含纤维素酶的洗涤剂 本发明涉及具有改善的性能的新纤维素酶在洗涤剂和含水洗衣液中的用途。本发明还涉及含有该新纤维素酶的洗涤剂和洗涤剂添加剂。
纤维素酶也称作溶纤酶，是一种能够水解纤维素中的β-D-糖苷键的酶。习惯上已把溶纤酶分为三类：内切葡聚糖酶,外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶(cellobiohydrolases)以及β-葡糖苷酶(Khowles，J.等人，(1987)，TIBTECH 5，255-261)。溶纤酶可以通过许多细菌，酵母和真菌生产。如在GB-A-2094826中描述了生产纤维素酶的微生物。
现已针对溶纤酶的用途而研制了几种应用：-将(木质)纤维素纸浆降解为用于(生物)乙醇生产的糖；-类似于“石洗”和“生物磨光”的几种织物处理；-在洗涤组合物中的应用。
正如在例子GB-B-1358599中所述，纤维素酶在洗涤剂中的使用起因于纤维素酶能够降低含织物的棉布的粗糙度，即软化该棉布。
此外还知道含纤维素酶的洗涤组合物在除去污物，即去污中非常有效。在织物去污方面，在一段时间内已经确认了溶纤酶、纤维素酶的效能。GB-A-2075028、GB-A-2095275以及GB-A-2094826公开了含纤维素酶的洗涤组合物可用于改进去污效能。
在本领域中也已知纤维素酶在洗衣洗涤剂中可以起到颜色澄清剂的作用。在反复洗涤弄脏的织物后，含棉织物会呈灰色，而这最可能是由于由机械作用引起的破坏的织物造成的。织物被扯碎从而造成破碎的混乱的织物。在EP-A-0220016中已经描述了纤维素酶用作有色织物的颜色澄清剂地用途。实际上，在洗涤剂中通常都使用了来自真菌菌株Humicolainsolens(DSM 1800)的纤维素酶混合物，从而带来了抗起球以及颜色恢复的性能。由野生型微生物产生的溶纤酶系统可以从Novo-Nordisk以商品名Celluzyme得到。此外，来自于同一来源、商品名为Carezyme的克隆的(单一)纤维素酶也用于洗涤剂中。
在本领域中已知的、表明具有颜色澄清作用的纤维素酶主要的缺点在于这些酶侵蚀性地降解含有纤维素的织物，从而造成由不希望有的织物抗拉强度的损失而引起的破坏。
另一方面，在本领域中已知的、表明具有良好去污性能的纤维素酶几乎不显示出任何颜色澄清效果。世界上第一种含纤维素酶的商业洗涤剂含有一种细菌的纤维素酶。该酶为一种如上所述的来自于芽孢杆菌物种且不破坏纤维素织物的碱性内切葡聚糖酶。已经描述该酶在洗涤过程中具有去污效果。但尚未描述该酶抗起球或颜色恢复的效果。
从以上可以明确一点，即在洗涤剂应用中仍然需要提供改进的纤维素酶。正如在国际专利申请WO-A-95/02675中所表明的，在洗涤衣物中纤维素酶混合物的使用应当提供上述性能，但就我们所知以前在洗涤衣物中不可能使用提供所有这些特性的单一酶。
令人吃惊的是现已发现某些单一纤维素酶的使用根本不会造成对所洗涤的织物无法接受的破坏，而该酶在洗涤衣物中能够去污、抗再沉积、颜色澄清和抗起球。
因此，本发明涉及单一纤维素酶在含水洗衣液中的用途，该酶的抗拉强度损失(在本文中称作TSL)与抗起球性能(在本文中称作AP)之比小于1。
测量抗拉强度损失是一种测量由机械应力或者酶促作用引起的对织物的破坏的方法。应当了解到为了本发明的目的，必须使用棉纤维。该方法在潮湿的条件下测量了单织物的抗拉强度。上述方法在德国标准DIN53.857，第一分册以及国际标准ISO 2267中均有描述。
因为通常仅在大约20至25次洗涤循环后才表明数量上显著的效果，所以在洗涤过程中总是存在一些由作用于棉纤维的机械力而引起的抗拉强度损失。因此必须减去对照织物的抗拉强度损失，该对照织物是采用不含纤维素酶、但其它配方相同的洗涤剂以及相同类型的洗衣机和洗涤程序进行洗涤的。为了校正该数值，采用从Humicola insolens(EG V)制备的、在洗涤剂中与酶促蛋白相等量的(单一)内切葡聚糖酶V作标准物，并且取该样品抗拉强度损失的数值减去不含纤维素酶的洗涤剂的对照值作为100％TSL。例如在国际专利申请WO91/17243中已经描述了该纤维素酶EG V。例如可以通过采用由R.E.Brown等人在生物化学年评.1989，vol.180，p.136-139中所描述的BCA Pierce方法来测量蛋白质的量。
一种可以从Kao公司得到的、商标为KAC500和KAC700的上述芽孢杆菌的纤维素酶制剂可以用作比较物，与不含纤维素酶的对照洗涤实验相比该比较物通常会造成非常低的抗拉强度损失。
纤维素酶时棉织物表面上凸起的微纤丝、绒球以及棉布绒毛的攻击会造成肉眼可见的这些绒球的去除。为了检测该效果，通过所述的用于测定TSL的方法，使用含有或不含纤维素酶的洗涤剂进行洗涤。在增加洗涤循环次数之后，也可以很好地观察到抗起球的效果。因此通常使用15到40次的洗涤循环来显示纤维素酶的这一效果。
有三种不同的方法可以用于定量该效果：1.通过一个测试组(专家小组)用肉眼评价；2.测量光线反射(CIELAB-系统的L-值)；3.通过光学测量来测定棉布绒毛。
U.Hotz在Tenside Surf.Det.1993，vol.30，p.388中描述了使用CIELAB-系统(Commission Internationale de I Eclairage)的L-值进行的测定。
在测定抗起球性能的优选方法中使用的光学测量系统通常由光源、显微镜筒以及记录从织物表面反射的光线的CCD有色照相机组成。由数字图象分析测量的反射光的量随在织物表面上绒球和绒毛的数量而发生变化。通常在15至40次的洗涤循环后，可以把上述系统用于定量测量织物上绒球和绒毛的量，其中洗涤循环取决于加入到洗涤剂中的纤维素酶的类型和活性。T.Muller-Kirschbaum和H.Grundmann在SOFW，vol.118(1992)，p.483-499中已经描述了一种用于测量起球程度的光学系统。
无论使用何种方法测定待检测的纤维素酶的抗起球效果，由于考虑到使用不舍纤维素酶的洗涤剂所产生的数值，必须在相同的条件下检测标准的纤维素酶EG V并且必须通过同样的方法测定其效果。从EG V得到的数值作为AP＝100％。
正如从上述定义可以看到的，来源于Humicola insolens的已知的纤维素酶EG V的TSL与AP之比为1。由于可以从Kao公司得到的、商标为KAC500和KAC700的上述芽孢杆菌纤维素酶具有低的AP和非常低的TSL，所以可以看到该纤维素酶的比值也大约为1。根据本发明可以使用的纤维素酶、尤其是那些在洗涤剂中使用的纤维素酶，其TSL与AP的比值应当尽可能地小于1，优选地小于0.8，且更优选在0.001至0.5的范围内。比如TSL与AP的比值为0.5时是指在与标准纤维素酶产生相同的抗起球效果的酶浓度下仅观察到有50％的抗拉强度损失。
含水洗衣液优选含有根据以上所定义的纤维素酶，其浓度为0.01mg/l至0.2mg/l，特别是0.015mg/l至0.1mg/l。上述浓度是指溶纤蛋白质的重量。此外，通常在洗衣液中发现的所有成分都会存在。
本发明的另一个方面是TSL与AP之比小于1的单一纤维素酶在用于给织物、特另别是有色织物带来抗-变灰作用上的用途。
在本发明的另一个方面，TSL与AP之比小于1的单一纤维素酶被用于给织物带来软化作用。
本发明也涉及TSL与AP之比小于1的单一纤维素酶在用于使织物颜色澄清或抑制织物、特别是有色织物褪色上的用途。
本发明还涉及TSL与AP之比小于1的单一纤维素酶在用于抑制织物起皱并减少对织物的熨烫上的用途。
我们发现根据本发明定义的单一纤维素酶并不象从前已知可以提供颜色澄清作用的纤维素酶的混合物那样，它不把棉布分解到引起抗拉强度损失的人们所不希望的程度。
我们还发现在使用根据本发明定义的纤维素酶的过程中，该酶并不象从前已知可以提供颜色澄清作用的纤维素酶那样，在反复地洗涤衣物后该酶并不在织物上积累。
另一方面，本发明涉及含有根据以上定义的单一纤维素酶的洗涤组合物、洗涤剂添加剂以及织物软化组合物。
正如以前所指出的，本发明总的来说涉及新的纤维素酶的用途。但在更详细地公开本发明之前，将定义以下术语：
“纤维素酶”是针对作用于纤维素及其衍生物，并且将其水解为葡萄糖、纤维二糖或者纤维寡糖的酶的通用名。
本文所使用的术语“单一”纤维素酶意指由一种基因生产的纤维素酶。
从一种与纤维素酶有关的微生物“可以得到的”是指该纤维素酶具有与可以从该微生物得到的纤维素酶的氨基酸序列相对应的氨基酸序列。
“衍生物”是指从天然蛋白质中衍生出来一种蛋白质，它可以通过在天然蛋白质的C-和N-末端的任一端或者两端添加一个或多个氨基酸、在天然氨基酸序列中的一个或多个不同的位点处取代一个或多个氨基酸、在天然蛋白质的任一端或两端或者在该氨基酸序列的一个或多个位点处缺失一个或多个氨基酸、或者在天然氨基酸序列的一个或多个位点处插入一个或多个氨基酸来实现。衍生物的制备通常是通过修饰编码该天然蛋白质的DNA序列、将该DNA序列转化到一个合适的宿主中以及表达该修饰过的DNA序列以生成该衍生蛋白质来实现的。本发明的衍生物包括含有与前体酶的氨基酸序列相比(例如根据本发明的一种野生型或者天然状态的酶)进行了改造的氨基酸序列的肽，这种肽保留了该前体酶特有的酶的性质，但在一些特殊的方面则具有改造了的特性。例如，改造了的纤维素酶可能具有增加的最佳pH值或增加的温度抗性，但是它仍保留其特有的纤维素酶活性。该衍生物也包括在酶分子中氨基酸残基的化学修饰物。
“宿主细胞”是指对于含有编码天然蛋白质或衍生物的DNA的重组DNA载体而言，具有可以用作宿主和表达载体能力的细胞。
术语“去污”是指去除附着在衣物上的污物。
在本文中，术语“起球”是指由于破碎或者混乱的织物而在含棉织物表面上形成绒球和绒毛。
使用术语“抗起球”用来描述在含棉织物表面上防止绒球和绒毛的形成以及从含棉织物中除去绒球和绒毛。当处理有色含棉织物时，抗起球通常会导致颜色澄清。
在本文中，术语“颜色澄清”是指恢复含有基于纤维的纤维素的有色织物或者由基于纤维的纤维素组成的有色织物具有吸引力的新鲜的外观，其中该有色织物经处理、尤其是经洗衣洗涤剂处理后已经带有灰色的外观。
在本文中，术语“再沉积”是指在衣物洗涤或织物处理过程中，沉积已从该织物或织物中去除的污物或有色成分。
在本文中，术语“抗再沉积”是指纤维素酶防止或消除在织物上再沉积污物和有色成分的作用。
“洗衣液”是指一种用于洗涤、漂洗或调理、例如软化织物的水溶液。
在一个优选的方面，本发明涉及一种可以从微生物得到的纤维素酶的用途，其中该微生物已根据国际承认的用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于1993年12月23日保藏在荷兰Baarn的真菌菌种保藏中心，保藏号为CBS 669.93和CBS 670.93(在国际专利申请WO-A-95/18219中有所描述)。已把该菌株分类为芽孢杆菌属的一个新种，该菌株不属于任意一种目前已知的rRNA-组芽孢杆菌。正如在本文中所使用的，将保藏的菌种称为CBS 669.93和CBS 670.93。
微生物可以从例如在象碱性土壤和苏打湖这样的碱性环境中收集到的水和土壤样品中得到。
随后采用羧甲基纤维素(CMC)-琼脂扩散分析来筛选该微生物。分离在该测试中显示有澄清区的菌株作为潜在的纤维素酶生产菌株。构建耐碱性的纤维素酶生产菌株的基因组的基因文库。通过在CMC-琼脂上的琼脂扩散来筛选重组克隆。分离在菌落周围显示有澄清区的重组克隆。通过在4*YEP中、于30℃下发酵该重组克隆48小时来生产该单一纤维素酶。在上述定义的用于测量TSL和AP的实验中测试得到的单一纤维素酶，其中该纤维素酶也可以选择性地如实施例1所述进行纯化。
令人感到吃惊的是，我们发现可以从CBS 670.93或CBS 669.93得到的纤维素酶在两种测试中均显示有良好的性能并且其TSL与AP之比小于1。
在本发明一个优选的实例中，使用了从CBS 670.93得到的大约为50kD的纤维素酶(该纤维素酶是以成熟蛋白的氨基酸序列(SEQ ID No.2)为基础进行计算的，本文中将该纤维素酶称为“BCE 103”)。通过采用由Pearson和Lipman在美国科学院学报，vol.85，pp.2444-2448(1988)中所描述的TFastA程序(基因计算机集团的序列分析软件包6.0版，威斯康星大学生物技术中心，麦迪逊，成斯康星)来分析编码大约为50kD的纤维素酶的氨基酸序列的基周，已经表明该纤维素酶与芽孢杆菌N-4的纤维素酶CelA(Fukumori等人，细菌杂志，vol.168，pp.479-485)具有89％的序列相同性和92.5％的序列相似性。在SEQ ID No.3中给出了BCE 113的氨基酸序列。本发明还包括纤维素酶以及含有该纤维素酶的洗涤剂的用途，其中该纤维素酶与BCE 113的氨基酸序列间具有大于89％、优选地大于95％的序列相同性和/或大于92.5％、优选地大于97％的序列相似性。
在本发明一个同样优选的实例中，使用了从CBS 669.93得到的大约为63kD的纤维素酶(该纤维素酶是以成熟蛋白的氨基酸序列为基础进行计算的，本文中将该纤维素酶称为“BCE 113”)。通过采用由Pearson和Lipman在美国科学院学报，vol.85(1990)，p.2444-2448中所描述的TFastA程序(基因计算机集团的序列分析软件包6.0版，威斯康星大学生物技术中心，麦迪逊，威斯康星)来分析编码大约为63kD的纤维素酶的氨基酸序列的基因，已经表明该纤维素酶与Bacillus lautus的纤维素酶CelB(Jorgensen等人基因，vol.93(1990)，p.55-60)具有58％的序列相同性和72％的序列相似性。在SEQ ID No.3中给出了BCE 113的氨基酸序列。本发明还包括纤维素酶以及含有该纤维素酶的洗涤剂的用途，其中该纤维素酶与BCE113的氨基酸序列间具有大于58％、优选地大于80％、特别是大于90％的序列相同性和/或大于72％、优选地大于80％、特别是大于90％的序列相似性。
可以在本发明的洗涤剂中使用的纤维素酶除了其TSL与AP之比小于1以外，它通常在如实施例4所述的抗再沉积测试中表现出良好的性能。通过反射率测量可以测量白色织物的洁白度的保持。反射率值越高，在抗再沉积性能方面所测试的纤维素酶就越有效。在如实施例4所述的软化测试中它们也表现出良好的性能。去球是指除去通常使有色含棉织物显得发灰的、被弄乱和/或破碎的小织物和/或微纤丝。混乱和/或破碎的小织物除去得越多，有色含棉织物外观越好。去球效果可以通过一个专家小组进行判断或者可以通过一个如上所述的用于测量AP的图象分析系统进行定量。满足上述规定比值要求的纤维素酶通常显示有如下特性：在如实施例所定义的抗再沉积测试中，它们的ΔREM至少为4个单位、优选至少为5个单位，并且它们具有与可从CBS 670.93得到的纤维素酶至少相当的去球效果。
可以通过采用基因工程研制出来的方法来生产可用于本发明的纤维素酶。第一步，编码本发明的纤维素酶的基因可以采用λ-噬菌体(表达)载体和大肠杆菌宿主细胞进行克隆。另一方面，可以采用在保守区上设计的共有引物进行PCR克隆。已经表明编码本发明的纤维素酶的基因在大肠杆菌中的表达产生了一种活性的蛋白质。
在大肠杆菌中的第一个克隆步骤之后，可以把纤维素酶的基因转移到一个更为优选的工业用的表达宿主中，如芽孢杆菌属或链霉菌属、丝状真菌(如曲霉属)或者酵母菌株中。在这些宿主生物体中可得到的高水平的表达和分泌会使本发明的纤维素酶在发酵培养基中进行积累，随后可以从中回收该纤维素酶。
本发明的纤维素酶优选以8·10-5％重量份数(0.8ppm)至8·10-3％重量份数(80ppm)的量，特别是1·10-4％重量份数(1ppm)至4·10-3％重量份数(40ppm)的量用于阳离子、两性或两性离子类表面活性剂以及这些种类的表面活性剂的混合物中，其中纤维素酶的重量是指溶纤蛋白质的重量。本发明的洗涤组合物可以包含在本领域中已知的其它的洗涤剂组分，例如助洗剂，漂白剂，漂白活化剂，防腐剂，螯舍剂，污垢隔离剂，香料，其它酶，酶稳定剂等等。
合适的助洗剂特别为那些选自下列种类的物质，包括：聚羧酸，特别是聚丙烯酸，异丁烯酸，马来酸及其共聚物以及如在国际专利申请WO-A-93/16110中所述的氧化的糖类；层状硅酸盐，特别是膨润土；铝硅酸盐，特别是沸石；晶状或无定形的碱金属硅酸盐，特别是硅酸钠；以及碱金属碳酸盐，特别是碳酸钠。所提及的聚羧酸通常以其碱金属盐的形式，特别是以其钠盐或钾盐的形式而使用。优选掺入的沸石特别为那些A，P或X类的沸石或其混合物。优选的碱金属硅酸盐为那些SiO2与碱金属氧化物的摩尔比为1.5至3.0的碱金属硅酸盐。上述助洗剂优选以20％重量份数至80％重量份数的量存在于本发明的洗涤剂中。
非离子表面活性剂可以优选地以不大于10％重量份数的量，更优选以2％重量份数至6％重量份数的量存在于本发明的洗涤剂中，其中的重量份数以洗涤剂总重量为基准。合适的非离子表面活性剂为在烷基部分含有10至22个碳原子的烷基聚糖苷以及线性或支链C10-22烷氧基化物，特别是乙氧基化物和/或丙氧基化物并且优选为C12-18醇。该醇的烷氧基化作用的程度介于1和20之间，优选介于3和10之间。它们可以按照已知的方法、通过相应的醇与相应的亚烷基氧化物反应进行制备。尽管脂肪族醇衍生物的支链异构体、特别是所谓的氧代醇(oxoalcohols)可以用于生产可用的烷氧基化物，但是该衍生物还是特别合适的。因此，含有线性的十二烷基、十四烷基、十六烷基或十八烷基的伯醇的乙氧基化物及其混合物特别有用。此外，也可以使用烷基胺、连二醇(vicinal diols)和羧酸酰胺的相应的乙氧基化作用和/或丙氧基化作用的产物，其中该产物与所述的醇在烷基部分相对应，并且可以使用在烷基部分含有5至12个碳原子的烷基酚的乙氧基化作用和/或丙氧基化作用的产物。
尽管可以使用其它类型的阴离子表面活性剂，诸如可以从长链烷基或烷基苯基聚乙二醇醚和氯乙酸得到的肥皂、长链N-酰基肌氨酸盐、脂肪酸氨基氰的盐或者醚酸的盐，但是合适的阴离子表面活性剂特别为硫酸盐或磺酸盐类型的阴离子表面活性剂。阴离子表面活性剂优选以钠盐的形式使用。表面活性剂优选以2％重量份数至30％重量份数的量、并且更优选以5％重量份数至20％重量份数的量存在。
特别合适的硫酸盐类的表面活性剂为含有10到20个碳原子的天然或合成来源的长链伯醇的硫酸单酯、即脂肪族醇的硫酸单酯以及链长相同的仲醇的硫酸单酯，该脂肪族醇诸如有椰子油脂肪族醇，动物脂脂肪族醇，油醇或C10-20氧代醇。脂肪族的伯醇、仲醇的硫酸单酯以及用1至6摩尔环氧乙烷乙氧基化的烷基苯酚是特别合适的。硫酸化的脂肪酸链烷醇酰胺以及硫酸化的脂肪酸单酸甘油酯也是合适的。
磺酸盐类型的表面活性剂主要为含有C9-15烷基的烷基苯磺酸盐，在醇的部分中含有6至22个碳原子的磺基琥珀酸单酯和双酯以及α-磺基脂肪酸的酯，例如氢化椰子油、棕榈仁油或动物脂肪酸的α-磺化甲酯或乙酯。其它合适的磺酸盐类的表面活性剂为可以从C12-18烷烃通过氯磺化作用或者磺化氧化作用以及随后的水解或中和作用或者通过在烯烃中加入亚硫酸氢盐得到的烷基磺酸盐，以及烯烃磺酸盐、即烯烃与羟基烷基磺酸盐的混合物，并且还有例如通过用气态三氧化硫磺化以及随后经该磺化作用产物的碱性或酸性水解从具有末端或内部双键的长链单烯烃得到的二磺酸盐。
漂白剂优选选自含有过氧化剂(peroxygen)类型的物质，如过氧化氢，碱金属过硼酸盐，碱金属过碳酸盐，碱金属过硅酸盐和/或碱金属过硫酸盐。特别优选的是高硼酸钠的一水合物和过碳酸钠。漂白剂可以以5％重量份数至25％重量份数的量、特别是7％重量份数至20％重量份数的量存在。
漂白活化剂化合物具体包括N-酰基或O-酰基化合物，例如聚酰化亚烷基二胺，特别是四乙酰基1，2-乙二胺；N-酰化三嗪，特别是1，5-二乙酰基-2，4-二氧代六氢化-1，3，5-三嗪；酰化甘脲,特别是四乙酰基甘脲；N-酰化乙内酰脲，酰肼，三唑，尿唑，二酮哌嗪，砜基酰胺和氰尿酸盐；还有羧酸酐，特别是邻苯二甲酸酐；羧酸酯，特别是异壬酰氧基苯磺酸盐；以及酰化的糖的衍生物，特别是五乙酰基葡萄糖。漂白活化剂可以按常规的方式用形成外壳的(shell-forming)物质加以覆盖或者可以选择性地使用造粒设备进行造粒，并且如果需要的话还可以含有其它的添加剂，例如染料。优选使用在洗涤条件下会生成具有2至12个碳原子的过氧化羧酸、特别是过氧化乙酸的漂白活化剂。一种特别优选的漂白活化剂为用羧甲基纤维素造粒的、平均颗粒大小为0.01mm至0.8mm的四乙酰基1，2-乙二胺(TAED)，该物质可以通过欧洲专利EP-B-0037026中所述的方法进行生产。除了以上所提及的漂白活化剂以外，甚至可以使用代替该活化剂的所谓的漂白催化剂，其中漂白催化剂为过渡金属络合物。
在本发明的洗涤剂中可以存在的酶除了所定义的纤维素酶以外，还有蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、支链淀粉酶、其它的纤维素酶、半纤维素酶、木聚糖酶、氧化酶和/或过氧化物酶。上述酶可以以最高达5％重量份数的量存在，优选为0.2％重量份数至2％重量份数的量存在。
本发明的洗涤组合物可以按任意一种常规的方式配制成如粉末状或液体。为了生产出具有例如650g/l至950g/l的高表观密度的洗涤剂，优选如在欧洲专利EP-B-0486592中所述的使用挤压步骤的方法。
含有本发明的纤维素酶的织物软化组合物还可以包含对该纤维素酶的阳离子表面活性剂，优选地是所谓的esterquat类表面活性剂，该物质能够软化织物并且可以提高该组合物软化织物的性能。
实施例实施例1：纤维素酶的产生-筛选纤维素酶产生微生物
使用两种方法分离纤维素酶-产生微生物：
1)把土壤和水样悬浮于0.85％的盐水溶液并直接用于羧甲基纤维素(CMC)-琼脂扩散分析中以检测纤维素酶产生菌落。
2)通过在40℃下、在含有液体基本培养基或GAM-培养基的纤维素中温育1至3天来富集含有菌株的土壤和水样中的纤维素酶。-分离耐碱性纤维素酶产生菌株
把在琼脂扩散分析中显示有澄清区的菌株在温育摇床上(NewBrunswick Scientific，Edison，新泽西，美国)，于250r.p.m.、40℃下，在100毫升摇瓶里的25毫升GAM-培养基中发酵72小时。于pH9和40℃下，在发酵肉汤中测定CMC酶活性。-分离纤维素酶基因
在质粒pTZ18R中构建耐碱性的纤维素酶产生菌株的基因组的基因文库(Mead，D.A.等人(1986)蛋白质工程1，67)。通过由Wood，P.J.等人在《酶学中的方法》(1988)160，59-74中所述的CMC-琼脂上的琼脂扩散筛选重组克隆。把在菌落周围显示有澄清区的菌株进行分离。在4*YEP-培养基中、于40℃下发酵48小时后，测定重组菌株的CMC酶活性。分离该重组菌株的质粒DNA并且插入片段的特点在于限制酶分析与核苷酸序列分析。-培养基
在CMC-琼脂扩散分析和富集方法中使用的基本培养基(pH9.7)由KNO31％，酵母提取物(Difco)0.1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，Na2CO3 1％，NaCl4％和0.25％CMC(Sigma C-4888)组成。为了固化加入1.5％的琼脂。
用于供体菌株的酶的产生的复合培养基(GAM)由胨(Difco)0.5％，酵母提取物(Difco)0.5％，葡萄糖·H2O 1％，KH2PO4 0.1％，MgSO4·7H2O 0.02％，Na2CO3 1％，NaCl 4％所组成。在加入1％CMC后用4M HCl调节pH至9.5。
用于在大肠杆菌重组菌株中酶的产生的复合培养基(4*YEP)由酵母提取物(Difco)4％，胨(Difco)8％，乳糖0.2％，氨苄青霉素100μg/ml组成。-菌落的CMC-琼脂扩散分析
把在0.85％盐水溶液中的细胞悬浮物涂布在含有基本培养基的CMC上。在40℃下温育1至3天后，将该平板进行平板复制并用0.1％的刚果红淹没亲代平板15分钟。用1M NaCl使该平板脱色30分钟。将在菌落周围显示有一个澄清区的菌株作为一个潜在的纤维素酶产生微生物而加以分离。-液体部分的CMC-琼脂扩散分析
用移液管从培养皿中-层5毫米的基本培养基中吸取40μl酶溶液或发酵肉汤的等分试样到朝外穿孔的孔中。在40℃下温育16小时后，通过刚果红/NaCl处理来检测纤维素酶的活性。澄清区域的直径是CMC酶活性的测量手段。-产生纤维素酶
该实验导致分离出纤维素酶产生微生物，此后该微生物以CBS 670.93保藏。该微生物分类为芽孢杆菌属的一个新种。以CBS 670.93菌株作为供体菌株的克隆实验会导致分离出一个大肠杆菌克隆，其能够产生称为BCE103的纤维素酶。分析编码所说纤维素酶的基因的核苷酸序列。通过使用用于获得肽以及对肽测序的标准方法(Finlay和Geisow(Eds.)，蛋白质测序-一种切实可行的方法，1989，IRL出版社)，从纤维素酶BCE 103中测定N-末端氨基酸序列。利用N-末端氨基酸序列作为成熟蛋白质的起点，从核苷酸序列推导出该纤维素酶的氨基酸序列。
BCE 103的核苷酸序列显示于SEQ ID No.1中，氨基酸序列显示于SEQID No.2中。-纯化纤维素酶
发酵后，经离心(8000rpm)从培养液体中分离细胞。用硫酸铵(65％饱和)沉淀上清液中的纤维素酶。将该沉淀溶解在含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐缓冲溶液中，直至电导率达到7mS/cm。在用含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐缓冲溶液洗涤Q-琼脂糖凝胶FF(直径5cm，长10cm)阴离子交换柱直至其吸水性达到0.2AU之后，再将上述溶液加入柱中。在80分钟内使用溶解在pH为7的25mM磷酸盐中的0至0.5M NaCl的梯度，随后在10分钟里使用从0.5至1M NaCl的梯度。洗脱发生在第一梯度或第二梯度中，取决于加入到该柱中的纤维素酶。洗脱后，用1M NaOH清洗(向上流动)该柱并用含有5mM EDTA、pH7的25mM磷酸盐再次平衡该柱。所得到的纤维素酶纯度达到大约80％，取决于洗脱过程。-确定特征CMC酶分析
采用PAHBAH方法的改进方法(Lever M.Anal.生物化学1972，47，273-279和Lever M.Anal-生物化学1977，81，21-27)进行纤维素酶活性的分析。方法
试管中装有250μl溶于pH为9的50mM甘氨酸缓冲溶液的2.5％CMC(低粘度的CMC从Sigma公司购买)和250μl的纤维素酶的等分试样，并用合适的缓冲溶液进行稀释。在40℃的水浴中温育该试管30分钟，之后加入1.5毫升含有100μl铋溶液(在100毫升中含有48.5克硝酸铋，28.2克酒石酸钾钠和12.0克NaOH)的当日新制备的PAHBAH溶液(溶于100毫升0.5M NaOH的1％PAHBAH)。在70℃下加热该混合物10分钟，之后在冰上冷却2分钟。在410nm下测量其吸收。为了消除酶样品的本底吸光度，进行如下的对照实验：在与该测试试管相同的条件下温育含有底物的试管。温育后，加入1.5毫升PAHBAH和酶制剂(按照上述顺序加入)。一个单位(U)定义为每分钟、每克产物以还原糖测定时从CMC等价物产生1μmol葡萄糖的酶的量。
用于测定pH/温度分布的缓冲溶液为一个磷酸盐/柠檬酸盐体系。采用一种固定的酶浓度可以测定pH/温度分布，其中酶浓度满足在pH7和40℃下测量的剂量响应分布的线性范围。该酶浓度可以在所有其它的测定条件下用于活性的测定。
纤维素酶BCE 103的结果显示于图1。该纤维素酶在碱性pH下显示出良好的活性，这使得该纤维素酶适于在具有碱性pH的洗涤剂中使应用。实施例2
从亲碱性芽孢杆菌菌株CBS 669.93开始的类似方法会产生纤维素酶BCE 113。有关纤维素酶BCE 113的结果显示于图2中。该纤维素酶在碱性pH下也显示有良好的活性，这使得该纤维素酶适于在具有碱性pH的洗涤剂中应用。实施例3：测量抗拉强度与抗起球
如上述为了计算TSL而进行洗涤实验，该实验使用作为洗涤剂基质的Colour Detergent，其不含漂白剂、不含香料和酶(每个洗涤循环使用105克洗涤剂，pH10.5)，洗衣机为MieleW717型洗衣机，温度为40℃，程序为“普通程序”，采用的水的硬度为16°dH(德国硬度)，洗涤负荷3.5千克，25次洗涤。
在同样的洗衣机中平行进行使用本发明的组合物的实验(D1)以及比较实验(C1至C3)：C1：不含纤维素酶的洗涤剂基质C2：洗涤剂基质+0.288毫克来自Humicola insolens的内切葡聚糖酶VC3：洗涤剂基质+来自Humicola insolens、以小粒的Celluzyme0.7T
出售的纤维素酶混合物D1：洗涤剂基质+0.288毫克纤维素酶BCE 103D2：洗涤剂基质+0.288毫克纤维素酶BCE 113表1：TSL-测量的结果(％) 组合物 TSL C1 0 C2 100 C3 38 D1 12
使用MieleW914型洗衣机，在其余均相同的条件下给出以下结果：表2：TSL-测量的结果(％) 组合物 TSL C1 0 C2 100 D2 0.6实施例3：测量抗起球以及计算TSL与AP的比值
为了更好地定量评价效果，采用增加浓度的纤维素酶进行抗起球性能的评价。在“起球的”运动衫棉布材料(采用不含纤维素酶的洗涤剂在60℃下洗涤25次)上使用添加有纤维素酶的如表3所给出的ColourDetergent(5g/l，在40℃下经10次洗涤循环)。使用如前述的光学测量系统来评价起球；0％起球度被指定为“起球的”材料。表3：AP-测量的结果(％) 酶浓度 起球度 EG V BCE 103 BCE 103的AP(％) 25μg/ml -12.8％ -8.4％ 65％ 37.5μg/ml -16.0％ -9.6％ 59％ 50μg/ml -22.8％ -15.6％ 68％
对于BCE 103纤维素酶可以计算出平均AP为64％。在相同条件下，BCE113纤维素酶显示出平均AP为100％。
使用表1和表2中的TSL值，不同纤维素酶的TSL与AP的比值如下表4所示：表4：TSL与AP的比值 酶 比值 EG V 1 BCE 103 ≈0.2 BCE 113 ≈0.02实施例4：进一步测试的方法-抗再沉积测试
在搅拌(90rpm)下使在洗涤剂(不含酶的Persil color，5g/l，pH8.5)中的20ml 0.5％的着色污物(当天新制备，由86％高岭土、8％碳黑(Flammruβ101，从Degussa AG得到)、4％铁黑与2％铁黄(从Henkel Genthin GmbH得到)组成)与白色棉织物(已预洗，直径为5cm，从Windelbleiche，Krefeld得到)一起温育。加入纤维素酶直至最终浓度为1mU/ml。在40℃90rpm下温育该混合物30分钟。在不添加纤维素酶的情况下进行同样的温育作为对照。温育后，用流动的冷水充分漂洗织物。干燥后，采用一台Micro colourDr.Lange比色计经发射值(remission)(每块织物测量4次)测量织物的洁白度。从样品的数值中减去对照值，以ΔREM表示的结果示于表5中。-织物破坏测试
在40ml洗液(不含酶的Persil color，5g/l，pH8.5)中温育一块脱脂棉(100％棉，Warenhandels GmbH，Buchholz，Marke Olivia，销售代理商：Aldi)，在一个密封的烧瓶中加入最终浓度为1mU/ml的纤维素酶并在搅拌(90rpm)下于40℃温育该纤维素酶20小时。温育后，采用在实施例1中所述的PAHBAH方法通过测量溶液中还原糖的量来检验织物的破坏。在不添加纤维素酶的情况下进行同样的温育作为对照。结果示于表5中。-吸收测试
把在60℃下、将用不含酶的德国Persil预洗的白色棉织物(Windelbleiche，Bielefeld)裁成直径为9cm的圆形(大约重0.920克)。于30℃下在50ml含有0.1％SDS与1ml纤维素酶样品(600mU/ml)的pH为9的50mM甘氨酸-NaOH缓冲溶液中温育一块棉布布样60分钟。在T＝0分钟及T＝60分钟时取2ml样品并用pH6.5的50mM MES-缓冲溶液直接稀释(1∶2)，于4℃下储存该样品至测量。在不加棉纤维的条件下进行同样的温育作为对照。采用如在实施例3中所述的PAHBAH方法、但在pH为6.5的50mM MES缓冲溶液中测定活性大小。以相对吸收值表示吸收，其中在实验开始时使用的活性设为100％，T＝0。100％活性值-剩余活性(％)＝吸收值(％)。结果示于表5。表5：抗再沉积测试、织物破坏测试以及吸收测试的结果酶 抗再沉积 [ΔREM] 织物破坏 [mU] 吸收值 [100％]BCE 103 5.0 0.025 7 KACa) 7.5 0.006 0 EG V 1.2 0.155 36
a)：Kao公司的纤维素酶
在这些测试中，纤维素酶BCE 113至少具有和纤维素酶BCE 103一样良好的性能。-柔软度测试
由一个专家小组(5人)评定出按实施例3处理的、但经15次洗涤循环的织物柔软度的级别，其中该小组是通过触摸织物在0(用不含纤维素酶的洗涤剂洗涤25次的织物)和6(未经任何洗涤的织物)之间确定级别的。在洗涤中使用在实施例2中定义的组合物。表6中给出了平均级别。可以看出本发明的组合物显示出最佳的性能。表6：柔软度测试结果 组合物 级别 C1 0 C2 2.1 C3 1.5 D1 2.3 D2 2.2
附图说明
图1显示纤维素酶BCE 103的相对活性。在实施例1中该图称作pH/温度分布。在40℃和60℃下的所有活性均与设定为100％的最高活性关联。
图2显示纤维素酶BCE 113的相对活性。
图3显示从CBS 670.93得到的50kD纤维素酶的DNA序列(SEQ ID No.1)以及推导的氨基酸序列(SEQ ID No.2)，其中前导肽序列上有阴影，分泌时该前导肽序列被切割掉，产生成熟酶。
图4显示从CBS 669.93得到的63kD纤维素酶的DNA序列(SEQ ID No.4)以及推导的氨基酸序列(SEQ ID No.3)，其中前导肽序列上有下划线，分泌时该前导肽序列被切割掉，产生成熟酶。