本发明是关于新的有用的1，4-二氢吡啶衍生物。这些衍生物对于抗各类肿瘤细胞（包括耐多种药性的肿瘤细胞）的一些抗肿瘤试剂具有增进活性的作用;本发明也涉及上述衍生物的用途及其制备方法。 更详细地说，本发明是关于式（Ⅰ）所示的新的2，6-二甲基-4-（吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸酯衍生物，其水合物及盐，以及它们的制备方法和在癌的化学治疗中的用途。
式（Ⅰ）中，R1是低级烷基，R2是氢原子、卤原子、低级烷氧基或硝基，而R和R3各自独立地代表烷基、低级烷氧基烷基、芳烷基或（A是直链或支链亚烷基，而R4和R5各自独立地代表氢原子、低级烷基、芳烷基、或互相连接而形成五或六节杂环，该杂环可能含有其他杂原子）。
这里所用的“烷基”一词包括含1～10个碳原子的直链和支链烷基，例如甲基、异丙基、辛基等;低级烷基包括含1～6个碳原子的直链或支链烷基，例如甲基、乙基、异丙基等。芳烷基包括由芳基取代的低级烷基，例如苄基、苯乙基等。低级烷氧基烷基包括由含1～6个碳原子的直链或支链取代的烷基，例如甲氧基甲基、甲氧基乙基等。直链或支链地亚烷基包括，例如亚乙基、2-甲基亚丙基等。可能含有其它杂原子的五或六节杂环包括，例如哌嗪、吡咯烷、哌啶、吗啉、硫吗啉等。卤原子包括，例如氟、氯和溴。
人们不断地进行了以各种新抗肿瘤试剂毁除癌生长的新试验。然而，在各种肿瘤的临床治疗中出现肿瘤细胞对于抗肿瘤药剂的耐药性是个严重的问题，因此，防止这种耐药性是癌的化学治疗中一项重要的课题。
此外，一些复杂因素使这个问题更难于解决。换句话说，对于一种抗肿瘤药剂有耐药性的肿瘤细胞对别的抗肿瘤药剂显示交叉耐药性（耐多种药性简称为MDR），在临床的癌化学治疗中，要克服这种类型的耐药性就更加困难了。
Tsuruo等人（在癌研究（CANCER RES，）44，4303页，1984年;43，2267页，1983年）曾报导临床用作钙管道阻滞剂（calcium channel blocker）、调钙蛋白抑制剂、抗心律失常的药剂可以增进抗肿瘤药剂的活性以克服肿瘤细胞的耐药性。已发现，尤其是维拉帕米（verapamil）、卡罗维林（caroverine）、氯米帕明（clomipramine）、三氟拉嗪、心可定（prenylamine）、233号的VCR及奎尼丁等可增强抗肿瘤药剂在生物体外克服老鼠的白血病细胞（P388/长春新碱（VCR），P388/阿霉素ADR）的活性，在体内维拉帕米也可增强抗肿瘤药剂的活性。
Tsuruo等人（在癌研究43，2905页，1983年）也曾报导用作注入钙的拮抗剂（calcium influx antagonist）的地尔硫（diltiazem）和尼卡地平（nicardipine）以及用作抗心律失常药剂的奎尼丁可增进抗肿瘤药剂在体内和体外克服老鼠P388细胞对VCR或ADR（P388/VCR，P388/ADR）耐药性的活性。
迄今，所报导的抗肿瘤活性的增进剂，主要属于钙拮抗剂或钙阻滞剂。细胞内的钙离子是置于某些特殊组织里的生理机能上的化学中介物，即是说，该化学中介物在心肌兴奋一收缩偶联中，在平滑肌兴奋一收缩偶联中起重要作用。细胞内钙离子的分布和运输在药理作用上是极其关键的。各种钙拮抗剂的药理作用是由于注入钙的被抑制或起作用而引起的。
然而，作为抗肿瘤药剂增进剂的钙阻滞剂，它在疗效方面，由于有严重的有害副作用而限制了它的用途，自然也限制了它们在临床治疗上的应用。
本发明由于分析了上述各种因素而提供了新的一些化合物，这些化合物具有下列特性：
（a）它们显示的毒性小，而且对钙的拮抗作用以及低血压作用均可忽略;
（b）在体外，当它们的浓度低至0.15～3.0微克/毫升时，也能完全逆转对于蒽素环或长春花属生物碱的高耐药性;
（c）在治疗实验中，用抗肿瘤药剂和这些衍生物联合治疗，很明显可产生协同的抗肿瘤效应;
（d）较低剂量的抗肿瘤药剂和剂量尽可能高的本发明化合物相混合是最佳的治疗方案。由于减少了抗肿瘤药剂的剂量，因此，它可以用于避免抗肿瘤药剂在临床化疗中的有害副作用。
（e）联合治疗不仅显示了明显的协同效应，也通过延长存活期显示了对于没有耐药性的肿瘤细胞的治疗效果，从而指出，这些新的衍生物能够克服这些细胞群在抗肿瘤药剂敏感性方面的差异。
总之，这种类型的联合治疗，不但在肿瘤有后天耐药性的晚期阶段可能有疗效，而且在化疗开始阶段也可能有疗效。
下面说明本发明化合物的制备方法，
其中，R1是低级烷基;R2是氢原子、卤原子、低级烷基、低级烷氧基或硝基;R和R3各自独立地代表烷基、低级烷氧基烷基、芳烷基或（A是直链或支链的亚烷基;R4和R5各自独立地代表氢原子、低级烷基、芳烷基或互相连接而形成五或六节杂环，该杂环可能含有其他杂原子）。
（1）换句话说，由式（Ⅱ）代表的起始化合物是在甲酰化试剂如氯氧化磷-二甲基甲酰胺（DMF）等的存在下甲酰化而得到式（Ⅲ）代表的化合物。
（2）在缩合剂存在下，式（Ⅲ）代表的化合物与式（Ⅳ）代表的化合物缩合，得到式（Ⅴ）代表的化合物。适合于该反应的缩合剂是，作为酸性催化剂的有机酸和无机酸，例如盐酸、乙酸等等，作为碱性催化剂的有胺类，例如哌啶、三乙胺等等;苯、甲苯、氯仿、二甲基甲酰胺、四氢呋喃、乙醇等等则作为溶剂。适当的反应温度选择为50～150℃，适当的反应时间选择为0.5～15小时。更详细地说，最好使式（Ⅲ）代表的化合物与0.8～1.5倍摩尔的式（Ⅳ）代表的化合物反应。
（3）在溶剂存在或不存在的条件下，通过加热，使式（Ⅴ）代表的化合物与式（Ⅵ）代表的化合物缩合而得式（Ⅰ）代表的化合物。适合于该反应的溶剂有苯、甲苯、氯仿、二甲基酰胺、四氢呋喃及诸如异丙醇的醇类。更详细地说，最好使式（Ⅴ）代表的化合物与0.8～1.2倍摩尔的式（Ⅵ）代表的化合物于50～150℃反应3～20小时。
此外，如果需要，可用酸（其中R和R3中任何一个是基团）处理式（Ⅰ）化合物以得到可药用的酸式盐。酸可以是有机酸和无机酸，例如盐酸、硫酸、磷酸、乙酸、甲磺酸、草酸、富马酸和乳酸。
式（Ⅰ）化合物及其水合物和盐，可以通常的药物制剂的形式用作药物。例如，这些药物可以是适合于口服、肠胃外、肠胃内或局部施药的片剂、胶囊剂、粉剂、软膏、栓剂、糖浆剂、液剂、悬浮液、喷雾剂或针剂。
下面的实例将进一步说明本发明，但不是对本发明的限制。
实例1
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]-吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸二甲酯
（a）2-乙酰基-3-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）丙烯酸甲酯
于室温与搅拌下，每隔20分钟向4克3-甲酰基-2-异丙基吡唑骈[1，5-a]-吡啶、2.7克乙酰乙酸甲酯和256毫克冰醋酸（于11毫升苯中）的混合液中滴加五分之一哌啶溶液（0.36克哌啶于2.2毫升苯中）。加完后，将混合物回流4小时，同时通过恒压蒸馏分出生成的共沸水。然后加入40毫升苯，并用20毫升饱和碳酸氢钠溶液、20毫升水和20毫升盐水依次洗涤。以无水硫酸钡干燥苯溶液，然后浓缩，得到5.9克深红色液态的标题化合物粗品。再将粗制标题化合物通过硅胶进行薄层层析，以苯为洗脱液，Rf＝0.36。
NMR（CDCl3），δ（ppm）：7.66（1H，S），6.45～8.33（4H，m），3.89（3H，s），3.34（H，m），2.46（3H，s），1.34（6H，d，J＝6.59Hz）
（b）于60～65℃，将5.9克2-乙酰基-3-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）丙烯酸甲酯和2.5克3-氨基巴豆酸甲酯的混合物搅拌4.5小时，然后于100～105℃搅拌8.7小时。反应混合物通过硅胶柱层析，以苯-乙酸乙酯混合液作为洗脱液进行提纯。将洗脱液浓缩并在己烷-苯混合液中再结晶，得到2.6克（31%）黄色针状的标题化合物，熔点244～246℃。
分析 C21H25N3O4
计算值（%）：C，65.78;H，6.57;N，10.96。
实测值（%）：C，65.91;H，6.59;N，10.83。
用例1所述操作方法，可得到以下新的化合物。
例2
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸甲基乙基酯
收率 22%，熔点219～221.5℃。
分析 C22H27N3O4
计算值（%）：C，66.48;H，6.85;N，10.57。
实测值（%）：C，66.73;H，6.87;N，10.58。
例3
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸丁基甲基酯
收率 21%，熔点160～161℃。
分析 C24H31N3O4
计算值（%）：C，67.74;H，7.34;N，9.87。
实测值（%）：C，67.79;H，7.46;N，9.91。
例4
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸叔丁基甲基酯
收率 8%，熔点205.5～206℃。
分析 C24H31N3O4
计算值（%）：C，67.74;H，7.34;N，9.87。
实测值（%）：C，67.75;H，7.41;N，9.91。
例5
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸丁基辛基酯
收率 20%，熔点154～156℃。
分析 C28H39N3O4
计算值（%）：C，69.83;H，8.16;N，8.72。
实测值（%）：C，69.81;H，8.24;N，8.79。
例6
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸-N-苄基-N-甲基-2-氨乙基甲基酯
收率 14%，熔点172～175℃。
分析 C30H36N4O4·0.1 C6H6
计算值（%）：C，70.08;H，7.03;N，10.68。
实测值（%）：C，69.90;H，7.07;N，10.47。
例7
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸甲基-2-二甲基氨乙基酯
收率 6%，熔点136～138℃。
分析 C24H32N4O4
计算值（%）：C，65.43;H，7.32;N，12.72。
实测值（%）：C，65.44;H，7.48;N，12.98。
例8
2，6-二甲基-4-（2-异丙基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸甲基-2-（4-甲基-1-哌嗪基）乙基酯
收率 6%，熔点102～104℃。
分析 C27H37N5O4·0.3C6H6
计算值（%）：C，66.64;H，7.53;N，13.49。
实测值（%）：C，66.78;H，7.54;N，13.25。
例9
2，6-二甲基-4-（2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）-1，4-二氢吡啶-3，5-二羧酸甲基-2-（N-苄基-N-甲基氨基）乙基酯
（a）3-甲酰-2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶
在保持温度低于20℃和搅拌下，向116.6毫升二甲基甲酰胺中加入105毫升三氯氧化磷，再加入99克2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶。反应混合物在50～60℃搅拌1小时，然后倾入冰水中。酸性水溶液以碳酸钾中和，然后用二氯甲烷提取，用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，然后浓缩。得到的残余物从甲醇中再结晶，得到54.8克（46%）无色晶状的标题化合物，熔点77～79℃。
（b）2-乙酰-3-（2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）丙烯酸甲酯
把由54克3-甲酰-2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶、47.1克乙酰乙酸甲酯、20.6克苯甲酸和2.9克哌啶在甲苯（200毫升）中形成的溶液回流9小时，其间每隔3小时加入2.9克哌啶，而产生的共沸水通过恒压蒸馏分离。反应混合物依次用饱和碳酸氢钠溶液和盐水洗涤，以无水硫酸钠干燥，然后浓缩。冷却后，产生的晶体以过滤法分离，得到40.7克暗红色的液态标题化合物粗品。
（c）将24.9克2-乙酰基-3-（2-甲基吡唑骈[1，5-a]吡啶-3-基）丙烯酸甲酯和28.8克3-氨基巴豆酸-2-（N-苄基-N-甲基氨基）乙酯的异丙醇（125毫升）溶液回流8.5小时，然后浓缩，产生的残余物溶解于100毫升乙酸乙酯中，用1N盐酸洗涤，然后用2N盐酸提取3次。产生的盐酸层用5N氢氧化钠水溶液碱化至pH9，然后用乙酸乙酯提取。乙酸乙酯层用盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，再浓缩。将己烷加入残余物中，收集不溶解层，然后从乙醚-己烷混合液中再结晶。
用过滤方法，将晶体与溶液分离，用乙醚洗涤，然后从苯-己烷混合液中再结晶，得到1.6克（3%）黄褐色晶状标题化合物，熔点118～120℃
分析 C28H32N4O4
计算值（%）：C，68.83;H，6.60;N，11.47。
实测值（%）：C，68.85;H，6.72;N，11.35。
实验1
可以看出，本发明的衍生物增强了抗肿瘤药剂的活性，其效力等于试管内培养的P388/VCR和P388/ADR细胞耐维拉帕米和硝苯定的能力。用马格纳斯氏的方法（Magnus′s Method），以摘出的豚鼠盲肠条标本求出的松弛效应的相关剂量中，本发明衍生物显示的钙拮抗作用的值（pA：5.6～6.1）比维拉帕米的值（pA∶7.5）和硝苯啶的值（pA∶8.8）低。
以维拉帕米和硝苯啶作为阳性对照物，检验特发性高血压鼠（SHR）血压，结果显示了钙拮抗剂的典型效应，即是说，观测到分别降低41和25毫米汞柱。但在同一实验中，本发明衍生物没有显示低血压作用（参阅表1）。
实验2
将一百万个P388/VCR细胞移植于CDF1小雌鼠的腹腔内。连续5天，每天在腹腔内施以下述药剂两次（分为早、晚各1次）：VCR（0.1毫克/公斤）或例6的化合物或维拉帕米（用表2所示剂量）溶于无菌的生理盐水中。
在延长生命方面，本发明化合物与VCR合并使用，显著优于与维拉帕米合并使用。通过本发明化合物，可使有耐药性的肿瘤的细胞耐受VCR的能力几乎完全逆转（参阅表2）。
实验3
本发明化合物的疗效，可按例2所示的条件，以带有P388细胞母系（对VCR敏感的）鼠进行检验。与未经处理的对照组相比，单用VCR剂量（0.1毫克/公斤）约可使生命延长2倍，但没有观察到完全治愈的小鼠（参阅表3）。
另一方面，用CVR和本发明的化合物联合治疗，不但可以得到延长生命的最高效果，而且可以完全治愈小鼠（剂量为50×2毫克/公斤的一组，有1/6完全治愈;剂量为75×2毫克/公斤的一组，有3/6完全治愈）。