所述生物类黄酮内容物(排除其他生物量)的至少50重量％，更优选为 至少70重量％，例如至少75重量％，例如75重量至80重量％。
所述组合物中的所述生物类黄酮内容物可以进一步包含具有式(I)的 一种或者多种化合物：

其中，R1是羟基或甲氧基，并且R2是氢、羟基或者甲氧基，并且X是 氢或者糖(saccharide)。
一个优选的选择是当R2是氢并且R1在3-或者4-位时。另一个选择是当 R1是3-羟基并且R2是4-甲氧基时。优选的是，X是H。更优选的是，X是 糖。
在一些优选的实施方式中，X是二糖。适当的二糖包括通过糖苷键连接 的两个单糖优选的是吡喃糖的组合，例如鼠李糖和葡萄糖的组合，例如L- 鼠李糖和D-葡萄糖的组合。
适当的二糖可以具有如下结构：

其中，R3和R4中的一个是H并且另一个是OH，或者两个都是H，或 者两个都是OH。优选的是，R3是H，并且R4是OH，使得所述二糖为芸香 糖(rutinose)。
用于本发明中的受青睐的生物类黄酮的糖苷配基是二糖6-O-(α-L-吡 喃鼠李糖基)-β-D-吡喃葡萄糖(6-O-(alpha-L-rhamnopyranosyl)-beta-D- glucopyranose)(也称为芸香糖)和2-O-(αL-吡喃鼠李-糖基)-β-D-吡喃 葡萄-糖(2-O-(alpha-L-rhamnopyra-nosyl)-beta-D-glucopyra-rose)。
具有式(I)的适当化合物除了柚皮苷(naringin)和新橙皮苷 (neohesperidin)之外还包括新圣草苷(neoeriocitrin)、异柚皮苷(isonaringin)、 橙皮苷(hesperindin)、新地奥明(neodiosmin)、柚皮素(naringenin)、枸橘 苷(poncirin)和野漆树苷(rhiofolin)。除了柚皮苷和新橙皮苷之外，还可 以存在这些化合物中的一种化合物，不过特别优选的是还可以存在这些化合 物中的两种或者更多种化合物的混合物。
这些混合物可以通过提取从苦橙获得，并且终产物称为苦橙(citrus  aurantium amara)提取物。特别优选的是从粉碎的整个未成熟苦橙的提取物 获得的生物类黄酮的混合物。所述混合物还可以衍生自由未成熟的苦(血/ 红)橙例如酸橙(Seville orange)的髓质(pith)组成的起始材料，所述髓 质被归类为“不可食用的”并且从中已经从中基本去除了种子、果肉和油性 外皮，或者保持为未开发的。
适当的混合物可以包括具有式(I)的2、3、4、5、6、7、8、9或者更 多种化合物。包含2、3、4、5、6、7、8或者9所述生物类黄酮的混合物是 优选的，例如包含所述生物类黄酮中的3种、或者包含4种、或者包含5种、 或者包含6种、或者包含7种、或者包含8种、或者包含9种。
目前据信这些生物类黄酮的混合物相对于单种生物类黄酮的使用是具 有优势的。特别有利的是，使用苦橙的提取物而无需分离单一的各种生物类 黄酮。基于所述组合物的所述生物类黄酮内容物的重量，在来自苦橙的提取 物中，生物量可以高达40重量％至60重量％，优选为约55重量％。所述生 物量包含果胶和其他糖衍生材料。如果希望避免生物量，可以酌情使用诸如 糊精等增溶剂，例如环糊精。
本文描述的很多组合物中的一个特别的优点是它们可以使用具有天然 来源的化合物。因此，例如，优选采用来自苦橙的具有式(I)的化合物。 如果需要，可以使用合成或者半合成得到的化合物来代替从天然来源直接提 取的化合物，不过从成本的角度考虑，这往往不是那么受青睐。
所述组合物可以进一步包含橄榄苦苷(oleuropein)。优选的是，这是从 橄榄例如油橄榄(Olea europaea)的叶子提取得到。这些提取物一般含有5 重量％至80重量％，更优选的是含有10重量％至70重量％例如20重量％的 橄榄苦苷。
生物类黄酮与橄榄苦苷的重量比可以为5:1至1:4，优选为2:1至1:2， 更优选为1:2至1:1，并且甚至更优选为3:2。除了所述组合物中的所述 生物类黄酮内容物之外，所述组合物可以进一步包含一种或者多种水果酸， 例如柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸。这些酸中的一种或者多种优选使用适当的 碱进行中和，所述适当的碱例如为季铵碱，例如胆碱，例如胆碱碳酸盐、碳 酸氢盐，或者优选为氢氧化物。更优选的是，在所述组合物的制备中全部用 到柠檬酸、苹果酸和抗坏血酸，并且当这些酸被充分中和以提供柠檬酸盐、 苹果酸盐和/或抗坏血酸盐时是特别优选的。特别优选的是胆碱抗坏血酸盐。
已发现本文描述的所述组合物在一种或者多种有机酸存在的情况下特 别有效。在一个实施方式中，所述组合物进一步包含一种或者多种有机酸。
令人惊讶地有效的有机酸是水杨酸或者其药学可接受的盐，以及可选的 另外的有机酸或者药学可接受的盐。
所述水杨酸可以从柳树树皮提取物中获得。作为替代方式，用于合成水 杨酸的方法对于本领域技术人员来说是已知的。
有时候优选所述水杨酸是其酸的形式而不是其盐的形式。
类似的，另外的有机酸如果存在的话类似地为其酸的形式而不是其盐的 形式。适当的另外的有机酸包括具有不超过8个碳原子的酸，这些酸为一元 酸(即一个CO2H基团)，二元酸或者三元酸，可选地具有1、2或者3个羟 基。这种另外的有机酸可以是柠檬酸、苹果酸、乳酸、酒石酸和富马酸等中 的一种或者多种。
这些组合物在使用的时候可以提供大致中性或者酸性pH，例如为3至8， 更适宜地为3.5至7例如4至5的pH。
目前在所述组合物中优选采用水杨酸和柠檬酸。
这些组合物可以包括增溶剂例如水杨酸，例如糊精如环糊精。
本文描述的组合物具有特别有利的安全性和环境特征(profile)。而且还 显示出特别有效的抗微生物活性，所述组合物还是非毒性的、非腐蚀性的、 可再生的并且完全可生物可降解的。在WO 2012/017186(在此通过引证方 式引入本文)中公开的组合物是本发明的优选的组合物。
本发明的纤维素纤维材料可以由纸张或者纸板或者竹料纤维构成。纸张 被定义为由纤维素纸浆制得的材料，所述纤维素纸浆可以来自于木材、碎纸 (rag)或者草料。所述纸张可以是纸巾、小毛巾(towelette)、布料、抹布 或垫子的形式。纸巾具有各种用途，例如纸巾可以用于在洗涤后使个人的手 部变干，也称为手巾。纸巾或者抹布还可以用于清洁目的以擦拭例如医院、 实验室或厨房等的表面，并且还可以称为厨房卷纸、厨房用纸或厨房抹布。 垫子是纤维素纤维海绵，并且可以用于个人卫生和医学工具箱。抹布可以制 成气流成网纸张，其中利用空气携带纤维并将纤维形成至纸张的结构。
所述纸张可以使用软化剂、洗剂或者添加的香精进行处理以产生所希望 的“感觉”或质地。
竹质材料可以由竹料纤维形成，所述竹料纤维是从天然竹子提取或者由 天然竹子制成。竹子是可持续性农作物，并且作为完全来自于植物纤维素的 天然产品，竹料纤维能够被土壤中的微生物还有阳光进行生物降解。优选的 是，本发明的竹质材料由100％的竹料纤维形成，不过也考虑由竹料纤维和 其他纤维素纤维的混合物形成。
所述竹料还可以是纸巾、小毛巾、抹布或者垫子的形式，所述小毛巾、 抹布或者垫子可以具有与纸巾相同的用途。所述竹料纤维还可以用作衣服织 物，其可选地与其他已知的纤维一起被用来制作服装，例如袜子和住院服 (hospital gown)。例如，由浸渍有本文所述的生物类黄酮组合物的竹料纤维 制得的袜子可以有助于降低脚臭。生物类黄酮浸渍的竹料纤维在与来自足部 的湿气接触时被活化。对于住院服，所述生物类黄酮组合物在住院服与例如 血液或者尿液接触时被活化。
由竹料纤维制得的浸渍有本文所述的所述生物类黄酮组合物的织物在 医院和关爱家庭环境中是非常有用的。例如，所述竹料织物可以在希望使用 具有抗微生物性能的材料时用于床单、外科手术用帷帘(surgical drape)、窗 帘等。
纸纤维织物可以用来代替本文所述的竹料纤维织物；但是，竹料纤维织 物是优选的，因为这类织物比纸纤维织物更加耐用。
可以通过使用微波来对纸巾、竹料毛巾等加热以提供热毛巾。这些热毛 巾可以是一次性的和/或可重复加热的，并且可以用于餐馆、宾馆中和飞机上。
本发明的生物类黄酮浸渍的纸纤维和/或竹料纤维还可以以面罩的形式 提供，例如以呼吸面具或者外科手术面具的形式提供，从而为使用者提供抗 吸入的细菌和病毒的增强防护或者预防或降低细菌和病毒的传播。所述面具 可以是可重复使用的或者一次性的。制造面罩的方法在本领域中是已知的。
生物类黄酮浸渍的竹料纤维和/或纸纤维可以以单层或多层食物垫(food  pad)的形式使用。这些食物垫常常见于食物包装的底部，并且还可以称为 食物餐巾(food napkin)或者食物毯(food blanket)。在装有货架期短的食 物例如肉类或水果的食物包装中特别希望使用这些食物垫。食物产品例如 肉类或水果一般放置在包装内的食物垫上。生物类黄酮浸渍的食物垫显著 地降低导致食物例如肉类和新鲜水果腐败从而降低了它们的货架期的很多 细菌例如沙门氏菌(Salmonella)、大肠杆菌(E.coli)和弯曲杆菌 (Campylobacter)的数量。生物类黄酮浸渍的食物垫特别适合用于如下食 品的包装：肉，包括禽肉(例如鸡肉或者火鸡肉)、羊肉、牛肉和猪肉；鱼， 包括鲑鱼和虾；和水果，包括软水果，例如黑莓、树莓、罗甘莓和草莓等。
纸板是重型纸张并且可以包括纸张或者更加复杂的构造的单张的厚片 材，例如多个瓦楞层和不具有瓦楞的层，它们往往比普通纸更加耐用。本发 明的纸板一般将具有小于1cm的深度。浸渍的纸板可以被用于包装例如食 物包装。
本发明的纤维素纤维材料以干燥的形式提供，并且当它们在润湿时被活 化，即当材料与湿气例如液体接触时被活化。所述液体可以为例如水、体液 如汗液、血液或者尿液、水果汁液和烹饪汁液等。所述材料可以在施加于待 清洁的表面之前被润湿，例如在表面上使用之前向所述材料施加水。作为替 代方式，所述材料在使用的过程中被活化，例如在干燥手时湿气被转移到所 述材料上而被活化，或者使用所述材料擦拭湿表面时被活化。
所述材料以基本干燥的形式提供，并且优选通过加热至恒定质量来进行 干燥。
优选的是，浸渍在所述材料中的生物类黄酮涂料在整个材料中的量是均 一的。
本文所述的生物类黄酮组合物是可生物降解的并且可以浸渍到可生物 降解材料例如可生物降解纸和竹料纤维等中以提供环境友好的产品。
本文描述的生物类黄酮组合物显示抗广泛的各种生物体的活性，所述生 物体包括革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌、真菌、病毒、原生动物和昆虫 寄生物。所述组合物可以被用来抗艰难细菌例如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 (methicillin resistant Staphylococcus aureus MRSA)、难辨梭状芽孢杆菌 (Clostridium difficile(C.diff))、幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori(H. pylori))和万古霉素耐药细菌(vancomycin resistant enterobacteria)。所述组 合物还可以用来抗通过在空气中接触来传播的诺罗病毒病原体和其他病原 体。特别是，本文所述的组合物显示出抗大肠杆菌(E.coli)、金黄色葡萄球 菌(S.aureus)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和铜绿 假单胞菌(P.aeruginosa)的活性。
根据本发明的第二方面，提供了用于使用本文所述的生物类黄酮组合物 浸渍本文所述的材料的方法。浸渍是使材料部分或者完全饱和，不过优选的 是完全部饱和。特别是，所述材料是薄的材料。薄的材料被限定为具有小于 约1cm的深度的材料。浸渍可以是在制造所述薄的材料之后进行，或者其 可以在制造所述薄的材料的过程中进行，例如，纤维素纤维的浸渍在被形成 为所述材料之前进行。
如果浸渍预成型的纤维素纤维材料，那么所述方法包括将所述材料浸没 在所述生物类黄酮组合物中，以使所述材料被所述组合物完全饱和或者部分 饱和。然后将所述材料卷绕、挤压或绞拧以移除任何过量的所述组合物。然 后通过自然空气干燥法、烘箱干燥法或者机械干燥法对所述材料进行干燥。 用于对材料进行机械干燥的设备，如替代的干燥方法那样，对于本领域的技 术人员来说是已知的。所述方法获得干燥的材料，然后所述干燥的材料根据 需要进行包装，并且在后期通过润湿而被活化。作为替代方式，用于制造所 述材料的纤维素纤维可以首先被浸没在所述生物类黄酮组合物中以使所述 纤维被所述组合物完全饱和或者部分饱和，然后在通过本领域已知的方法将 所得纤维形成为诸如纸张或纸板之类的材料之前或者之后进行干燥。
作为替代方式，所述材料可以通过将所述生物类黄酮组合物喷洒在所述 材料上使得所述组合物浸渍所述材料的外部表面区域从而实现至少部分浸 渍来进行浸渍。喷洒还可以被用来在纤维被形成为本发明的材料之前在制造 或者提取的过程中对所述纤维进行浸渍。
一种用于浸渍纸巾的一个具体方法公开在实施例3中。纤维竹产品还可 以以与实施例3中公开的相同方式进行浸渍。
优选的是，上文所述的方法提供了遍及所述纤维素纤维材料均一的生物 类黄酮浸渍。使用占所述生物类黄酮组合物的0.005％至0.75％、优选为 0.005％至0.5％、更优选为0.025％至0.5％，甚至更优选为0.025％至0.1％的 浓度。本文所述的组合物是水溶性的并且可以使用水来将所述生物类黄酮组 合物稀释至所需要的浓度。
根据本发明的第三方面，提供了一种减少表面上的细菌载量的方法。减 少表面上的细菌载量的所述方法利用两种机制提供。首先，该技能通过所述 生物类黄酮组合物的作用来实现，以及然后其次是污染物利用所述材料本身 通过放置在表面上并且擦拭表面即机械擦拭的作用进行机械移除。
所述表面可以是任意具有生物活性的表面，并且可以是人类表面或者非 人类表面。例如，人类表面可以包括手、脚或者面部的皮肤。非人类表面可 以包括具有卫生重要性的可能携带有污染物的任意表面，例如见于学校、卧 室、厨房、工厂例如食品厂、实验室、医院等的表面。
对于食品接触，环境保护局(Environmental Protection Agency，EPA) 要求活性物在30秒实现挑战生物体的5个对数减少。优选的是，本发明的 所述材料在30秒内实现表面上的细菌载量的至少5个对数减少。
根据本发明的第四方面，提供了一种包装产品，其中所述产品由浸渍有 生物类黄酮组合物的干燥的纤维素纤维材料形成。所述产品和所述生物类黄 酮组合物如本发明的第一方面所述。
所述纤维素产品可以被单独包装。作为替代方式，所述产品可以被包装 为多包装中的一部分。可以使用已知的包装方法和材料例如常规膜试剂 (filmic agent)或者纸板箱来包装本发明的所述产品。
附图说明
为了更加充分地理解本发明，下文将仅通过举例方式参考如下附图来对 本发明进行说明，其中：
图1是显示在品牌纸巾上干燥的Citrox BC活性物的不同稀释 液对金黄色葡萄球菌(S.aureus)活性的影响的结果的柱状图。
图2是显示在品牌纸巾上干燥的Citrox BC活性物的不同稀释 液对大肠杆菌(E.coli)活性的影响的结果的柱状图。
具体实施方式
生物类黄酮内容物可以占所述生物类黄酮组合物的40重量％至50重量 ％，例如为约45重量％。生物类黄酮组合物的适合来源在本文中称为“HPLC 45”或者“Citrox BC”，其中(HPLC45/Citrox BC的总组成的)约45重量％ 包含生物类黄酮。所述生物类黄酮为与占余下的55％的来自苦橙的提取生物 量残留物例如果胶、糖和少量有机酸的混合物。HPLC 45可以作为柑橘生物 类黄酮复合物45％HPLC(Citrus Bioflavonoid Complex 45％HPLC)从 Exquim(Grupo Ferrer的一个公司)获得。
表1：在HPLC 45中的生物类黄酮的混合物
生物类黄酮 生物类黄酮在与生物量的混合物中的百分比(％) 新圣草苷 1.1 异柚皮苷 1.2 柚皮苷 23.4 橙皮苷 1.4 新橙皮苷 12.5 新地奥明 1.4 柚皮素 1.5 枸橘苷 2.0 其他(野漆树苷) 0.5
实施例
选择金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)作为代表性的革兰式阳性 生物体。这种生物体见于哺乳动物的皮肤上，并且因此散落在周围环境中。 选择大肠杆菌(E.coli)作为代表性的格兰仕阴性肠道细菌。这种生物体见 于鸟类、哺乳动物和爬行动物的消化道内。其在环境中的存在是粪便污染的 信号。选择铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)来代表非肠道格兰仕 阴性细菌。这个属的细菌存在于水中，并且相关物种代表主要的植物病原体 和人类机会性病原体。选择枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)作为代表性的 革兰氏阳性产孢子菌。这种细菌见于土壤和水中，但是也广泛存在于环境中。 这种物种形成内芽孢作为存活机制。细菌内芽孢是地球上最具有生命耐性的 形式，因此代表卫生、消毒和灭菌方法的一个长期担忧的问题。内芽孢代表 任何抗微生物试剂的“最终的”挑战。
实施例1：最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)
程序
使单种微生物的纯培养物在适当的肉汤中生长。使用标准微生物学技术 对培养物进行标准化以具有非常接近于一百万个细胞/毫升的浓度。微生物培 养物也标准，测试结果就越具有可重复性。使用无菌稀释剂多次稀释抗微生 物试剂(1:1)。在对抗微生物试剂进行稀释之后，将与经稀释的抗微生物试 剂的体积相当的一定体积的经标准化的接种物添加至每个稀释器皿中，使得 微生物浓度达到约500,000个细胞/毫升。对于受检生物体，将经接种的系列 稀释的抗微生物试剂在适当的温度温育预设的时间(通常为18小时)。温育 之后，观察系列稀释的器皿的微生物生长，通常以器皿的底部的微生物的菌 块(pellet)和/或浊度来表示。稀释系列中没有显示生长的最后一个管子与 所述抗微生物试剂的最小抑菌浓度(MIC)相对应。
为了区分微生物抑菌试剂(细菌没有被杀灭而只是被抑制)和微生物杀 灭试剂(细菌被杀灭)，进行了MBC测试。当将微生物抑菌试剂移除或者中 和时，先前被抑制的细菌再次开始生长。将在MIC测试中没有显示生长/浊 度的每个孔继代培养在不含生物杀灭剂的培养基中。来自这个测试的任何微 生物生长结果指示在该浓度，所述活性物是微生物抑菌的。如果继代培养物 没有导致细菌再生长，那么在该浓度，该活性物是微生物杀灭的。受检的 Citrox BC活性物的浓度范围为0.075％至0.75％。
结果讨论
MIC测试是液体抗微生物试剂的生物抑菌(以及还有可能的生物杀菌) 活性的确定“筛查”。其经常被用来找到抗微生物活性物的用于进一步的效 力测试的适当浓度。进行MIC和MBC测试两者将能够区分生物杀菌或生物 抑菌作用模式。根据所使用的活性物的浓度和接触时间，活性物经常同时展 示生物抑菌和生物杀菌作用模式。
受检的Citrox BC活性物的范围为0.075％至0.75％。对于铜绿假单胞菌 (P.aeruginosa)，没有获得MIC值，因为所检测的Citrox BC活性物的所有 浓度都没有显示出浊度(表2)。
MCB测试显示，所有浓度对于枯草芽孢杆菌(B.subtilis)也都是细菌 杀灭的，也没有获得MIC值，证明生长的抑制在所检测的所有浓度发生。 针对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)获得的MBC值是0.315％Citrox BC活性物。 这意味着0.075％至0.75％的浓度范围是细菌抑制性的，并且Citrox BC的大 于或者等于0.315％的所有浓度都是细菌杀灭性的。
这些结果表明，格兰仕阴性细菌如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)比革 兰氏阳性细菌枯草芽孢杆菌(B.subtilis)更加容易被Citrox BC所杀灭。
表2：MIC/MBC测试

G＝生长，NG＝没有生长
P.a.＝铜绿假单胞菌
B.s.＝枯草芽孢杆菌
实施例2：时间杀灭测试
程序
所有计时杀灭测试都使用标准活菌计数程序来进行。参考NB X34689。 在所有杀灭测试中都是使用如下中和溶液。


基本原理
计时杀灭测试评价杀灭预定群体微生物所需要的时间的量。广泛的各种 微生物被Citrox BC活性物所杀灭。在表征用于抗微生物毛巾的这种活性物 中的重要的第一步骤是鉴定杀灭要求。效力的要求是基于在预定时间框架内 被杀灭的细菌的数量。最严苛的要求是针对食品接触所制定的那些要求，其 中活性物必须在30秒钟内实现挑战生物体的5个对数减少。
结果讨论
实施例2(a)：计时杀灭测试：10分钟接触时间
细菌杀灭动力学是通过细菌数量、所使用的活性物的浓度和接触时间来 实施。为了确定Citrox BC活性物的最有效的范围，在10分钟杀灭测试中使 用枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)来评价Citrox BC活性物的各种浓度的效力。 对于所检测的所有浓度(0.45％至0.65％)的Citrox BC活性物都观察到大于 6.56对数减少(表3)。
当枯草芽孢杆菌(B.Subtilis)被用来作为挑战生物体时，在10分钟内 实现大于5的对数减少需要0.7％的Citrox BC(表4)。根据之前的测试，对 于一般应用，0.5％的活性物是最有效的。
表3：时间杀灭测试：金黄色葡萄球菌，10分钟
Citrox BC百分比(％) CFU/mL Log 10CFU/mL Log减少 0 7.4x 106 6.86 0 0.45 <2 0.3 6.56 0.5 <2 0.3 6.56 0.55 <2 0.3 6.56 0.6 <2 0.3 6.56 0.65 <2 0.3 6.56 0.65+中和剂 6.6x 106 6.81 0.05
表4：时间杀灭测试：枯草芽孢杆菌，10分钟
Citrox BC百分比(％) CFU/mL Log 10CFU/mL Log减少 0 1.1x 106 6.04 NA 0.5 2.9x 104 4.4 1.64 0.7 <2 0.3 5.74
实施例2(b)：计时杀灭测试：30秒钟接触时间
利用0.5％的Citrox BC活性物使用大肠杆菌、铜绿假单胞菌和枯草芽孢 杆菌以30秒钟的接触时间进行计时杀灭研究。对于所有的生物体都见到大 于6.4的对数减少(表5)。这证实了这种活性物将符合食品接触情况中使用 的标准。
表5：时间杀灭测试：30分钟

实施例2(c)：计时杀灭测试：孢子杀灭活性
如上所述，任意抗微生物活性物的最终测试是杀灭孢子的能力。根据定 义，杀灭细菌孢子的任何化学物或者方法是杀灭剂。为了评价Citrox BC活 性物是否是孢子杀灭性的，对实际孢子悬浮液进行杀灭测试。在1小时的时 间测试0.5％至1.5％范围的Citrox BC。这个测试存在一些限制。测试中的孢 子悬浮液(枯草芽孢杆菌，ATCC 6633,6.4x 104CFU/菌块,Microbiologics) 仅为约2x 104CFU/ml，这限制了对数减少计算。发现经冻干的菌块(pellet) 含有活性炭(charcoal)，所述活性炭是已知中和Citrox BC活性物的生物类 黄酮组分的物质。存在这些限制，证明孢子中有约2个对数减少。这表明 Citrox BC活性物具有抗孢子的明确活性。没有活性炭添加剂的较高滴度的 孢子悬浮液应当被用来进一步研究这种活性。
实施例3：使用浸渍有Citrox BC活性物的纸巾进行的表面测试
1)程序：将Citrox BC添加到纸巾中
("Bounty"是Procter&Gamble的注册商标)牌纸巾被用来制造 干燥的抗微生物毛巾。纸巾是常规的可商购获得的纸巾产品。将 Citrox BC活性物浓缩物稀释到所需要的浓度。将一个纸巾完全浸没在稀释 的活性物中，然后用手绞拧。将纸巾干燥过夜。
2)程序： 牌纸巾上干燥的Citrox BC活性物的重量
将牌纸巾于54℃的烘箱中干燥到恒定重量。在牌纸巾 上干燥Citrox BC活性物的各种稀释液，如上所述。在室温将所述纸巾干燥 过夜。然后将经处理的纸巾在54℃干燥至恒定重量。未处理纸巾和经处理的 纸巾之间的重量差假设为Citrox BC活性物的重量。
3)程序：用于测试施用浸渍的纸巾对表面的效果
使用实验室长椅顶部作为代表性的非孔隙性硬表面，使用胶带标出格 栅。使用被挑战生物体的肉汤培养物饱和的棉签(Cotton-tipped swab)对表 面进行接种并且进行空气干燥。将使用Citrox BC活性物的稀释液处理的纸 巾润湿然后用来清洁经接种的长椅顶部。让长椅顶部可见地湿润3分钟(接 触时间)，然后让其完全空气干燥。复制生物检测和计数(RODAC，Replicate  Organism Detection and Counting)板被用来对清洁表面的存活细菌进行采样。 将板在适合于挑战生物体的温度温育过夜。对菌落进行计数并且将数量用于 计算CFU/cm2。通过对来自5个3"x 3"格栅见方的计数进行平均运算来计 算结果。
4)程序：RODAC采样
使用RODAC板来接触待采样的所述表面，然后将板于适当的温度温育。 在培养基中存在促进各种微生物生长的营养物。向琼脂中加入卵磷脂和聚山 梨醇酯80(Polysorbate 80)并且用作消毒剂/消毒杀菌中和剂。通过琼脂培 养基的表面上的菌落外观检测微生物的类型和数量。在使用消毒剂进行清洁 和处理之前和之后从相同区域收集样品从而能够对卫生程序进行评价。
结果
评价使用水润湿并且不含有Citrox BC活性物的纸巾从受污染的硬表面 去除细菌的能力。在图1和2中利用标记为“0”的柱条显示这个对照(即 没有浸渍的纸巾)的结果。图1和2显示了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌两者 的结果。含有大于1:200稀释度的Citrox BC活性物的纸巾能够降低金黄色 葡萄球菌的水平，从大于50CFU/cm2降低至小于1CFU/cm2。含有大于1:200 稀释度的Citrox BC活性物的纸巾能够降低大肠杆菌的水平，从大于7 CFU/cm2降低至小于1CFU/cm2。
这些结果表明，干燥的抗微生物毛巾受润湿所活化。
结果讨论
将不同稀释度的Citrox BC活性物干燥在牌纸巾。这些经处理 的纸巾被用来消除重度接种有细菌的实验室长椅的污染。经处理的纸巾实现 实验室长椅上的污染物的降低的能力使用RODAC板进行评估。
开发出一种评价浸渍有Citrox BC活性物的纸巾降低受污染的硬表面上 的细菌数量的能力的方法。建议将RODAC板用于对存在于具有卫生重要性 的表面上存在的微生物进行检测和计数。RODAC板被专门构造成使得琼脂 培养基被装得过满，从而形成圆顶形状的表面，这样的表面可以在表面上进 行按压以对其微生物内容物进行采样。RODAC板被用于各种程序以确立并 且监测清洁技术和计划。
当使用纸巾加上抗微生物活性物时，必须记住的是，通过两种机制从受 污染的表面移除细菌：第一是通过抗微生物活性物的作用实现的杀灭，并且 第二是通过纸巾本身对污染物进行的机械移除。
使用实验室规模的纸巾来计算在纸巾上干燥的Citrox BC活性物的重 量。存在于纸巾上的活性物的重量可以被用作成本分析的起始点(表6)。
表6：在 纸巾上干燥的Citrox BC活性物的重量