用于确认靶和途径有效/无效的方法 发明背景发明领域
本发明涉及确认靶基因、例如中枢神经(CNS)基因有效的方法，该方法使用低腺苷含量(低A)或不含腺苷(脱A(desA))的反义寡核苷酸(oligos)。该方法可以通过抑制靶基因生产其产物来筛选靶基因及其功能。该方法特别适用于体内应用，因为个体的许多功能对腺苷有反应，腺苷的作用可能会掩盖特定靶基因地可检测的功能。背景技术
预计在未来1-3年内所有人类基因的序列(约100,000个)都将变为已知的。该信息为设计用于治疗以前或现在折磨人类的几乎所有疾病的新药物提供了机会。但是，这种序列的大量累积本身并不能用于开发新的药物，除非有技术能够辨别这些基因的功能，特别是减弱其功能的潜在作用，即治疗作用或毒理学作用。例如，必需设计新的方法来迅速准确地测试功能，从而测试新发现的基因产品作为“靶”用于药物开发程序的用途。为了保存药物开发资源，必须在药物开发的过程中尽可能早地确认“靶”有效或无效。即使这样，所述方法的实施仍需要将大量的药物开发程序应用于一系列序列已知但功能未知的基因。评估新发现的基因产品作为药物开发程序之焦点的价值的一种相当有潜力的方法是使用反义寡核苷酸来在体外或体内消除靶基因的功能。虽然该方法在理论上非常重要，但问题之一是反义寡核苷酸有可能会在体外或体内降解并释放出其组成中的核苷酸。有证据表明，寡核苷酸降解的产物之一--腺苷在某些组织中有很高的生物活性。腺苷可以介导多效作用，包括抑制神经传递、保持丘脑纺锤体节律、诱导睡眠、D1和D2多巴胺受体的拮抗作用、抗-伤害感受、介导乙醇的各种作用(包括运动共济失调)、心脏功能的自主控制、支气管收缩、负变时性、减弱肌收缩力和神经传导性减低、抗-β-肾上腺素能作用和肾钠潴留。很明显，在某些组织例如CNS、高反应性哮喘肺、心脏、肾等组织中，即使仅释放微量的腺苷也可以局部激活腺苷受体。这将导致无法以可信、明确的方式解释靶确认数据。因此，含有腺苷的反义寡核苷酸不能最佳地提供明确的靶确认数据，因为它们的降解会引起多效腺苷介导的作用。
在过去数年进行的基础神经科学研究已经确立了兴奋性氨基酸(EAA)中枢神经系统(CNS)递质例如谷氨酸和天门冬氨酸与各种病理学状态例如中风和CNS创伤之间的关系。例如，脑局部缺血、中风或创伤后的神经组织变性的主要机制似乎涉及大脑内EAA系统的过度激活，即，谷氨酸盐和天门冬氨酸盐的过度释放。该过程称为延迟的兴奋性毒性，某些神经细胞群选择性地对兴奋性毒性敏感。
现已发现，腺苷还具有抑制突触前EAA释放的活性，从而可以减弱其兴奋性毒性，因此，它的释放将会严重干扰该系统的靶确认研究。由于腺苷的作用通常是由细胞外受体介导的，因此，腺苷的药理学相关的集合体是在细胞外的。腺苷还具有神经-行为作用，并起CNS抑制剂的作用，也就是说可以抑制神经活性。它还是天然的抗惊厥剂和镇静剂。新的研究表明，在正常情况下，腺苷可以促进睡眠，因此可以干扰涉及睡眠相关性反应的途径，例如睡眠呼吸暂停。有越来越多的证据表明腺苷是一种重要的“疲劳因子”，并且可以干扰对支撑睡眠周期的分子的确认研究。例如，在大脑中，研究表明关键受体位于大脑唤醒网络内的神经细胞上。一些科学家确信，腺苷可以通过靶向于大脑内的唤醒网络例如胆碱能系统如刺激睡眠的胆碱能基底前脑和mesopontine胆碱能核来促进睡眠。所有这些腺苷的作用均会干扰在它起作用的系统和途径中的靶确认研究。
因此，非常需要能够迅速、有效地筛选大量基因及其表达产物的方法，以确定其功能，从而确定其在设计用于治疗与靶基因和/或其表达产物有关的疾病和病症的治疗剂中的用途。此外，还需要适于测试单个基因的功能并同时避免激发可能会使对结果的解释变得困难的其它基因功能的方法。发明概述
本发明涉及确认疾病或病症的功能与编码推测可能与疾病或病症有关的靶多肽的基因或mRNA之间的相关性有效/无效或测定该相关性是否存在的方法。该方法通常包括，获取含有最多约15％腺苷(A)的寡核苷酸(oligos)，该寡核苷酸对于选自靶基因及其相应的mRNA、选自3′和5′内含子-外显子边界以及编码区和非编码区之间的并列部分的基因组和mRNA侧翼区、以及编码与预先选定的疾病或病症有关的多肽的所有mRNA片段的靶是反义的；从寡核苷酸中选择出在体外与靶mRNA杂交时可以明显抑制或消除由mRNA编码的多肽表达的寡核苷酸；向个体施用足以在体内与靶mRNA杂交的量的选定寡核苷酸；然后评估在施用寡核苷酸前后与疾病或病症有关的个体的功能；其中，功能值的改变大于约70％表示正相关，约40至约70％之间表示可能相关，低于约30％表示不相关。本发明方法的适宜应用是用于阐明可能与影响肺、脑、心脏、肾、肿瘤、血液、免疫系统、皮肤、眼、鼻通道、头皮、睾丸、子宫颈、口腔、咽、食管、肠(小肠和大肠)、滑膜组织、肌肉、卵巢和耳道等的疾病或病症有关的基因或基因网，通常是含有或来源于靶位点的各种细胞。
以下将参照具体的附图对本发明进行描述。本领域技术人员很容易从说明书中看出本发明的其它目的、优点和特点。附图概述
图1显示了分别向兔子施用盐水(对照)、腺苷(o)和dAMP(P)的实验。盐水没有影响，腺苷和dAMP均以剂量依赖性的方式引起了类似的伸缩率降低。该结果表明，核苷例如dAMP可以直接或在降解和/或代谢成腺苷后在腺苷受体产生腺苷的生理学作用。
本发明的图2证实了是含有腺苷(A)而不是那些不含腺苷(脱A)的寡核苷酸(oligos)可以释放有生物活性的腺苷。释放的腺苷激活腺苷受体并引起生物学响应，该生物学响应会干扰准备在靶确认研究中进行观察的信号。向患有哮喘的兔子施用两种21-聚体的随机硫代磷酸反义寡核苷酸(oligos)，一种含有腺苷(三角形)，一种是脱A寡核苷酸(圆圈)。含有腺苷的寡核苷酸引起气道伸缩率的明显降低，反应了A受体活性，而脱A随机寡核苷酸没有影响。
图3和4证实了反义寡核苷酸可以有效地确认与肺或气道疾病有关的靶有效。图3说明了对腺苷A1受体反义的寡核苷酸以及错配对照反义寡核苷酸在兔模型中对支气管动态伸缩率的影响。图3说明了对腺苷A1受体反义的寡核苷酸的特异性，由A1腺苷受体反义寡核苷酸治疗的气道组织中存在的A1和A2腺苷受体的数量表示。
参照如下优选实施方案的描述，将可以更好地理解本发明。优选实施方案的描述
本发明人为了提供用于迅速有效地发现靶基因及其产物的功能及用途的新技术而提出了本发明。本发明人推测，可以通过应用他自己以前的发现、即可以向个体体内施用低腺苷反义寡核苷酸(oligos)而不会引起由腺苷受体所介导的不利副作用来成功地完成本发明。本发明的方法可以借助在体外和/或体内消除了其功能的反义寡核苷酸来评估新发现的基因和基因产物作为药物开发程序的焦点的价值。虽然使用反义寡核苷酸来消除基因表达在过去有非常重要的理论价值，但本发明人关于反义寡核苷酸会在体外和体内降解并释放出其组成的核苷酸和核苷的发现阻碍了它们的成功应用并解释了它们的无效性。本发明人有证据表明，低聚核苷的降解产物之一，一磷酸腺苷，与腺苷一样在多种组织中有很高的生物活性。已知腺苷可以介导多效作用，包括抑制神经传递、诱导睡眠、D1和D2多巴胺受体的拮抗作用、抗-伤害感受、介导乙醇的各种作用(包括运动共济失调)、心脏功能的自主控制、支气管收缩、负变时性、减弱肌收缩力和神经传导性减低、抗-β-肾上腺素能作用和肾钠潴留。很明显，在某些组织例如CNS、肺、心脏、肾等组织中，即使仅释放微量的腺苷也可以在局部环境中激活腺苷受体。这将导致无法以可信、明确的方式解释靶确认数据。本发明的实施例30和31以及图1和图2说明了含有腺苷的寡核苷酸可以降解释放生物活性的腺苷。该图说明了是含有腺苷(A)而不是那些不含腺苷(脱A)的寡核苷酸(oligos)可以释放有生物活性的腺苷。在所公开的例子中，向患有哮喘的兔子施用两种21-聚体的随机硫代磷酸反义寡核苷酸(oligos)，一种含有腺苷(＞)，一种是脱A寡核苷酸(O)。结果表明，含有腺苷的寡核苷酸引起气道伸缩率的明显降低，反应了腺苷受体活性，而脱A随机寡核苷酸则没有影响。参见下文的实施例13。此外，还证实腺苷核苷(dAMP)具有与腺苷相似的对腺苷受体的作用。参见下文的实施例30。
本文所描述的研究工作以及实施例中所讨论的结果清楚地表明，通过将本发明的方法应用于新靶点(当其被发现时)和/或已知靶点(当将其与其功能相关联时)，成功地实现了确认靶的有效。实验性研究还证实，当采用特异性靶向的非磷酸二酯反义寡核苷酸时，通过抗衡或减弱由靶蛋白介导的作用，本发明的方法在确认靶有效/无效时是高度选择性和有效的。对于所有靶向腺苷A1受体mRNA的反义寡核苷酸、靶向腺苷A2b受体mRNA的1反义寡核苷酸、靶向A3受体mRNA的2反义寡核苷酸、靶向缓激肽受体的1反义寡核苷酸，证实可以通过外源性给药腺苷来消除由特异性腺苷受体介导的抗衡作用。此外，本发明的方法在确认特定选择的靶有效/无效时是特异性的，不能抑制其它靶点，如靶向于腺苷A1和缓激肽基因以及mRNA的反义寡核苷酸所示。此外，结果表明，采用低腺苷含量或不含腺苷的寡核苷酸的本发明的方法只产生非常低的、或者完全没有不利副作用或毒性。这表示在提供高度有效和特异性的确认靶有效的方法时是100％成功的，例如在呼吸系统中所证实的。本发明可以相同的方式广泛应用于编码涉及或与气道疾病有关的呼吸/肺系统蛋白的所有基因和相应的mRNA以及与特定的疾病或病症(所述疾病或病症可能与特定的功能或终点例如CNS有关)有关的其它系统的靶点。还用磷酸二酯寡核苷酸以及其中的磷酸二酯键被硫代磷酸酯键代替了的同种寡核苷酸对本发明的方法进行了比较。应用本发明方法的结果表明，比磷酸二酯寡核苷酸有出人意料的优越性。因此，高腺苷含量(33％)的反义寡核苷酸不适于获得明确的靶确认数据，因为它们的降解会引起多效的腺苷-介导的作用。本发明的方法所使用的低腺苷低聚物显然没有这些副作用。本发明描述了一种可用于进行明确的“确认靶有效”的方法，该方法可用于例如呼吸道或肺系统、CNS以及腺苷的释放会引起多效作用的其它器官或系统。该方法涉及使用低A或脱A反义寡核苷酸，即具有低A含量或不含腺苷的寡核苷酸，从而不会在降解时释放大量具有明显生物活性的腺苷。本发明的方法可用于基本上所有的基因，但特别适用于如下基因子集：G蛋白偶联受体、神经激素受体、神经肽受体、神经递质受体、G蛋白、钙通道蛋白、钠通道蛋白、钾通道受体、氯通道受体，也就是说在正常或有疾病的CNS、心脏、肺、肾、血液、免疫系统中表达的基本上所有的基因以及如下所列的基因。因此，本发明所描述的确认方法不仅可用于本文所述的基因和系统，而且还可用于其它基因属和亚属以及基因网络。
成功的药物开发程序取决于迅速、准确地评估候选基因产物作为药物设计靶点的适宜程度。以前，该过程需要耗费相当长的时间以及人力和财力资源。本发明提供了迅速、可信的在各种生物学系统中确认靶有效/无效的方法，该方法使用专有的低或脱腺苷反义寡核苷酸(本文统称为脱A-ASON)。使用脱A-ASON，本发明的方法可以以用传统的技术无法达到速度和准确度确认潜在的基因靶点有效/无效。脱A-ASON提供了比传统的方法更高的准确度和速度水平。脱A-ASON不能降解和释放会通过引起腺苷诱导的副作用而干扰靶确认的具有生物活性的腺苷。在ASON中，有一个亚组是用于呼吸给药的，在此称为RASON。本发明人用脱A-RASON进行了本发明的方法以确认腺苷A1、A2和A3靶有效。本发明的方法还可在位点特异性的功能基因消除后，用于大脑任何区域内的涉及生物化学、行为学、生理学评估的CNS靶点，该方法使用脱A-BASON、即不能降解释放腺苷的反义寡核苷酸(在脑内原位给药)，它是大脑生理学的主要调节剂。除了确认肺靶点的实验性有效外，用CNS相关靶点说明了本发明的方法，通常包括用脱A反义寡核苷酸进行多步骤的靶确认。
开始的步骤需要识别用于靶确认的全身系统或区域，例如CNS、呼吸系统、肾、心脏区域等。然后，利用公共的文库例如GenBank或其它公有的文库或私人文库例如特定公司所专有的文库。例如，包含有记载于公共和私人数据库中的所有G蛋白偶联受体(GPCR)的特定文库。目前存在有大约250个GPCR。因此，本发明的靶确认方法适用于测试在将选定的一组靶例如GPCR用适宜的脱A反义寡核苷酸弱化时，会发生什么样的生理学、生物物理学、生物学、行为学等事件。为此，按照如下描述设计并合成脱A反义寡核苷酸用于预先选择的靶基因，例如上述的GPCR。然后将脱A反义寡核苷酸进行测试，首先是体外测试，例如使用适宜的细胞系、初级细胞培养物或其它细胞组织。所述体外测试可用于确定所设计的多种针对特异性靶的脱A反义寡核苷酸中哪些是“活性最强的”反义物质。也就是说，哪一种可以最佳地向下调节或消除基因表达。这可以用生物物理学、生物学、生理学试验或其它可与细胞的特定活性相关联的试验来进行。在其它情况下，在体外系统中剔除靶基因本身就可以提供有用的靶确认信息。然后选出活性最强的脱A反义寡核苷酸并进行体内应用，例如直接滴注到大脑的各个区域进行CNS研究、给药到与呼吸系统有关的肺靶点等。这可以通过本领域已知的方法来完成，例如，对于大脑的靶点，通过立体定位地植入插管；对于呼吸靶点，通过吸入给药；对于血液靶点，通过全身性给药；对于器官和其它局部系统以及实质细胞和血管心脏细胞，通过原位给药；对于肾靶点，通过吸入或直接滴注进行全身性给药。可以采用行为学、生物物理学、生理学、生物化学、免疫学和其它试验，并通过施用适宜的反义寡核苷酸以消除一种或多种靶基因而在各动物中获得数据。行为学功能或终点例如食物摄取、焦虑、性冲动、认知等，或者生理学终点例如温度、脑电图(ECG)、心电图(EKG)、肾小球过滤体积和含量、离子潴留、蛋白损失等，可以通过本领域已知的方法来评估。这些步骤用CNS在如下所示的流程图中进行了举例说明。
本发明的方法依赖于将低A或脱A-ASON应用于呼吸(脱A-RASON)、CNS(脱A-BASON)、肾(脱A-KASON)、心脏(脱A-CASON)、血液(脱A-SASON)、免疫系统(脱A-IASON)、恶性组织(脱A-MASON)和其它功能而不释放具有显著生物活性量的腺苷。通过该方式，本发明的方法防止了肺、CNS、肾、心脏、血液、免疫系统、恶性细胞聚集体中不利的腺苷受体激活。用目前已知的方法获得的结果不太能说明问题，因为常规的反义构建体含有约25％的正常(高)水平的腺苷并且能激活腺苷受体。该作用使得结果变得模糊并且使得对功能性的解释变得混乱。例如，在肺中，寡核苷酸释放的腺苷将会引起气道直径的改变(支气管缩小)、炎症和表面活性剂的分泌，在该情况下的所有作用均与不同靶的确认无关。这些“副作用”使得用寡核苷酸或核酶在该情况下获得的数据无法进行解释。同样，当将含有腺苷的反义寡核苷酸用于脑时，它的作用使得许多可以用作终点来确认靶有效的功能变得难以解释。例如，腺苷会引起神经传递的抑制、诱导睡眠、抗-伤害感受、介导乙醇的各种作用(包括运动共济失调)、心脏功能的自主控制、D1和D2多巴胺受体的拮抗作用、CNS血流的改变、以及许多其它的作用。当使用反义寡核苷酸在高反应性肺、CNS和其它含有腺苷受体或对腺苷有反应的系统中进行靶确认研究时，显然不应存在显著量的腺苷。由于这些原因，本发明的方法提供了一种优越的靶确认工具。本发明方法的特别有用的应用是研究与呼吸道、CNS、血液、恶性和失控生长的细胞以及许多其它系统有关的治疗领域，这些系统可以分别作为靶点，并且分别测量与该靶有关的一种或多种功能。
由于本发明的方法是在生物科学的独特的历史时期发明的，它将允许更迅速并且更有效地利用从测序人类基因组所获得的信息。了解人类基因组中各种基因的序列是现代医学梦寐以求的东西。它的完成将可以把特定的基因与它们的功能联系起来，然后制造出完全新型的药物，这些药物可以更好地接近患病的心脏并且没有现有药物的副作用。目前存储的大量序列提供了重要的靶点。本发明的方法提供了一种价值无法衡量的工具，该工具可用来识别对于体内功能非常重要、也就是说对于疾病非常重要的基因，并且可用来确定抑制所述基因的功能是否有治疗上的用途。确定抑制基因的功能是否有治疗用途的方法称为“确认靶有效”。它是药物开发过程中非常重要的早期步骤，有助于确定是否要消耗关键性的资源来开发用于抑制靶基因功能的新药物。就此而言，确认靶有效和确认靶无效是同样重要的，确认靶无效是证实抑制其功能是没有功能性(治疗性)作用的。在药物开发过程中尽早地确认靶无效可以防止将资源浪费在没有结果的药物开发工作上。这将导致更迅速、更集中地研究更有生产价值的靶点。本发明的迅速而且精确的确认靶有效的方法可以在大量信息、例如从人类基因组计划获得的信息的治疗应用中产生成功与失败的差异。在本发明方法中的反义寡核苷酸的体内试验可以在体外以及重要疾病的动物模型、包括呼吸疾病例如哮喘、激素疾病、遗传病、肥胖等，包括CNS、肾、心脏的疾病、血液疾病等的模型中实施。可以采用本领域已知的试验来实现本发明，例如，在清醒、自由的啮齿动物、兔子或灵长目动物，例如TruePrimateJ或其它物种中的完整身体的体积描记技术。因此，本发明的方法有助于确定在疾病或病症的功能和编码推测与其相关的靶多肽的基因或mRNA之间是否存在相关性。该方法本身通常包括如下步骤：获取含有最多约15％腺苷(A)的寡核苷酸(oligos)，该寡核苷酸对于选自靶基因及其相应的mRNA、选自3′和5′内含子-外显子边界以及编码区和非编码区之间的并列部分的基因组和mRNA侧翼区、以及编码与预先选定的疾病或病症有关的多肽的所有mRNA片段的靶是反义的；从寡核苷酸中选择出在体外与靶mRNA杂交时可以明显抑制或消除由mRNA编码的多肽表达的寡核苷酸；向个体施用足以在体内与靶mRNA杂交量的选定的寡核苷酸；然后评估在施用寡核苷酸前后与疾病或病症有关的个体的功能；其中，功能值的改变大于约70％表示正相关，在约40至约70％之间表示可能相关，低于约30％表示不相关。
反义寡核苷酸可以通过选择含有至少4个邻近的选自G和C的核酸的靶的片段来构建，并获得约4、6、8、10至约15、25、45、60个核苷酸长的含有选定的片段并且C和G的含量为约0％、约3％、约5％、约10％、约12％至约15％的第一寡核苷酸。或者，可以根据其类型和/或活性的范围来选择靶片段，所述活性可用于不同的目的。如果存在的话，可以有任意数量的腺苷(从一至全部)被“通用的”或替代的碱基例如可与胸腺嘧啶核苷碱基结合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受体具有小于约0.3的腺苷碱基激动剂活性的杂芳族碱基或在腺苷A2a受体没有活性的杂芳族碱基所取代。杂芳族碱基可以是嘧啶和嘌呤，其可以被取代，例如被O、卤素、NH2、SH、SO、SO2、SO3、COOH以及支链和稠合的伯和仲氨基、烷基、链烯基、链炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、链烯氧基、酰基、环酰基、芳基酰基、链炔氧基、环烷氧基、芳酰基、芳硫基、芳基磺酰氧基(sulfoxyl)、卤代环烷基、烷基环烷基、链烯基环烷基、链炔基环烷基、卤代芳基、烷基芳基、链烯基芳基、链炔基芳基、芳基烷基、芳基链烯基、芳基链炔基、芳基环烷基取代，其又可以被O、卤素、NH2、伯、仲和叔胺、SH、SO、SO2、SO3、环烷基、杂环烷基和杂芳基取代。但是，其它化合物和其它取代基也适用于本发明的方法。通常，嘧啶和嘌呤在1、2、3、4、7和8位取代，但也包括其它取代。嘧啶和嘌呤的例子是茶碱、咖啡因、二羟丙茶碱、乙羟茶碱、哌醋茶碱、巴米茶碱、恩丙茶碱和具有如下化学结构式的黄嘌呤
其中R1和R2彼此独立地是H、烷基、链烯基或链炔基，R3是H、芳基、二环烷基、二环烯基、二环炔基、环烷基、环烯基、环炔基、O-环烷基、O-环烯基、O-环炔基、NH2-烷基氨基-酮氧基烷氧基-芳基和单和二烷基氨基烷基-N-烷基氨基-SO2芳基。通用的和替代的碱基的具体例子是3-硝基吡咯-2′-脱氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脱氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脱氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脱氧肌苷、2′-脱氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮或2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤，但也可以使用其它碱基。首选在腺苷受体没有活性、也就是说在腺苷受体既没有激动剂特性也没有拮抗剂特性的腺苷类似物。在另一个优选的实施方案中，如果寡核苷酸中存在CpG二核苷酸的话，该方法还可以用甲基化的胞嘧啶(mC)来代替CpG二核苷酸中的至少一个未甲基化的C，但也可以取代多个或全部取代。也可以采用在嘧啶上的其它C-5修饰，例如C-5丙炔。为了实现该方法，优选将反义寡核苷酸的一个或多个或全部连接残基用选自如下的残基取代或修饰：甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼杂磷酸酯(boranophosphate)、formacetal、thioformacetal、硫醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、砜、亚硫酸酯、亚砜、硫化物、羟基胺、2′-亚甲基(甲基亚氨基)、(MMI)、2′-甲氧基甲基(MOM)、2′-甲氧基乙基(MOE)、2′-亚甲基氧基(甲基亚氨基)(MOMA)、2′-甲氧基甲基(MOM)、2′-O-甲基、氨基磷酸酯和C-5取代的(例如C-5丙炔)残基及其组合。适用于该方法的反义寡核苷酸为约7、约9、约11、约13、约15、约18、约21至约25、约28、约30、约35、约40、约45、约50、约55、约60个单核苷酸长，但其它长度也是适宜的。
本发明的方法还可合并使用与一种可被细胞内化或摄取的物质以及本领域已知的靶向于细胞的物质例如转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白和链霉抗生物素蛋白连接的反义寡核苷酸。在一个实施方案中，寡核苷酸与载体相连，所述载体可以是原核的或真核的。载体的例子是本领域已知的，无需在本发明中进一步描述。反义寡核苷酸的给药量通常是可以有效减少mRNA的产量或利用度或增加其降解的量或可以减少所存在的多肽的量的量。例如，当待被确认的基因与呼吸功能有关时，可以将反义寡核苷酸直接向肺给药。当基因和功能与其它系统有关时，优选将核酸向受影响的区域例如脑、心脏、肾、膀胱、性腺和生殖系统、呼吸和肺系统、在癌症情况下的肿瘤、血液、免疫系统、肺、皮肤、眼、鼻通道、头皮、睾丸、子宫颈、口腔、咽、食管、小肠和大肠、滑膜组织、肌肉、卵巢、耳道等以及来源于选定的靶位点的各种细胞原位给药。在许多情况下，疾病或病症会影响某些系统或系统的区域，例如上述的那些。例如，呼吸疾病可能伴有支气管收缩的增加、炎症、IgE-介导的过敏、表面活性剂的生产和其它症状，例如在哮喘、过敏性鼻炎、COPD、肺肿瘤、ARDS等。当疾病或病症与免疫学机能不良有关时，靶点可以选自免疫球蛋白和抗体受体、细胞因子和细胞因子受体、基因和其它基因产物以及编码它们和相关功能的相应的mRNA、基因和mRNA侧翼区和内含子和外显子边界等。当疾病或病症与恶性肿瘤或癌有关时，靶点可以选自与癌症相关的基因产物、编码它们的基因和mRNA、与癌基因有关的基因和mRNA、基因组和mRNA侧翼区以及外显子和内含子边界等。
用于本发明的反义寡核苷酸可以通过如下方法来生产：从与影响肺气道的疾病和/或病症有关的多肽、编码它们的基因和RNA、基因组和mRNA侧翼区以及基因和mRNA外显子和内含子边界中选择靶点，然后获取选自对应于编码靶多肽的靶基因和mRNA的mRNA、基因组和mRNA侧翼区以及基因和mRNA外显子和内含子边界的mRNA序列；选择至少一种mRNA片段，合成一种或多种对选定的mRNA片段反义的寡核苷酸；以及，如需要，用通用或替代的碱基代替一个或多个A(s)以使寡核苷酸中A的含量降低至最高约为所有核苷酸的10％。编码的与肺系统有关的多肽的具体例子NfκB转录因子、白介素-8受体(IL-8R)、白介素5受体(IL-5R)、白介素4受体(IL-4R)、白介素3受体(IL-3R)、白介素-1β(IL-1β)、白介素1β受体(IL-1βR)、嗜酸细胞活化趋化因子、类胰蛋白酶、主要碱性蛋白、(2-肾上腺素受体激酶、内皮缩血管肽受体A、内皮缩血管肽受体B、前内皮缩血管肽原、缓激肽B2受体、IgE高亲和性受体、白介素1(IL-1)、白介素1受体(IL-1R)、白介素9(IL-9)、白介素-9受体(IL-9R)、白介素11(IL-11)、白介素-11受体(IL-llR)、诱导型一氧化氮合酶、环加氧酶(COX)、细胞内粘着分子1(ICAM-1)血管细胞粘着分子(VCAM)、Rantes、内皮白细胞粘着分子(ELAM-1)、单核细胞活化因子、嗜中性白细胞趋化因子、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、防卫素1、2和3、毒蕈硷乙酰胆碱受体、血小板活化因子、肿瘤坏死因子α、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶IV、P物质、P物质受体、组胺受体、胃促胰酶、CCR-1 CC趋化因子受体、CCR-2 CC趋化因子受体、CCR-3 CC趋化因子受体、CCR-4 CC趋化因子受体、CCR-5 CC趋化因子受体、前列腺素类受体、GATA-3转录因子、嗜中性白细胞粘着受体、MAP激酶、白介素-9(IL-9)、NFAT转录因子、STAT 4、MIP-1α、MCP-2、MCP-3、MCP-4、亲环蛋白、磷脂酶A2、碱性成纤维细胞生长因子、金属蛋白酶、CSBP/p38 MAP激酶、胰蛋白受体、PDG2、白介素-3(IL-3)、白介素-1β(IL-1β)、环孢菌素A-结合蛋白、FK5-结合蛋白、α4β1选择蛋白、纤连蛋白、α4β7选择蛋白、Mad CAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、PECAM-1、LFA-1选择蛋白、C3bi、PSGL-1、E-选择蛋白、P-选择蛋白、CD-34、L-选择蛋白、p150，95、Mac-1(CD11b/CD18)、岩藻糖基转移酶、VLA-4、CD-18/CD11a、CD11b/CD18、ICAM2和ICAM3、C5a、CCR3(嗜酸细胞活化趋化因子受体)、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、LTB-4、AP-1转录因子、蛋白激酶C、半胱氨酰白三烯受体、Tachychinnen受体(tach R)、IκB激酶1 & 2、STAT 6、c-mas和NF-白介素-6(NF-IL-6)。与CNS、眼、心血管和心肺系统有关的多肽或基因的例子是G蛋白偶联受体(约250种是已知的，约750-1,000种是假定的，仍需要进行测序)、神经肽基因、神经肽受体基因、兴奋性氨基酸受体基因、氯通道基因、钙通道基因、嘌呤受体基因、肾上腺素受体基因、血清素受体基因、血清素转运基因、兴奋性氨基酸转运基因、钾通道基因、酪氨酸激酶、磷酸化酶、乙酰胆碱受体、缩胆囊肽受体、一氧化氮合酶、多巴胺受体、胆碱能受体、血管紧张素、血管紧张素受体、包括钾通道在内的离子通道、结构蛋白，包括与髓鞘形成/脱髓鞘以及轴和树状结构、神经递质释放介质和结构、眼疾病，特别是视网膜和相关结构的疾病有关的结构蛋白、降钙素及其受体、神经钙蛋白及其受体、CGRP及其受体、心房肽及其受体、脑钠尿肽及其受体、缓激肽及其受体、Baro受体、GABA/GABA受体、苯并二吖庚因受体、胆碱酯酶、大麻酯受体、钙调蛋白及其受体、钙/钠交换泵、碳酸酐酶、儿茶酚胺及其受体、组胺受体、毒蕈硷受体、阿片受体、趋化因子、胆碱乙酰基转移酶、胆钙化醇、炎症介质、包括细胞因子、白介素、干扰素及其受体、脂氧合酶途径的酶、蛋白酶、DP(PGD2)受体、磷酸肌醇相关的酶、内皮缩血管肽及其受体、脑啡肽酶、脑啡肽、苯并二吖庚因受体、GABA转氨酶、促生长激素神经肽及其受体、胃泌素释放因子、生长因子、生长因子抑制剂、细胞周期蛋白、核苷激酶、核苷酸激酶、癌基因受体、5-羟色胺(5HT)受体、ADH、IGF、胰岛素受体、内酰胺酶、红藻氨酸盐受体、激肽释放酶及其受体、白三烯-相关的酶、脂调素、L-NMMA及受体、促黑素细胞激素、甾体转运蛋白和代谢酶及合酶、NMDA和受体、吗啡受体、MPTP、神经激肽及其受体、烟硷受体、磷脂酶、血小板活化因子、信号传导蛋白、PDGF、强啡肽、前列环素、催乳素及其受体、催乳素释放抑制因子、前激素、前列腺素类s、前列腺素及其受体、凝血酶、凝血酶原、蝶酰谷氨酸及其受体、麦角酸受体、蛇和蝎毒受体、肾素血管紧张素系统成分、逆转录酶、第二信使和相关的酶、钠通道、促生长素抑制素及其受体、生长激素及其受体、p物质、k物质、突触递质、速激肽、河豚毒素受体、血栓烷及其受体、甲状腺激素、激素、促甲状腺素和受体、普罗瑞林、T4、T3拓扑异构酶、肿瘤坏死因子及其受体、TGF及其受体、黄嘌呤氧化酶、病毒信使RNAs、细菌mRNA、环状肽催产素及其受体、缩胆囊素(Chlecystokinin)及其受体、血管紧张肽及其受体、单胺氧化酶、酪氨酸-激酶连接受体等。其它特定的靶基因是，例如，G蛋白和G蛋白偶联受体、钙通道蛋白和相关的蛋白受体、钠通道蛋白和相关的蛋白受体、钾通道蛋白和相关的蛋白受体以及氯通道蛋白和相关的蛋白受体、神经递质和神经递质受体、神经激素和神经激素受体、神经肽和神经肽受体等，包括本专利所列举的那些。其它靶基因是，例如，G蛋白和G蛋白偶联受体、钙通道蛋白和相关的蛋白受体、钠通道蛋白和相关的蛋白受体、钾通道蛋白和相关的蛋白受体以及氯通道蛋白和相关的蛋白受体、神经递质和神经递质受体、神经激素和神经激素受体、神经肽和神经肽受体等。
在本方法中，可将组合物体外施用、口服、腔内施用、鼻内施用、肛门内施用、阴道内施用、子宫内施用、颅内施用、肺部施用、肾内施用、节内(intranodularly)施用、关节内施用、intraotically施用、淋巴内施用、经皮施用、颊内施用、静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用、肿瘤内施用、腺内施用、眼内施用、颅内施用、器官内施用、血管内施用、鞘内施用、通过植入、吸入施用、真皮内施用、肺内施用、耳内施用、皮肤或头皮上或子宫颈上(例如局部施用)、心脏内施用、通过缓释、持续释放或通过泵施用等。与不同系统和疾病有关的靶基因和mRNA是编码多肽例如转录因子、刺激和活化因子、细胞因子及其受体、白介素、白介素受体、趋化因子、趋化因子受体、内源性产生的特异性和非特异性酶、免疫球蛋白、抗体受体、中枢神经系统(CNS)和外周神经和非神经系统受体、CNS和外周神经和非神经系统肽递质、粘着分子、防卫素、生长因子、血管活性肽、肽受体和结合蛋白的基因和mRNA以及对应于癌基因的基因和mRNA。寡核苷酸的给药可以通过含有液体载体的口服制剂来进行，例如溶液剂、混悬剂、水包油和油包水乳剂，和/或以散剂、糖衣丸、片剂、胶囊、喷雾剂、气雾剂、溶液、混悬液和乳剂的形式给药。当以局部制剂的形式给药时，载体可以选自霜剂、凝胶、软膏、喷雾剂、气雾剂、贴剂、溶液、混悬液和乳液。当制剂是可注射的制剂时，载体可以选自含水和醇溶液及混悬液、油溶液和混悬液、水包油和油包水乳液等。当制剂是直肠用制剂时，其可以是栓剂的形式，当制剂是经皮制剂时，载体可以选自含水和醇溶液、油溶液和混悬液、水包油和油包水乳液等，但也可以使用其它载体。经皮制剂可以是离子电渗疗法的经皮制剂，其中的载体选自含水和醇溶液、油溶液和混悬液、水包油和油包水乳液，该制剂还可含有透皮促进剂，有许多透皮促进剂均是本领域已知的。同样适用于延迟给药的制剂是含有制剂的可植入胶囊或药筒。在该情况下，载体也可以选自含水和醇溶液及混悬液、油溶液和混悬液、水包油和油包水乳液、疏水性载体，例如脂质的囊或颗粒，例如由N-(1-[2，3-二油酰氧基]丙基)-N，N，N-三甲基-铵甲基硫酸盐和/或其它脂质制备的脂质体以及微晶。对于肺部应用，制剂优选是可吸入的制剂，例如气雾剂的形式。为了延长靶区域的接触时间，可将寡核苷酸通过局部植入、栓剂、舌下制剂等输送，所有这些制剂均是本领域已知的。
证实该方法优于其它方法的一个因素是，可以获得更为可信和精确的数据。反义核酶技术在体内环境中不稳定，在核酶和其它寡核苷酸中存在腺苷妨碍了获得可信的数据，例如，在高反应性呼吸道和其它含有大量腺苷受体的系统中。到目前为止，还没有其它的方法证实能够明确地在含有腺苷的系统例如呼吸道中弱化靶点并同时提供可信和准确的相关性。此外，本发明的方法可用于阐明基因网络例如神经元基因网络，这是对于在更宽的范围内分离鉴定单个基因的量的飞跃。这可以通过如下方法来完成：选择一种以上与代谢途径有关的靶点，然后对其分别进行测试以及与其它靶点一起进行测试，也就是说，一次施用一种反义寡核苷酸，然后是两种、三种等，然后对结果进行比较以确定是否有连接、它们是否依次工作等。本发明的方法可以产生基因网络数据库，该数据库适于补充一种更精细的药物开发方法，以满足在认知、记忆、疼痛、焦虑、行为障碍、摄食行为、饥饿和饱满感以及神经病学疾病等与CNS有关的领域中的严格的医学需求。本发明的方法包括四个基础领域：用于辨别与新药物开发有关的基因网络的功能性基因组，原位杂交以了解这些网络在脑内的分布，私有的位点特异性功能性基因消除(SSFGA)以确定网络内各基因的功能，用于定性和定量分析基因和基因网络在各种与医学有关的行为中的参与情况的多因素行为学分析，用于辨别基因和基因网络在锥体束外系统例如心血管和肺系统中的作用的生理学、生物物理学、生物化学等分析。
该方法对于CNS的应用可以包括疼痛、饱满感、焦虑/情绪障碍、性冲动、认知/认知障碍、睡眠/睡眠障碍等领域。辨别所识别的新基因和基因网络的功能性意义的能力取决于对它们的空间表象的评估。例如，可用原位杂交来确定选定的基因和基因网络在脑内的精确三维(3-D)位置，以及用来使基因消除研究精确地靶向于评估其作为药物开发程序的候选药物的意义。位点特异性功能基因消除(SSFGA)提供了一种选择性地在所需的系统区域例如脑内弱化靶基因表达的方法。用于确认CNS靶有效的SSFGA可以用按照如下描述设计的低A或脱A反义寡核苷酸来进行。使用反义寡核苷酸的其它方法提供了不明确的数据，因为所用的寡核苷酸会降解并释放出腺苷，而腺苷是生物活性最强的一种内分泌物，例如在CNS和含有腺苷受体的其它靶系统内。在寡核苷酸降解时释放的腺苷可以抑制或促进神经传递(这取决于它释放时所处的系统和特定的区域，例如脑区域)、诱导睡眠、影响伤害感受、改变丘脑纺锤体的节律、减轻或加强多种药物的作用、影响心血管功能和呼吸的自主控制、抑制Ca+流和GABA的突触前功能、抑制自发的和受激的神经原放电、抑制神经递质的释放、减少突触后的兴奋性、抑制假定为学习和记忆的基础事件的长期强化、以及通过引起头侧的支气管扩张来引起多效性。显然，通过寡核苷酸在脑或实验动物内降解释放出明显量的腺苷在靶确认研究中是禁忌的。适于用作CNS靶确认终点的神经学和行为学试验是本领域已知的。例如，记忆试验、三维或空间能力、认知、运动控制、对外部刺激的敏感性和反应性、视觉、眼协调、皮肤感觉能力、味觉和嗅觉识别等。生理学参数的测试也是本领域已知的，并且可以依赖于对导电性例如EKG和EEG，或其它功能如心率和心脏节律、水排泄、睡眠图型等的测量。在许多情况下，副作用，特别是心肺、肾的副作用和其它副作用构成了使潜在的药物开发CNS靶点不合格的主要原因。反过来，CNS副作用又经常使适宜的治疗性心肺、肾和其它药物不合格。因此，最好在开发药物时尽可能早地获得弱化CNS靶点所造成的心肺影响的证据。当这种影响在开发程序中发现得较迟时，它们会使程序在晚得多的阶段被取消。本发明的方法采用现有技术中的分析手段、关键的手术、电生理学和其它类型的试验来评估各种有害的影响，例如弱化呼吸靶点对心血管的影响以及弱化呼吸靶点对CNS或心血管系统的任何有害的副作用。例如，在清醒、自由的动物中进行的肺功能研究以及心功能的研究可以对弱化候选CNS靶点的潜在影响进一步地深入了解。
靶确认可以通过上述SSFGA用靶向于各种在人类病理学(例如神经肽Y(NPY)/勒帕茄碱受体)和摄食行为中具有推测的功能的已知受体和从CNS基因文库中发现的新靶点的低A或脱A反义寡核苷酸进行。可对动物模型进行特定受体的SSFGA靶向作用，然后评估各种行为的改变，例如摄食行为、痛觉缺失、运动行为、感觉运动反射、选通过程、性和生殖行为、焦虑、学习和记忆等。这组基础广泛的行为试验为弱化特定CNS靶点的影响提供了一种敏感的衡量方法，并且在药物开发的决定过程的开始阶段提供了一种决定性的知识。与生理学/生物物理学/生物化学分析结合，该方法提供了迅速、增强的测定候选靶点作为进一步的药物开发尝试的有价值的焦点的可能性的判定。本发明的方法在基因和蛋白靶点的确认上对现有的方法进行了改进，表现在使用靶向于与不同系统有关的基因的脱腺苷反义寡核苷酸来抑制基因产物的表达并测试这些方法的影响和症状学以及变化。本发明以本发明人的新发现为前提，即，当寡核苷酸在体内代谢为它的单核苷酸时，会释放有生物活性的腺苷代谢物。含有腺苷(A)的寡核苷酸会降解并释放出腺苷代谢物，而该代谢物会激活例如位于肺中的腺苷受体而引起支气管收缩、炎症等。本发明的技术以设计靶向于和涉及不同功能、疾病和病理学的系统有关的基因和mRNA的反义寡核苷酸为基础。对寡核苷酸进行修饰以减少它们的腺苷含量，从而使在降解时由于腺苷的释放所引起的不利副作用的出现减至最少。这样做改善了所观察到的结果的统计学意义，特别是当腺苷受体可能涉及与所观察的作用相似或相反的作用时，或者通过引起所观察系统的实验模型的动态平衡的改变间接地改善。通过该方式，本发明人以特定的基因为靶点来设计一种或多种选择性地与相应的mRNA结合的反义寡核苷酸，如需要，可通过用通用的或可替代的碱基或不能激活腺苷A1、A2a、A2b或A3受体的腺苷类似物代替来降低其中的腺苷含量。在其以前的经验的基础上，本发明人认为，除了“向下调节”或消除特异性基因外，还可以通过选择缺乏胸腺嘧啶核苷(T)或胸腺嘧啶核苷(T)含量低的RNA蛋白片段或者用其它可与胸腺嘧啶核苷结合但不能激活腺苷受体和产生腺苷在肺等中的作用的核苷酸碱基(称为通用的或可替代的碱基)代替一个或多个存在于所设计的寡核苷酸中的腺苷来增加结果的精确性。由于腺苷(A)是一种与胸腺嘧啶核苷(T)互补的核苷酸，当T出现在RNA中时，反义寡核苷酸将在同样的位置含有A。为了达到一致，在本专利中，当从左向右读时，所有的RNA和寡核苷酸均用5′至3′方向的单链表示，尽管它们的互补序列也包括在本发明的范围内。此外，所有的核苷酸碱基和氨基酸均用IUPAC-IUB生物化学命名委员会所推荐的方式来表示，或用已知的3个字母的代码(对于氨基酸)来表示。
本发明的方法可用于确认许多靶基因有效或无效，从与个体的一个功能有关的单个基因到与一个系统内的网络或途径有关的多种单个的基因。确认有效/无效是指通过实验证据来证实一种特定的基因是否与多种生物物理学、生物化学、生理学、行为学等功能之一有关。即使一种基因在开始时没有作用，但也可以将其与另一种基因靶点一起测试，因为可能需要同时消除它们的表达才能观察到作用。本发明的反义物质的腺苷含量具有降低的A含量以防止该物质在体内降解时释放出A。例如，如果该系统是肺或呼吸系统，有大量基因与不同的功能有关，包括下表1所列的那些。
表1：肺疾病或病症肺和炎症靶点NfκB转录因子 白介素-8受体(IL-8R)白介素-5受体(IL-5R) 白介素-4受体(IL-4R)白介素-3受体(IL-3R) 白介素-1β(IL-1β)白介素-1β受体(IL-1βR) 嗜酸细胞活化趋化因子类胰蛋白酶 主要碱性蛋白β2-肾上腺素受体激酶 内皮缩血管肽受体A内皮缩血管肽受体B 前内皮缩血管肽原缓激肽B2受体(B2BR) IgE(高亲和性受体)白介素-1(IL-1) 白介素1体(IL-1R)白介素-9(IL-9) 白介素-9受体(IL-9R)白介素-11(IL-11) 白介素-11受体(IL-11R)诱导型一氧化氮合酶 环加氧酶(COX)细胞内粘着分子1(ICAM-1) 血管细胞粘着分子P亚组(VCAM)Rantes 内皮白细胞粘着分子内皮缩血管肽ETA受体 (ELAM-1)环加氧酶-2(COX-2) GM-CSF，内皮缩血管肽-1单核细胞活化因子 嗜中性白细胞趋化因子嗜中性白细胞弹性蛋白酶 防卫素1、2、3毒蕈硷乙酰胆碱受体 血小板活化因子肿瘤坏死因子α 5-脂氧合酶磷酸二酯酶IV P物质P物质受体 组胺受体胃促胰酶 CCR-1CC趋化因子受体白介素-2(IL-2) 白介素-4(IL-4)白介素-12(IL-12) 白介素-5(IL-5)白介素-6(IL-6) 白介素-7(IL-7)白介素-8(IL-8) 白介素-12受体(IL-12R)白介素-7受体(IL-7R) 白介素-1(IL-1)白介素-14受体(IL-14R) 白介素-14CCR-2 CC趋化因子受体 CCR-3 CC趋化因子受体CCR-4 CC趋化因子受体 CCR-5 CC趋化因子受体前列腺素类受体 GATA-3转录因子嗜中性白细胞粘着受体 MAP激酶白介素-15(IL-15) 白介素-15受体(IL-15R)白介素-11(IL-11) 白介素-11受体(IL-11R)NFAT转录因子 STAT4MIP-1α MCP-2MCP-3 MCP-4亲环蛋白(A，B等) 磷脂酶A2碱性成纤维细胞生长因子 金属蛋白酶CSBP/p38 MAP激酶 类胰蛋白酶受体PDG2 白介素-3(IL-3)白介素-10(IL-10) 环孢菌素A-结合蛋白FK506-结合蛋白 α4β1选择蛋白纤连蛋白 α4β7选择蛋白cMad CAM-1 LFA-1(CD11a/CD18)PECAM-1 LFA-1选择蛋白C3bi PSGL-1E-选择蛋白 P-选择蛋白CD-34 L-选择蛋白p150，95 Mac-1(CD11b/CD18)岩藻糖基转移酶 VLA-4STAT-1 STAT-2CD-18/CD11a CD11b/CD18ICAM2和ICAM3 C5aCCR3(嗜酸细胞活化趋化因子CCR1，CCR2，CCR4，CCR5受体)LTB-4 AP-1转录因子蛋白激酶C 半胱氨酰白三烯受体Tachykinnen受体(tach R) IκB激酶1 & 2白介素-2受体(IL-2R) (例如，P物质，NK-1 & NK-3受体)STAT6 c-masNF-白介素-6(NF-IL-6) 白介素-10受体(IL-10R)白介素-3(IL-3) 白介素-2受体(IL-2R)白介素-13(IL-13) 白介素-12受体(IL-12R)白介素-14(IL-14) 白介素-6受体(IL-6R)白介素-16(IL-16) 白介素-13受体(IL-13R)Medullasin 白介素-16受体(IL-16R)腺苷A1受体(A1R) 类胰蛋白酶-I腺苷A2b受体(A2bR) 腺苷A3受体(A3R)β类胰蛋白酶 STAT-3腺苷A2a受体(A2aR) IgE受体β亚单位(IgE Rβ)Fc-ε受体CD23抗原 IgE受体α亚单位(IgE Rα)IgE受体Fc受体(IgERFcεR) P物质受体组氨酸脱羧酶 类胰蛋白酶-1前列腺素D合酶 嗜曙红细胞阳离子蛋白嗜曙红细胞衍生的神经毒素 嗜曙红细胞过氧化物酶内皮一氧化氮合酶 内皮单核细胞活化因子嗜中性白细胞氧化酶因子 组织蛋白酶G巨噬细胞炎性蛋白-1- 白介素-8受体α亚单位(IL-8Rα)α/Rantes受体 内皮缩血管肽受体ET-B
这些基因以及其它的基因与呼吸的正常功能以及伴有呼吸病理学的疾病有关，包括囊性纤维化、哮喘、肺动脉高压和血管收缩、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、慢性支气管炎、呼吸窘迫综合征(ARDS)、过敏性鼻炎、肺癌和肺转移癌以及其它气道疾病，包括那些有炎症反应的疾病。已证实腺苷A1、A2a、A2b和A3受体、CCR3(趋化因子受体)、缓激肽2B、CAM(血管细胞粘着分子)和嗜曙红细胞受体等的反义寡核苷酸可以有效地向下调节这些基因的表达。其中的一些可以缓解症状或减轻呼吸病痛和/或炎症，例如，通过“向下调节”腺苷A1、A2a、A2b和/或A3受体和CCR3、缓激肽2B、CAM(血管细胞粘着分子)和嗜曙红细胞受体。这些物质可在本发明的方法中单独使用，或与靶向于其它基因的反义寡核苷酸结合使用，以确认与它们有关的途径和/或网络有效。为了获得更好的结果，优选将寡核苷酸通过吸入或其它方法直接施用到实验动物的呼吸系统，从而可以使寡核苷酸达到肺部而不会在全身内广泛散布。与系统给药或通过其它全身途径给药相比，这样做可以使用较低的剂量，因此可以降低由于物质在体内的广泛分布所引起的不利副作用的数量和程度。已证实本发明的物质可以降低组织表达的受体蛋白的量。因此，这些物质不仅可以和它们的靶点例如受体相互作用，而且可以降低其它药物也可以与其相互作用的靶蛋白的数量。通过该方式，本发明的物质提供了极高的效力而毒性很低。
以上讨论的受体仅仅是本发明的技术能力强的一些例子。事实上，可以通过本发明的方法以相同的方式靶向于大量基因，以明显地向下调节或消除蛋白质的表达并观察在系统例如呼吸、CNS、心血管、肾和其它系统内一种或多种功能的任何改变。例如，在呼吸系统内，测试的功能可以是呼吸的减轻、支气管收缩、炎症、慢性支气管炎、表面活性剂的生产等，以及其它与疾病和病症有关的方面，例如慢性阻塞性肺疾病(COPD)、吸入烧伤、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、囊性纤维化、肺纤维化、辐射肺炎、扁桃腺炎、肺气肿、牙疼、口腔炎症、关节痛、食管炎、肺癌和食管癌等。这些功能很有价值，因为它们与呼吸功能障碍有关，例如在哮喘、过敏、过敏性鼻炎、肺支气管收缩和肺高压、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、过敏、哮喘、囊性纤维化、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、直接或通过转移而侵染到肺的癌症的情况下，本发明的方法可用于一系列潜在的靶mRNA，包括在上表1中所列的靶点。在CNS系统中，可以选择的功能是食物摄取/饱满感、情绪变化、焦虑、性欲/性功能障碍、认知、性功能/功能障碍、脑创伤、阿耳茨海默氏介质(Alzheimer’s mediator)、动脉瘤等。
本发明的反义寡核苷酸可以通过如下方法制得：先选择含有至少4个相连的选自G和C的核酸和/或具有特定的活性类型和/或强度的靶核酸的片段，然后获得4至60个核苷酸长的含有选定片段并且胸腺嘧啶核苷(T)核酸的含量最多为(含)约15％、优选约12％、约10％、约7％、约5％、约3％、约1％、更优选不含胸腺嘧啶核苷的第一寡核苷酸。后一步骤可以通过获取4至60个核苷酸长的含有对选定片段反义的序列的第二寡核苷酸来进行，第二寡核苷酸的腺苷碱基含量最多为(含)约15％、优选约12％、约10％、约7％、约5％、约3％、约1％、更优选不含腺苷。当选定的片段含有至少一个胸腺嘧啶核苷碱基时，可在相应的反义寡核苷酸片段中用通用的或替代的碱基代替腺苷碱基，当在呼吸系统确认时，所述通用的或替代的碱基选自可与胸腺嘧啶核苷碱基结合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受体具有小于约10％、优选小于约1％、更优选小于约0.3％的腺苷碱基激动剂活性的杂芳族碱基或在腺苷A2a受体没有活性的杂芳族碱基。如需要，可在其它系统中测定在其它系统中的腺苷活性。
类似的杂芳族碱基可以选自所有的嘧啶和嘌呤类化合物，其可以被O、卤素、NH2、SH、SO、SO2、SO3、COOH以及支链和稠合的伯和仲氨基、烷基、链烯基、链炔基、环烷基、杂环烷基、芳基、杂芳基、烷氧基、链烯氧基、酰基、环酰基、芳基酰基、链炔氧基、环烷氧基、芳酰基、芳硫基、芳基磺酰氧基、卤代环烷基、烷基环烷基、链烯基环烷基、链炔基环烷基、卤代芳基、烷基芳基、链烯基芳基、链炔基芳基、芳基烷基、芳基链烯基、芳基链炔基、芳基环烷基所取代，其又可以被O、卤素、NH2、伯、仲和叔胺、SH、SO、SO2、SO3、环烷基、杂环烷基和杂芳基取代。嘧啶和嘌呤可以在本领域已知的所有位置被取代，但优选在1、2、3、4、7和/或8位被取代。更优选的嘧啶和嘌呤是茶碱、咖啡因、二羟丙茶碱、乙羟茶碱、哌醋茶碱、巴米茶碱、恩丙茶碱和具有如下化学结构式的黄嘌呤
其中R1和R2彼此独立地是H、烷基、链烯基或链炔基，R3是H、芳基、二环烷基、二环烯基、二环炔基、环烷基、环烯基、环炔基、O-环烷基、O-环烯基、O-环炔基、NH2-烷基氨基-酮氧基(ketoxy)烷氧基-芳基、单和二烷基氨基烷基-N-烷基氨基-SO2芳基等。在糖中的类似的修饰也是本发明的实施方案。对应于靶RNA中所存在的胸腺嘧啶核苷(T)的反义寡核苷酸中的腺苷含量减少可以防止寡核苷酸降解成可以向系统例如肺、脑、心脏、肾等、其周围的组织释放腺苷的产物，从而预防由于它所引起的任何不想要的作用。
例如，可以选择NfκB转录因子作为靶点，寻求它的mRNA或DNA中的低胸腺嘧啶核苷(T)或脱胸腺嘧啶核苷(脱T(desT))片段。只选择mRNA或DNA的脱T部分，然后由其产生脱A反义作为它们的互补链。当发现了大量RNA脱T部分时，可以推断出反义部分的序列。通常，可以获得约10至30甚至更大量的脱A反义序列。这些反义序列可以包括对应于靶点的mRNA的脱T部分的部分或全部脱A反义寡核苷酸序列，例如在上表1和下表2中所示的那些，以及其它与脑、心血管和肾系统的功能有关的那些。当这种情况出现时，所发现的反义寡核苷酸被称为100％不含A。对于每个对应于靶基因、例如NFκB转录因子的原始脱A反义寡核苷酸序列，通常可在靶基因或RNA内发现约10至30个具有低胸腺嘧啶核苷(RNA)含量的序列。根据本发明，选定的片段序列还可以在第二、第三或第四序列中含有少量的胸腺嘧啶核苷(RNA)核苷酸。在某些情况下，高的腺苷含量可能足以使反义寡核苷酸对靶点活性降低甚至没有活性。根据本发明，这些所谓的“不完全脱A”序列优选含有低于约15％、约12％、约10％、约7％、约5％和约2％腺苷的腺苷含量。首选不含腺苷(0％)。但是，在某些情况下，更高的腺苷含量是可以接受的而寡核苷酸仍不会显示有害的“腺苷活性”。特别重要的实施方案是腺苷核苷酸被“固定”或者被可以以相似或相同的亲和性与天然DNA中存在的四种核苷酸(A、G、C和T)中的两种或多种进行碱基配对的“通用或替代的”碱基所代替。
在本发明中，通用的或替代的碱基是指可以与胸腺嘧啶核苷杂交但与腺苷受体或腺苷通过其在实验动物或细胞系统中产生不利副作用的分子结合的能力较弱或者基本上不能与之结合的任何化合物、更常见的是腺苷类似物。或者，可以使用完全不能激活腺苷受体例如腺苷A1、A2a、A2b和/或A3受体、首选A1受体的腺苷类似物。通用或替代碱基的一个例子是α-脱氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)，技术人员可以知道如何选择其它的，该“固定”步骤产生了另一种新的序列，不同于和天然存在的序列反义的序列，这使得反义寡核苷酸可以与靶RNA结合，优选结合得同样好。通用或替代碱基的另一个例子是2-脱氧核糖基-(5-硝基吲哚)。通用或替代碱基的另一个例子是3-硝基吡咯-2′-脱氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脱氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脱氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脱氧肌苷、2′-脱氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮和2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤。此外，虽然其杂交的能力有所降低但仍可代替任何其它碱基的通用或替代碱基包括3-硝基吡咯2′-脱氧核苷2-脱氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脱氧肌苷和2′-脱氧水粉蕈素(Glen Research，Sterling，VA)。更特异性的错配修复可以使用“P”核苷酸、6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮(其碱基与鸟嘌呤(G)或腺嘌呤(A)配对)和“K”核苷酸、2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤(其碱基与胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶核苷(T)配对)。也可以使用本领域已知的或可以获得的其它物质。参见，例如，Loakes，D.和Brown，D.M.，Nucl.Acids Res.22：4039-4043(1994)；Ohtsuka，E.等，J.Biol.Chem.260(5)：2605-2608(1985)；Lin，P.K.T.和Brown，D.M.，NucleicAcids Res.20(19)：5149-5152(1992；Nichols，R.等，Nature 369(6480)：492-493(1994)；Rahmon，M.S.和Humayun，N.Z.，Mutation Research377(2)：263-8(1997)；Amosova，O.等，Nucleic Acids Res.25(10)：1930-1934(1997)；Loakes D.& Brown，D.M.，Nucleic Acids Res.22(20)：4039-4043(1994)，其关于通用或替代的碱基及其制备以及在核酸结合中的用途的部分引入本文作为参考。
当在天然的靶点中发现了不完全脱T序列时，通常对其进行选择以使约1至3个通用或替代的碱基替换将足以获得100％“脱A”的反义寡核苷酸。因此，本发明提供了针对不同靶点的A含量低或不含A的反义寡核苷酸，以及其中有一个或多个腺苷核苷酸，例如约1至3个或更多，通过用“通用或替代”的碱基置换所“固定”了的反义寡核苷酸。通用或替代的碱基是本领域已知的，无需在此列出。本领域技术人员将可以知道哪些碱基可以作为通用或替代的碱基并用其代替A。
文中所用的术语在某个系统例如呼吸、炎症、CNS、心肺、肾免疫和其它系统内确认靶“有效”或“无效”是指如下过程：先在系统例如CNS或心血管或心肺系统内选择一个治疗领域。可以在这些系统内进行选择用于研究的领域是焦虑、情绪障碍、饱满感和食欲的调节、疼痛、认知、睡眠诱导和障碍、体温调节等通过大脑控制或调节的领域，以及下表2所例举的那些。
随后的步骤是选择对应于适宜系统的基因序列数据库，例如CNS、肺、心脏系统、肾系统、血液、免疫系统、肺和呼吸系统、性功能/机能障碍、皮肤、眼、鼻通道、头皮、睾丸、子宫颈、口腔、咽、食道、小肠和大肠、滑膜组织、卵巢、耳道和其它系统。靶基因选自已知与CNS或CNS的特定区域有关的那些，以及功能未知的那些。也可以选择功能已知和可能在该系统中出现的基因。然后按照本文所述设计这些靶基因或mRNA片段的反义寡核苷酸。最后，通过与细胞和组织DNA和RNA体外杂交，根据消除或明显减少靶基因表达的能力对寡核苷酸进行选择。然后将体外显示出高的向下调节、消除或表达抑制作用的寡核苷酸用于体内测试，优选位点特异性地应用于例如脑、心脏、肾、肺等区域，并预测其行为学、生物物理学、生物化学、认知、运动、感觉、生理学和其它功能，对这些进行评估是为了确定在靶点和功能之间是否存在相关。例如，在呼吸系统中，可能显示相关性，进行该治疗的个体将表现出呼吸道或炎性肺疾病或其它肺病症如恶性肿瘤的症状的可能性降低。此处所用的术语“向下调节”是指引起靶向的分子内蛋白的生产、分泌或利用度降低(从而引起浓度的降低)，包括完全消除。
表2：与靶点和网络有关的疾病和病症的例子
痴呆 中风 焦虑抗伤害感受 痛觉缺失心肺功能自主控制 行为障碍 创伤性脑损伤 器管性脑疾病变性脑病CNS疾病 发展的药物敏感性异常和 视觉 (病毒性的等) 变形(合法的和非法的)
认识力 食物饱满感 醇敏感性 心脏病发作
学习 抑郁 摄食 脑炎
麻醉 听觉嗅觉 低氧症 精神分裂症
脑癌 颅缺陷记忆 神经病 神经性疼痛
牙痛 头痛 感觉 运动协调
情绪障碍 情绪鼓舞 双相性精神障碍 饮食障碍
恶病质 动脉瘤心脏和血管 充血性心脏和血管 心脏和血管渗出 心脏病 疼痛
炎症 中风 心绞痛 心衰
局部缺血 血小板形成再狭窄 病毒感染
心律失常 血管渗透性 动脉变性 性欲 血管生成和抑制 结构和生物化学缺陷 发怒 移植物排斥
本发明主要涉及在哺乳动物的脊椎动物中确认靶有效，该组的动物包括人和非人类的类人猿、野生和家养的动物、海洋和陆地上的动物、家庭宠物和动物园的动物，例如，猫科动物、犬、马、厚皮兽类、鲸鱼，但更优选人类。该技术的一种特别适宜的应用是用于兽医的目的，包括兽医所关注的所有类型的小型和大型动物，包括野生动物、海洋动物、家养动物、动物园的动物等。靶基因和蛋白优选哺乳动物的，靶序列优选与所治疗的个体属于同一物种。尽管在许多情况下，不同物种的靶也是适宜的，特别是那些与受体的序列显示大于约45％同源性、优选大于约85％同源性、更优选大于约95％同源性的靶RNA或基因的部分。一组优选的物质包括脱A反义寡核苷酸。另一个优选的组包括其中有一个或多个腺苷碱基被通用或替代的碱基所代替了的不完全脱A寡核苷酸。
术语“反义”寡核苷酸通常是指小的、合成的寡核苷酸，类似于单链DNA，其在本专利中用于通过抑制靶信使RNA(mRNA)来抑制基因的表达。参见Milligan，J.F.等，J.Med.Chem.36(14)，1923-1937(1993)，其相关的部分全文引入本文作为参考。本发明的方法使用反义物质来抑制靶基因的表达，包括上表1中所列的那些。该物质通常通过将反义寡核苷酸与本领域已知的信使RNA(mRNA)的编码(有义)序列杂交得到。外源性施用本发明的物质可以降低由靶基因所编码的mRNA和蛋白的水平和/或引起所处理的细胞生长特性或形状的改变。参见，Milligan等(1993)；Helene，C.和Toulme，J.Biochim.Biophys.Acta 1049，99-125(1990)；Cohen，J.S.D.编，寡核苷酸脱氧核苷酸作为基因表达的反义抑制剂；CRC Press：Boca Raton，FL(1987)，其相关的部分全文引入本文作为参考。文中所用的“反义寡核苷酸”通常是合成的核苷酸的短序列，该序列(1)可在适宜的杂交条件下与编码靶蛋白的mRNA的任意部分杂交，并且(2)在杂交后可以引起靶蛋白基因表达的降低。术语“脱腺苷”(脱A)和“脱胸腺嘧啶核苷”(脱T)是指基本不含腺苷(脱A)或胸腺嘧啶核苷(脱T)的寡核苷酸。在某些情况下，脱T序列是天然存在的，在另外一些情况下，它们可以通过将不想要的核苷酸(A)用另一种缺乏其不想要的活性的核苷酸代替而得到。本文中，这通常通过将A用本领域已知的“通用或替代的碱基”代替来完成。
靶蛋白的mRNA序列可以从表达蛋白的基因的核苷酸序列得到，无论是已经存在的靶点或是可能在将来发现的靶点。许多不同系统的靶基因的序列是已知的。参见GenBank数据库，NIH，其所有的序列均引入本文作为参考。对于那些序列仍然未知的基因的序列，可以通过用本领域已知的技术分离靶点部分来获得。一旦基因序列、其RNA和/或蛋白成为已知的，就可以按照以上描述生产反义寡核苷酸并用于通过体内施用并按照常规技术检测靶蛋白生产的减少和特定功能的下降来确认靶有效。在本发明的一个方面，反义寡核苷酸具有可与编码与特定系统例如CNS、呼吸、肺、运动、感觉、激素调节、心脏、肾、免疫、血液、癌基因等的疾病或病症有关的蛋白的mRNA分子的部分或片段特异性结合的序列。这种结合的效果之一是减少甚至防止相应的mRNA的翻译，由此减少靶蛋白在个体肺中的含量。
在本发明的一个优选的实施方案中，反义寡核苷酸的一个或多个磷酸二酯残基是修饰或取代的。特别优选可以增加寡核苷酸体内稳定性的带有修饰或取代的磷酸二酯残基的寡核苷酸的化学类似物，例如修饰成甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或氨基磷酸酯。寡核苷酸的天然磷酸二酯键容易被细胞的核酸酶引起一定程度的降解。与此相反，本文所提出的许多残基对于核酸酶的降解是高耐受性的。参见Milligan等，和Cohen，J.S.D.，同上。在本发明的另一个优选的实施方案中，可以通过加入“3′-末端的帽”来防止寡核苷酸的降解，其中，用耐核酸酶的键代替寡核苷酸3′末端的磷酸二酯键。参见，Tidd，D.M.和Warenius，H.M.，Be.J.Cancer 60：343-350(1989)；Shaw，J.P.等，Nucleic Acids Res.19：747-750(1991)，其相关的部分全文引入本文作为参考。氨基磷酸酯、硫代磷酸酯和甲基膦酸酯键均可以以该方式同样地实现本发明的目的。对磷酸二酯骨架修饰得越多，所形成的物质越稳定，在许多情况下它们的RNA亲和性和细胞通透性越高。参见Milligan，等，同上。因此，可被修饰或取代的残基的数量将根据需要、靶点、给药途径而改变，可以是从1至所有残基之间的任何数量。已知有许多不同的用新的键代替整个磷酸二酯骨架的方法。参见Millikan等，同上。碱基、核苷酸间的键或糖的优选的残基类似物包括硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、磷酸三酯、thioformacetal、二硫代磷酸酯、氨基磺酸酯、formacetal、硼杂磷酸酯、3′-thioformacetal、5′-硫醚、碳酸酯、5′-N-氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、磺酰胺、砜、亚硫酸酯、2-O-甲基、亚砜、硫化物、羟基胺、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)、亚甲基(甲基亚氨基)(MMI)和亚甲基氧基(甲基亚氨基)(MOMI)残基。特别优选硫代磷酸酯和甲基膦酸酯，因为它们可以通过自动寡核苷酸合成得到。参见，Millikan等，同上。如果适当的话，可将本发明的物质以可药用盐的形式或以反义寡核苷酸和盐的混合物的形式给药。在本发明的另一个实施方案中，将不同反义寡核苷酸或其可药用盐的混合物进行给药。本发明的物质可以减少一种靶mRNA的表达和/或增强或减弱一种途径的活性。例如，本发明的方法可用于在靶mRNA或基因中鉴定所有可能的约7或更多个单核苷酸、优选最多约60个单核苷酸、更优选约10至约36个单核苷酸、仍更优选约12至约21个单核苷酸的胸腺嘧啶核苷(T)含量低的脱氧核糖核苷酸部分或腺苷(A)含量低的脱氧核苷酸部分。这可以通过在靶序列中寻找7个或更多单核苷酸长的胸腺嘧啶核苷(与腺苷互补的核苷酸)含量低或缺乏胸腺嘧啶核苷的单核苷酸部分(RNA)或腺苷含量低的单核苷酸部分(基因)来完成。在大部分情况下，这种寻找通常产生约10至30个这样的序列，即天然缺乏或腺苷含量低于约40％的序列，具有平均长度、即约1800个核苷酸长的典型靶mRNA的不同长度的反义寡核苷酸。具有高T或A含量的序列可以通过用通用或替代的碱基代替一个或单个A来固定。
本发明的物质可以具有任何适宜的长度，包括但不仅限于约7至约60个核苷酸长，优选约12至约45，更优选最多约30个核苷酸长，仍更优选最多约21个，但它们也可以是其它的长度，这取决于具体的靶点和输送的方式。本发明的物质可以针对任何及所有的靶RNA。一组优选的物质包括针对在内含子和外显子之间含有接点的mRNA区域。当该物质针对内含子/外显子接点时，它可以完全叠在接点之上，或者可以与接点足够接近以抑制插入的外显子在将前体mRNA加工成成熟mRNA的过程中被剪切掉，例如，使反义寡核苷酸的3′或5′末端位于例如内含子/外显子接点的约2至10、优选约3至5个核苷酸之间。还优选覆盖了起始密码子以及那些靠近编码区域的5′和3′末端的反义寡核苷酸。反义寡核苷酸可以具有约0、约3％、约5％、约7％至约8％、约10％、约12％、约15％的腺苷含量，以及任何中间的腺苷含量的数量和范围。在本发明的方法中，可以有一个或多个或全部的A被通用或替代的碱基所代替，例如可与胸腺嘧啶核苷结合但在腺苷A1、A2a、A2b和A3受体具有小于约0.5、约0.3％、约0.1％的腺苷激动剂或拮抗剂活性的杂芳族碱基或在腺苷A2a受体没有活性的杂芳族碱基。替代的碱基可以是3-硝基吡咯-2′-脱氧核苷、5-硝基-吲哚、2-脱氧核糖基-(5-硝基吲哚)、2-脱氧呋喃核糖基-(5-硝基吲哚)、2′-脱氧肌苷、2′-脱氧水粉蕈素、6H，8H-3，4-二氢嘧啶并[4，5-c]噁嗪-7-酮或2-氨基-6-甲氧基氨基嘌呤等。寡核苷酸可以用甲基化的胞嘧啶(mC)来代替CpG二核苷酸中的一个或多个或全部未甲基化的C，如果后者在寡核苷酸中存在的话。本发明还可以采用对嘧啶的其它C5修饰，例如C5丙炔等。适用于本发明方法的一个或多个或全部寡核苷酸连接残基可以是甲基膦酸酯、磷酸三酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硼杂磷酸酯、formacetal、thioformacetal、硫醚、碳酸酯、氨基甲酸酯、硫酸酯、磺酸酯、氨基磺酸酯、磺酰胺、砜、亚硫酸酯、亚砜、硫化物、羟基胺、亚甲基(甲基亚氨基)、(MMI)、甲氧基甲基(MOM)、甲氧基乙基(MOE)、亚甲基氧基(甲基亚氨基)(MOMA)、甲氧基甲基(MOM)、2′-O-甲基、氨基磷酸酯和C-5取代的(C-5丙炔)残基及其组合。用于本发明的寡核苷酸可与载体相连，例如原核或真核的载体，载体的许多例子是本领域已知的。本发明的方法指定了施用一定量的可以有效降低mRNA的生产或利用度或增加其降解或减少肺中多肽含量的反义寡核苷酸。给药优选在原位进行，例如，对于呼吸和肺靶点，可以通过吸入或应用于个体的肺而直接向呼吸系统或鼻通道内给药。反义寡核苷酸可以通过注射、立体定位插入或在体外直接向脑、心脏、肾、肿瘤、睾丸、眼、耳道、子宫颈、鼻通道、头皮、口腔、肌肉、咽、食管、肠、直肠、滑膜组织、卵巢和其它定位的组织给药。此外，当靶点是循环系统和免疫系统的一部分时，还可将寡核苷酸向血液中给药。在后一种情况下，当疾病或病症与免疫机能障碍有关时，靶点可以是免疫球蛋白、抗体受体、细胞因子、细胞因子受体、编码它们的基因和相应的mRNA、基因和mRNA侧翼区以及外显子和内含子边界等。当疾病或病症与恶性肿瘤或癌症有关时，靶点可以选自生长调节相关性的酶和其它蛋白，免疫球蛋白和抗体受体、编码它们的基因和mRNA、与癌基因有关的基因和mRNA、以及基因组和mRNA侧翼区和外显子和内含子边界。此外，与癌症过程有关的某些正常细胞的基因例如血管生成因子、粘着分子和与癌转移有关的蛋白酶等也是本发明的一部分。例如，该方法可以通过将组合物体外施用、口服、腔内施用、鼻内施用、肛门内施用、阴道内施用、子宫内施用、颅内施用、肺部施用、肾内施用、节内(intranodularly)施用、关节内施用、intraotically施用、淋巴内施用、经皮施用、颊内施用、静脉内施用、皮下施用、肌肉内施用、肿瘤内施用、腺内施用、眼内施用、颅内施用、器官内施用、血管内施用、鞘内施用、通过植入、吸入施用、真皮内施用、肺内施用、耳内施用、心脏内施用、通过缓释、持续释放或通过泵施用来完成。靶点的其它例子是编码多肽的基因和mRNA，所述的肽选自转录因子、刺激和活化因子、细胞因子及其受体、白介素、白介素受体、趋化因子、趋化因子受体、内源性产生的特异性和非特异性酶、免疫球蛋白、抗体受体、中枢神经系统(CNS)和外周神经和非神经系统受体、CNS和外周神经和非神经系统肽递质、粘着分子、防卫素、生长因子、血管活性肽、肽受体和结合蛋白、对应于癌基因的基因和mRNA、G蛋白偶联受体等。反义寡核苷酸可以通过如下方法来生产：从与影响肺气道的疾病和病症例如呼吸活动困难和恶性肿瘤、表面活性剂的分泌增加或减少等有关的肽、编码它们的基因和RNA、基因组和mRNA侧翼区以及基因和mRNA外显子和内含子边界选择靶点；获得mRNA序列，所述mRNA选自对应于靶基因的mRNA和编码靶多肽的mRNA、基因组和mRNA侧翼区以及基因和mRNA外显子和内含子边界；选择至少一种mRNA的片段；合成一种或多种对选定的mRNA的片段反义的寡核苷酸；以及，如需要，用一种能够与胸腺嘧啶核苷(T)杂交但在腺苷受体的激动剂能力较低或者没有激动剂能力(无或降低的腺苷受体激活)的替代碱基代替一个或多个A以使寡核苷酸中A的含量降低至整个核苷酸的最多约15％。正如以上所指出的，适宜的靶点是靶蛋白、编码多肽的基因和mRNA(所述的肽选自转录因子、刺激和活化因子、白介素、白介素受体、趋化因子、趋化因子受体、内源性产生的特异性和非特异性酶、免疫球蛋白、抗体受体、中枢神经系统(CNS)和外周神经和非神经系统受体、CNS和外周神经和非神经系统肽递质及其受体、粘着分子、防卫素、生长因子、血管活性肽及其受体以及结合蛋白)、对应于癌基因的靶基因和mRNA、及其侧翼区和外显子和内含子边界。编码的多肽可以选自NfκB转录因子、白介素-8受体(IL-8R)、白介素5受体(IL-5R)、白介素4受体(IL-4R)、白介素3受体(IL-3R)、白介素-1β(IL-1β)、白介素1β受体(IL-1βR)、嗜酸细胞活化趋化因子、类胰蛋白酶、主要碱性蛋白、β2-肾上腺素受体激酶、内皮缩血管肽受体A、内皮缩血管肽受体B、前内皮缩血管肽原、缓激肽B2受体、IgE高亲和性受体、白介素1(IL-1)、白介素1受体(IL-1R)、白介素9(IL-9)、白介素-9受体(IL-9R)、白介素11(IL-11)、白介素-11受体(IL-11R)、诱导型一氧化氮合酶、环加氧酶(COX)、细胞内粘着分子1(ICAM-1)血管细胞粘着分子(VCAM)、Rantes、内皮白细胞粘着分子(ELAM-1)、单核细胞活化因子、嗜中性白细胞趋化因子、嗜中性白细胞弹性蛋白酶、防卫素1、2和3、毒蕈硷乙酰胆碱受体、血小板活化因子、肿瘤坏死因子α、5-脂氧合酶、磷酸二酯酶IV、P物质、P物质受体、组胺受体、胃促胰酶、CCR-1 CC趋化因子受体、CCR-2 CC趋化因子受体、CCR-3 CC趋化因子受体、CCR-4 CC趋化因子受体、CCR-5 CC趋化因子受体、前列腺素类受体、GATA-3转录因子、嗜中性白细胞粘着受体、MAP激酶、白介素-9(IL-9)、NFAT转录因子、STAT 4、MIP-1α、MCP-2、MCP-3、MCP-4、亲环蛋白、磷脂酶A2、碱性成纤维细胞生长因子、金属蛋白酶、CSBP/p38 MAP激酶、胰蛋白受体、PDG2、白介素-3(IL-3)、白介素-1β(IL-1β)、环孢菌素A-结合蛋白、FK5-结合蛋白、α4β1选择蛋白、纤连蛋白、α4β7选择蛋白、Mad CAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、PECAM-1、LFA-1选择蛋白、C3bi、PSGL-1、E-选择蛋白、P-选择蛋白、CD-34、L-选择蛋白、p150，95、Mac-1(CD11b/CD18)、岩藻糖基转移酶、VLA-4、CD-18/CD11a、CD11b/CD18、ICAM2和ICAM3、C5a、CCR3(嗜酸细胞活化趋化因子受体)、CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、LTB-4、AP-1转录因子、蛋白激酶C、半胱氨酰白三烯受体、Tachychinnen受体(tach R)、IκB激酶1&2、STAT 6、c-mas和NF-白介素-6(NF-IL-6)、其侧翼区和外显子和内含子边界。但是，本发明主要是用于无法在公共数据库中得到的新发现的基因。因为对于这组基因而言靶确认是非常重要的，否则它们在疾病中的作用将仍然是未知的。
下表3简单地列出了本发明的物质可以有效应用的靶点。这仅仅是举例性的。该方法可用于其中的靶确认将依赖于在寡核苷酸降解过程中生物活性的腺苷的释放来讨论的任何系统。这很重要，因为腺苷是抗炎剂，它的释放将会使癌症靶点的确认结果变得难以解释。
表3： 癌症靶点
转化癌基因 治疗靶点
ras 胸苷酸合成酶
src 胸苷酸合成酶
myc 二氢叶酸还原酶
bcl-2 胸腺嘧啶核苷激酶
脱氧胞苷激酶
核糖核苷酸还原酶
血管生成因子 粘着分子
癌基因 叶酸途径的酶
DNA修复基因 (一碳库)
端粒末端转移酶
HMG CoA还原酶
法尼基转移酶
葡萄糖-6-磷酸酯转移酶
一组优选的用于确认癌症靶点有效的靶点是与不同类型的癌症有关的基因，或那些通常认为与恶性肿瘤有关的靶点，无论它们是调节或是参与RNA和/或蛋白的生产。其例子是转化癌基因，即上表3中所示的靶点等。本发明的癌症靶确认物质所针对的其它靶点是各种酶，主要是(但不仅限于)胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶、胸腺嘧啶核苷激酶、脱氧胞苷激酶、核糖核苷酸还原酶、在癌症细胞中含量比在正常细胞中丰富的其它基因产物等。本发明的技术特别适用于确认癌症靶基因有效/无效，因为传统的癌症疗法不能有效地选择性地杀死癌细胞并同时防止由于化疗、放疗等的治疗所引起的对正常活细胞的毁灭性的影响。也就是说，现有的癌症疗法不能选择性地靶向于恶性肿瘤细胞。用本发明的方法确认的任何靶点都能够选择性地弱化所需的基因产物并弱化或增强功能及其途径。该方法明显优于常规的癌症疗法，因为它允许选择一个系统，并且在系统内选择一种包括多个靶点(例如第一、第二以及可能的第三靶点，这些靶点一般不会在正常的细胞内同时表达)的途径并将它们分别和共同确认。因此，本发明的方法将会提供用于治疗的靶点。一旦通过本发明的方法确认靶点有效，就可以向个体施用作用于该靶点的选择性的物质以引起在例如表达三个靶点的肿瘤细胞内的毒性选择性的增加，而仅表达一个或两个靶点的正常细胞受到的影响将明显较小甚至不受影响。本发明的方法所施用的物质优选设计为对与待给药的物种有关的靶基因和/或mRNA反义的物质。当用于在人类中确认靶点有效时，所述物质优选设计为对人类基因或RNA是反义的。本发明的物质包括对天然DNA和/或RNA序列或其长度最多为比靶序列少一个碱基、优选至少约7个核苷酸长的片段反义的寡核苷酸，含有仅约0.1％、约1％、约4％至约5％、约10％、约15％、约30％或不含腺苷的寡核苷酸，以及其中的一个或多个腺苷核苷酸被可与胸腺嘧啶核苷核苷酸配对但基本不能激活腺苷受体活性的所谓通用或替代的碱基代替了的寡核苷酸。本发明的反义寡核苷酸的人类序列和片段的例子是如下片段以及所述片段和编码序列、外显子和内含子-外显子接点的完整基因或mRNA的更短的部分，优选在每个序列中含有7、10、15、18至21、24、27、30、n-1个核苷酸，其中n是序列的核苷酸总数。这些片段可以选自长寡核苷酸的任何部分，例如中部、5′-末端、3′-末端，或从原始序列的任何其它位点开始。特别重要的是低腺苷核苷酸含量的片段，即那些含有低于或约30％、优选低于或约15％、更优选低于或约10％、仍更优选低于或约5％、首选不含腺苷核苷酸的片段，可以通过选择或按照本发明用通用或替代的碱基代替。本发明的物质首选包括其中有一个或多个存在于序列中的腺苷被本文所例举的通用或替代的碱基(B)代替了的序列及其片段。同样，本发明还包括设计用B代替序列中所含的腺苷(A)的含B片段、其片段或部分的所有更短的片段，参见以上的描述。
本发明的方法可以将这些物质单独使用或将其以含有以上所述的可以有效减少靶蛋白表达的量的反义寡核苷酸的药物组合物的形式使用。反义寡核苷酸必须先通过细胞膜才能与编码细胞内蛋白的mRNA特异性地结合并阻止它的翻译。该组合物存在于适宜的可药用载体中，例如无菌无热原的盐水溶液。本发明的物质可以用能够通过细胞膜的疏水性载体来配制，例如在脂质体中配制，所述脂质体处于可药用含水载体中，并且选择性地含有表面活性剂或脂质。此外，还可将寡核苷酸与能够灭活mRNA的物质例如核酶偶联，以更完全地抑制翻译。药物制剂还可以含有嵌合的分子，其中，反义寡核苷酸与已知可以被细胞内化的分子连接。这些寡核苷酸轭合物利用细胞摄取途径来增加寡核苷酸的细胞内浓度。以该方式应用的分子的例子是大分子，包括转铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白(与寡核苷酸通过多溶素连接)和链霉抗生物素以及本领域已知的其它大分子。本发明的方法还使用在药物制剂中的反义化合物，例如在脂质颗粒或囊内，例如脂质体或微晶。颗粒可以是任何适宜的结构，例如单层的或多层的结构。在一种优选的实施方案中，反义寡核苷酸包含在脂质体内。对于这些颗粒和囊，特别优选带正电荷的脂质，例如N-[1-(2，3-二油酰氧基)丙基]-N，N，N-三甲基铵甲基硫酸盐，或称为“DOTAP”。但是，其它的脂质也是适合的，并且事实上可能更加适合。所述脂质颗粒的制备是公知的。参见，例如，美国专利4,880,635(授予Janoff等)、4,906,477(授予Kurono等)、4,911,928(授予Wallach)、4,917,951(授予Wallach)、4,920,016(授予Allen等)、4,921,757(授予Wheatley等)，其相关的部分全文引入本文作为参考。本发明的方法可以通过任何方法来施用反义寡核苷酸，优选可以使输送最少的方法，例如在脑、肺、肾、心脏、睾丸等原位给药。
向肺施用物质可以通过任何适宜的方法来完成，但优选以可吸入制剂的形式通过呼吸系统给药，更优选以含有可吸入颗粒的气雾剂的形式给药，所述可吸入颗粒含有用于由患者吸入的物质。可吸入颗粒可以是气体、液体或固体形式的，它们可以选择性地含有其它治疗成分和制剂成分。本发明的颗粒优选是可吸入大小的颗粒，优选足够小从而可以在吸入时通过口腔和喉并进入到肺部的支气管和肺泡。通常，约0.5至10微米范围内的颗粒是可吸入的。但是，其它的尺寸也是适宜的。包含在可吸入制剂中的直径较大的不可吸入尺寸大小的颗粒有可能沉积在喉道并且可能被吞下。因此，最好将气雾剂中不可吸入颗粒的量减至最少。对于经鼻给药，优选10-500μm范围内的颗粒以确保它们能够停留在鼻腔内。含有所述物质的液体颗粒的气雾剂可以通过任何适宜的方法产生，例如使用吹入器或雾化器。参见，例如美国专利号4,501,729。适宜的抛射剂包括溶剂，例如某些氯氟化碳化合物，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷和/或它们的混合物。其它抛射剂也是适合的，并且当其更适于具体的应用时，它们可能是优选的。制剂还可以含有一种或多种助溶剂例如乙醇；表面活性剂例如油酸或脱水山梨醇三油酸酯；抗氧剂和适宜的矫味剂。反义寡核苷酸可以通过立体定位的方法或通过向CNS的靶隔离区域注射向脑给药，所有这些方法均是本领域已知的。或者，可以将寡核苷酸以本领域已知的可以通过血脑屏障的制剂形式给药，例如，可以用链霉抗生物素和抗转铁蛋白受体的单克隆抗体的轭合物作为向脑输送单生物素化的肽、反义寡核苷酸(磷酸二酯的3′-生物素化或其它衍生物)和肽-寡核苷酸的通用载体。参见，例如，Levy，R.M.等，J.Neuroviral 3Suppl：574-75(1997)；Wu-Pong和Gewirtz，BioPharm，pp.32-38(Jan.1999)；Boado，R.J.，等，J.Pharm.Sci.87(11)：1308-1315(1998)。向心脏、肝和肾以及其它器管给药可以通过原位给药技术来进行，例如导管插入、注射和局部扩散，所有这些均是本领域已知的。参见，例如，Lewis，K.J.等，J.Drug Target，5(4)：291(1998)；Ayrin，M.A.等，Cathet.Cardiovasc.Diagn，41(3)：232-240(1997)；Luft，F.C.，J.Molec.Med.76(2)：75(1998)。这些给药通常用所述物质的液体、固体或气体药物组合物来进行，这些药物组合物可以通过将反义寡核苷酸与适宜的溶媒或载体如无菌无热原的水、脂质和/或其它药学或兽医学可接受的载体混合来制备。还可以含有其它治疗化合物以及本领域已知的其它制剂成分。含有本发明的微粉化的物质的干燥颗粒的固体颗粒组合物可以通过如下方法制备：将干燥的反义化合物用研钵和研棒研磨，然后将研磨的微粉化的组合物过筛(例如400目筛)以破碎或分离颗粒的大块。含有反义化合物的固体颗粒组合物还可以选择性地含有分散剂和其它已知的物质，其作用是有助于形成雾或气雾剂。适宜的分散剂是乳糖，它可以与反义化合物以任何适宜的比例混合，约为1∶1w/w。也可以使用其它比例，并且还可以含有其它治疗剂和制剂成分。本专利中引用的参考文献的相关部分均引入本文作为参考，特别是那些有助于实现和书面描述本发明各方面的出版物和专利。
反义化合物的给药剂量通常随着靶点、功能及其放大作用、所研究的疾病、个体的条件、具体的制剂、给药的途径和部位、给药时间等。通常，优选获得0.05至50μM、或更优选0.2至5μM的寡核苷酸细胞内浓度。但是，优选测定剂量-反应曲线以便确定适宜的剂量来观察明确的反应。所用的剂量可以改变，例如，通常采用约0.001、约0.01、约1mg/kg至约50、约100和约150mg/kg的剂量。本领域技术人员可以理解，对于特殊应用，也可以采用更高和更低的剂量。这些剂量可以给药一次或根据需要在一段时间内(例如每24小时)给药，但也可以采用其它的给药方案。用以下实施例来说明本发明，不应将这些实施例看作是对本发明的限定。在这些实施例中，μM表示微摩尔，mL表示毫升，μm表示微米，mm表示毫米，cm表示厘米，℃表示摄氏度，μg表示微克，mg表示毫克，g表示克，kg表示千克，M表示摩尔，hrs表示小时。实施例实施例1：反义寡核苷酸的设计和合成
针对靶受体的反义寡核苷酸的设计可能需要了解靶受体mRNA的复杂的二级结构。在得到该结构之后，设计靶向mRNA区域的反义核苷酸，所述区域可被认为赋予mRNA功能活性或稳定性，且最好可与起始密码子重叠。其他靶位点是易于使用的。作为反义作用的特异性的实证，其他不完全与靶mRNA互补但在w/w基础上含有相同核苷酸组成的寡核苷酸，作为对照包含在反义实验中。例如，分析腺苷A1受体的mRNA二级结构，并如上述将其用于设计硫代磷酸反义寡核苷酸。合成的反义寡核苷酸被命名为HAdA1AS，具有如下序列：5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO：1)。作为对照，合成错配的硫代磷酸反义核苷酸，其被命名为HAdA1MM1，具有如下序列：5′-GTA GCA GGC GGG GAT GGG GGC-3′(SEQ IDNO：2)。各寡核苷酸具有相同的碱基含量和通用的序列结构。在GENBANK(释放85.0)和EMBL(释放40.0)中进行同源性搜索，结果显示，反义寡核苷酸特异性针对人和兔的腺苷A1受体基因，且错配的对照不是用任何已知基因序列进行的杂交的候选物。腺苷A3受体mRNA的二级结构类似地进行分析，并如上述用于设计二硫代磷酸反义寡核苷酸。合成的第一个反义寡核苷酸(HAdA3AS1)具有如下序列：5′-GTT GTT GGG CAT CTT GCC-3′(SEQ ID NO：3)。作为对照，合成一错配的硫代磷酸反义寡核苷酸(HAdA3MM1)，具有如下序列：5′-GTA CTT GCG GAT CTA GGC-3′(SEQ ID NO：4)。还设计并合成了第二个硫代磷酸反义寡核苷酸(HAdA3AS2)，其具有如下序列：5′-GTGGGC CTA GCT CTC GCC-3′(SEQ ID NO：5)。其对照寡核苷酸(HAdA3MM2)具有序列：5′-GTC GGG GTA CCT GTC GGC-3′(SEQ IDNO：6)。硫代磷酸寡核苷酸用Applied Biosystems 396型寡核苷酸合成仪合成，并利用NENSORB层析(DuPont，MD)进行纯化。实施例2：腺苷A1受体反义寡核苷酸的体内测定
利用肺腺癌细胞HTB-54，测定上述针对人A1受体的反义寡核苷酸(SEQ ID NO：1)在体外模型中的功效。利用标准RNA印迹方法和在实验室设计和合成的受体探针，证实HTB-54肺腺癌细胞表达A1腺苷受体。将HTB-54人肺腺癌细胞(106/100mm的组织培养皿)暴露于5.0μM HAdA1AS或HAdA1MM1 24小时，在温育后12小时更换新鲜的培养基和寡核苷酸。在暴露于寡核苷酸24小时后，收集细胞，用标准方法提取其RNA。合成对应于由反义序列(并因此具有与所述反义序列相同的序列，但不是硫代磷酸化的)靶向的mRNA区域的A 21-聚探针，并将其用于探查RNA的RNA印迹，所述RNA从经HAdA1AS处理、HAdA1MM1处理和非处理的HTB-54细胞制备得到。这些印迹清楚地显示，HAdA1AS而不是HAdA1MM1有效地减少＞50％的人腺苷受体mRNA。该结果显示，HAdA1AS是抗哮喘药的一个良好的候选物，因为它匮乏针对参与哮喘的腺苷A1受体的细胞内mRNA。实施例3：腺苷A1受体反义寡核苷酸的体内功效
在与起始密码子重叠的腺苷A1基因内，兔和人DNA序列的偶然同源性使硫代磷酸反义寡核苷酸能够使用，所述硫代磷酸反义寡核苷酸最初是被设计用于在兔模型中对抗人腺苷A1受体。用混有10％高岭土的312抗原单位/ml的屋尘螨(D.farinae)提取物(BerkeleyBiologicals，Berkeley，CA)，在出生后的24小时内对无巴斯德氏菌属的新生新西兰白兔进行腹膜内免疫。在第一个月，每周重复免疫一次，然后在接下来的2个月，隔周免疫一次。用氯胺酮盐酸盐(44mg/kg)和乙酰丙嗪马来酸盐(0.4mg/kg)的混合物，经肌肉内给药，使8只3-4个月大的已致敏的兔麻醉和松弛。然后，将兔以一舒适的姿势面朝上放置在一个小的模塑填塞型动物板上，把4.0-mm的气管内导管(Mallinkrodt，Inc.，Glens Falls，NY)插入。将一连有乳胶球的外经2.4mm的聚乙烯导管插入到食道中，并在整个实验中和嘴部保持相同的距离(大约16cm)。将气管内导管与开启的Fleisch呼吸速度描记器(尺寸00；DOM Medical，Richmond，VA)相连，并利用由Gould载波放大器(11-4113型；Gould Electronic，Cleveland，OH)驱动的Validyne压差传感器(DP-45161927型；Validyne Engineering Corp.，Northridge，CA)来测量气流量。将食道球与压差传感器的一侧相连，并将气管内导管的流出口连接到压力传感器的另一侧，以允许记录肺与肺内腔之间的压差。综合气流量，给出一连续的定时涨落量，并利用自动呼吸分析仪(6型；Buxco，Sharon，CT)分别在等容和气流零点计算总肺阻力(RL)和动态伸缩率(Cdyn)的测量值。随机选择动物，获得针对气雾剂化腺苷的处理前第1天PC50值。反义(HAdA1AS)或错配的对照(HAdA1MM)寡核苷酸溶于无菌生理盐水中，浓度为5000μg(5mg)/1.0ml。随后经气管内导管向动物给予气雾剂化的反义或错配寡核苷酸(大约5000μg，体积为1.0ml)，每天两次，共两天。通过超声雾化器(DeVilbiss，Somerset，PA)生成盐水、腺苷或者反义或错配寡核苷酸的气雾剂，产生气雾剂液滴，其中80％的直径小于5μm。在第一批实验中，向4只随机选择的变态反应兔给予反义寡核苷酸，向另4只给予错配的对照寡核苷酸。在第三天的早晨，获得PC50值(将支气管导管的动态伸缩率从基线值降低50％所必需的气雾剂化腺苷浓度，mg/ml)，并与在暴露于寡核苷酸前这些动物的PC50值相比较。在间隔1周后，对动物交换给药，向那些先前给予错配对照寡核苷酸的动物现在给予反义寡核苷酸，向那些先前给予反义寡核苷酸的动物现在给予错配对照寡核苷酸。处理方法和测量和在第一批实验中所使用的相同。应注意到，在至多达到腺苷的溶解度极限20mg/ml下，在8只用反义寡核苷酸处理的动物中有6只不能产生由腺苷介导的支气管收缩。出于计算的目的，这些动物的PC50值被设定为20mg/ml。因此，给出的这些值代表了反义效果的最小值。实际的效果更高。该实验的结果列于下表4中。
表4：腺苷A1受体反义寡核苷酸对哮喘兔中的PC50值的影响
错配对照 A1受体反义寡核苷酸 给予寡核苷酸之前 给予寡核苷酸之后 给予 寡核苷酸之前 给予 寡核苷酸之后3.56+1.025.16+1.03 2.36+0.68 ＞19.5+0.34**
结果表示为平均值(n＝8)±SEM。
通过偏差的重复分析(ANOVA)和Tukey氏保护实验，确定显著性。
**和其他所有组有显著性差异，p＜0.01。
在两批实验中，接受反义寡核苷酸的动物表现出使肺动态伸缩率降低50％所需的气雾剂化腺苷剂量大大增加。没有观察到错配的对照寡核苷酸对PC50值的影响。在接受反义或吸入对照寡核苷酸的动物中，没有观察到毒性。这些结果清楚地表明，在肺病中，肺具有作为反义寡核苷酸基治疗性干预的靶的异常潜能。它们还表明，在与人哮喘非常类似的模型系统中，下调腺苷A1受体，大大消除哮喘气道中由腺苷介导的支气管收缩。人哮喘的变态反应兔模型中，支气管超常反应是极好的反义干预终末点，这是因为参与该反应的组织位于气雾剂化寡核苷酸接触点的附近，且该模型精密地模仿一重要的人类疾病。实施例4：A1-腺苷受体反义寡核苷酸的特异性
在上述实施例3的交换实验结束时，定量分析所有兔的气道平滑肌的腺苷A1受体数。作为反义寡核苷酸的特异性的对照，本不应受影响的腺苷A2受体也被量化。从各兔中切下气道平滑肌组织，按照Kleinstein等的方法(Kleinstein，J.和Glossmann，H.，Naunyn-Schmiedeberg′s Arch.Pharmacol.305：191-200(1978))并加以少数修改来制备膜级分，该文献的相关部分由此以全文引入本文作参考。粗制的质膜制品保存在70℃直至测定。用Bradford的方法(M.Bradford，Anal.Biochem.72，240-254(1976)，该文献的相关部分由此以全文引入本文作参考)确定蛋白含量。冷冻的质膜在室温下解冻，并与0.2U/ml腺苷脱氨酶在37℃温育30分钟，以移去内源性腺苷。[3H]DPCPX(A1受体特异性的)或[3H]CGS-21680(A1受体特异性的)的结合，如上所述利用Ali等的方法(Ali，S.等，J.Pharmacol.Exp.Ther.268，Am.J.Physiol266，L271-277(1994)进行测量，该文献的相关部分由此以全文引入本文作参考)。与对照相比，在交换实验中用腺苷A1反义寡核苷酸处理的动物在A1受体数上减少约75％，正如利用A1-特异性拮抗剂DPCPX的特异性结合所测得的。腺苷A2受体数并没有改变，正如利用A2受体-特异性激动剂2-[对(2-羧乙基)-苯乙基氨基]-5′-(N-乙基羧酰氨基)腺苷(CGS-21680)的特异性结合所测得的。该结果列于下表5中。下面的结果说明反义寡核苷酸治疗气道疾病的效果。由于上述反义寡核苷酸消除对由腺苷介导的支气管收缩起作用的受体系统，因此从其中消除腺苷可能不十分必要。但是，优选在这些寡核苷酸中消除腺苷，以减少获得类似作用所需的剂量。靶向参与炎症的蛋白的mRNA的其他反义寡核苷酸如上所述。从其所含的核苷酸中消除腺苷，以防止其在降解过程中释放。
表5：腺苷A1受体反义寡核苷酸作用的特异性
错配对照 A1反义
寡核苷酸 寡核苷酸 A1-特异性结合 1105+48** 293+18 A2-特异性结合 302+22 442+171
结果表示为平均值(n＝8)±SEM。
通过偏差的重复分析(ANOVA)和Tukey氏保护实验，确定显著性。
**和错配对照有显著性差异，p＜0.01。
实施例5：指向其他靶核酸的反义寡核苷酸
进行本工作是为了证明本发明广泛适用于对核酸靶广泛特异的反义寡核苷酸(“寡核苷酸”)。进行以下实验研究是为了显示本发明的方法广泛适用于如本申请所述和所设计的反义寡核苷酸一起使用，并靶向任何腺苷受体mRNA。出于此目的，针对腺苷受体mRNA如腺苷A1、A2b和A3受体mRNA制备了多种反义寡核苷酸。反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)如上所述。其他的5种反义硫代磷酸寡核苷酸如上述设计并合成。
1-寡核苷酸II(SEQ ID NO：7)也靶向腺苷A1受体，但和寡核苷酸I靶向不同的区域。
2-寡核苷酸V(SEQ ID NO：10)靶向腺苷A2b受体。
3-寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和IV(SEQ ID NO：9)靶向腺苷A3受体的不同区域。
4-寡核苷酸I-PD(SEQ ID NO：11)(具有和寡核苷酸I相同的序列的磷酸二酯寡核苷酸)。
这些反义寡核苷酸被设计用于治疗选定的物种，并对该物种普遍特异，除非其他物种的靶mRNA的节段碰巧含有相似的序列。如下所述制备所有反义寡核苷酸，并在兔模型中体内测定其对支气管收缩、炎症和变态反应的效果，其造成呼吸困难且肺气道受阻，作为哮喘等病例，正如上述申请中所述。实施例6：其他反义寡核苷酸的设计和序列
研究了6种寡核苷酸及其在兔模型的作用，这些研究的结果如下报告并讨论。选择这些寡核苷酸中的5种用于本研究，以补充上述实施例1至4中提供的寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的数据。该寡核苷酸对腺苷A1受体mRNA的一个区域是反义的。所测的寡核苷酸被命名为靶向腺苷A1受体mRNA不同区域的反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)和II(SEQ ID NO：7)，靶向腺苷A2b受体的mRNA的寡核苷酸V(SEQ IDNO：8)，和靶向腺苷A3受体mRNA的两个不同区域的反义寡核苷酸III和IV(SEQ ID NO：9和10)。第6种寡核苷酸(寡核苷酸I-PD)是寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的磷酸二酯形式。按照上述实施例1，进行这些反义寡核苷酸的设计和合成。
(I)反义寡核苷酸I
上述实施例1至4所述的反义寡核苷酸I靶向人A1腺苷受体mRNA(EPI 2010)。反义寡核苷酸I长21个核苷酸，与起始密码子重叠，并具有以下序列：5′-GAT GGA GGG CGG CAT GGC GGG-3′(：SEQID NO：1)。寡核苷酸I先前显示出抑制变态反应兔中由腺苷诱发的支气管收缩，并降低由变态反应原诱发的气道阻塞和支气管超常反应(BHR)，正如上述和由Nyce，J.W.& Metzger，W.J.，Nature，385：721(1977)所述，该文献的相关部分以全文引入本文作参考。
(II)反义寡核苷酸II
按照本发明设计一硫代磷酸反义寡核苷酸(SEQ ID NO：7)，其靶向兔腺苷A1受体mRNA区：+936至+956，相对于起始密码子(起点)。反义寡核苷酸II长21个核苷酸，并具有以下序列：5′-CTC GTC GCCGTC GCC GGC GGG-3′(SEQ ID NO：7)。
(III)反义寡核苷酸III
按照本发明设计一不同于上述实施例1中所提供的(SEQ ID NO：8)的硫代磷酸反义寡核苷酸，其靶向反义A3受体mRNA区：+3至+22，相对于起始密码子起点。反义寡核苷酸III长20个核苷酸，并具有以下序列：5′-GGG TGG TGC TAT TGT CGG GC-3′(SEQ ID NO：8)。
(IV)反义寡核苷酸IV
按照本发明设计另一硫代磷酸反义寡核苷酸(SEQ ID NO：9)，其靶向腺苷A3受体mRNA区：+386至+401，相对于起始密码子(起点)。反义寡核苷酸IV长15个核苷酸，并具有如下序列：5′-GGC CCA GGGCCA GCC-3′(SEQ ID NO：9)。
(V)反义寡核苷酸V
按照本发明设计一硫代磷酸反义寡核苷酸(SEQ ID NO：10)，其靶向腺苷A2b受体mRNA区：-21至-1，相对于起始密码子(起点)。反义寡核苷酸V长21个核苷酸，并具有如下序列：5′-GGC CGG GCCAGC CGG GCC CGG-3′(SEQ ID NO：10)。
(VI)A1错配寡核苷酸
两种具有如下序列的不同的错配寡核苷酸用作上面实施例5所述的反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的对照：A1 MM2 5′-GTA GGT GGCGGG CAA GGC GGG-3′(SEQ ID NO：12)和A1 MM3 5′-GAT GGA GGCGGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO：13)。反义寡核苷酸I和两种错配反义寡核苷酸具有相同的碱基组成和通用的序列结构。在GENBANK(释放85.0)和EMBL(释放40.0)中进行同源性搜索，结果表明反义寡核苷酸I不仅对人腺苷A1受体基因特异，而且对兔腺苷A1受体基因也特异，错配的对照不是用于和任何已知人类或动物基因序列杂交的候选物。
(VII)反义寡核苷酸A1-PD(寡核苷酸VI)
如上述申请所公开的，设计和寡核苷酸I具有相同序列的磷酸二酯反义寡核苷酸(寡核苷酸VI；SEQ ID NO：11)。反义寡核苷酸I-PD长21个核苷酸，与起始密码子重叠，并具有如下序列：5′-GAT GGAGGG CGG CAT GGC GGG-3′(SEQ ID NO：11)。
(VIII)对照
按照与给予(II)、(III)和(IV)中的反义寡核苷酸相同的方案，向各兔给予5.0mL气雾剂化无菌盐水。以上是作为G蛋白偶联受体的例子给出。但是，减少腺苷含量的方法普遍适用于任何基因和任何靶确认系统，其中生物活性腺苷的释放可使用于真实体现腺苷受体的实验数据变得不清楚。实施例7：反义寡核苷酸的合成
利用Applied Biosystems 396型寡核苷酸合成仪，合成具有上面(a)中所述的序列的硫代磷酸反义寡核苷酸，并利用NENSORB层析(DuPont，DE)进行纯化。在合成过程中，将TETD(二硫化四乙基秋兰姆)用作硫化剂。用该方法，分别合成并纯化反义寡核苷酸II(SEQ IDNO：7)、反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和反义寡核苷酸IV(SEQ IDNO：9)。实施例8：制备变态反应兔
如前所述(Metzger，W.J.，in Late Phase Allergic Reactions，Dorsch，W.，Ed.，CRC Handbook，pp.347-362，CRC Press，BocaRaton(1990)；Ali，S.，Metzger，W.J.和Mustafa，S.J.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.149：908(1994))，在出生24小时内，用混有10％高岭土的0.5mL 312抗原单位/ml的屋尘螨(D.farinae)提取物(BerkeleyBiologicals，Berkeley，CA)对无巴斯德菌的新生新西兰白兔进行腹膜内免疫，所述文献的相关部分由此以全文引入本文作参考。在第一个月，每周重复免疫一次，然后隔周免疫一次直至4个月大。这些兔择优地产生变态反应原特异性IgE抗体，其一般对气源性变态反应原产生应答，对抗早期和晚期哮喘反应，并显示出支气管超常反应(BHR)。每月经腹膜内给予变态反应原(312单位尘螨变态反应原，如上所述)，这持续刺激并维持变态反应原特异性IgE抗体和BHR。如Ali等所述(Ali，S.，Metzger，W.J.和Mustafa，S.J.，Am.J.Resp.Crit.Care Med.149(1994))，制备4个月大的致敏兔用于气雾剂给药，所述文献的相关部分以全文引入本文作参考。剂量-反应研究实施例9：实验安排
用超声雾化器(646型，DeVilbiss，Somerset，PA)，各自制备腺苷(0-20mg/ml)或者反义或两种错配寡核苷酸之一(5mg/ml)的气雾剂，产生的气雾剂液滴中80％的直径小于5μm。经气管内导管直接向肺给予等量的气雾剂。随机选择动物，并给予气雾剂化腺苷。计算处理前1天对腺苷的敏感性的值，作为引起伸缩率降低50％的腺苷剂量(PC50腺苷)。然后，经气管内导管向动物给予气雾剂化的反义或错配反义寡核苷酸之一(5mg/1.0ml)2分钟，每天两次，共2天(总剂量，20mg)。在第3天的早晨，记录处理后PC50值(处理后攻击)。在下面的实施例21中提供了这些研究的结果.实施例10：交换实验
对于利用反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)和相应的错配对照寡核苷酸A1MM2的一些实验，在间隔2周后，动物交换给药，向先前给予错配对照A1MM2的动物现在给予反义寡核苷酸I，向那些先前给予反义寡核苷酸I的动物现在给予错配对照A1MM2寡核苷酸。每组的动物数如下。对于错配A1MM2(对照1)，n＝7，因为在第2批对照实验中因技术难点而失去1只动物；对于错配A1MM3，n＝4(对照2)；对于A1AS反义寡核苷酸I，n＝8。单独分析用A1MM3寡核苷酸处理的动物，不作为交换实验的一部分。处理的方法和交换后应用的测量法与在第一批实验中应用的那些相同。在腺苷剂量至多达腺苷溶解度极限20mg/ml下，在8只用反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)处理的动物中有6只不能得到PC50值。因此，出于计算的目的，将这些动物的PC50值假设为20mg/ml。因此，给出的值代表了本发明反义寡核苷酸效果的最小值。按照上述方案，以所述方式向其他组的变态反应兔(每组n＝4)给予0.5或0.05mg剂量的反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)或A1MM2寡核苷酸(总剂量为2.0或0.2mg)。在下面的实施例22中提供了这些研究的结果。实施例11：反义寡核苷酸的配制
每一种反义寡核苷酸分别溶解在含水溶液中，并如在上面(e)中针对反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的描述，利用雾化器经气管内导管给药，共4等份，每份5mg(总剂量20mg)，如上所述。针对反义寡核苷酸I和其错配对照的结果证实，错配对照等同于盐水，如下面的实施例19和Nyce & Metzger，Nature 385，721-725(1997)的表1中所示，所述文献的内容引入本文作参考。基于该发现，将盐水作为对照用于应用反义寡核苷酸II、III和IV(SEQ ID NO：7、8和9)的肺功能研究。实施例12：寡核苷酸I对腺苷A1受体的特异性(受体结合研究)
如上所述，从在48小时内分开4次给予20mg寡核苷酸I(SEQ IDNO：1)的兔中切下来自气道平滑肌的组织，直至一级、二级和三级支气管。按照Ali等的方法(Ali，S.，等，Am.J.Resp.Crit.Care Med.149：908(1994)，有关膜级分制备的的章节以其全文引入本文作参考)制备膜级分。利用Bradford的方法确定蛋白含量，质膜与0.2U/ml腺苷脱氨酶在37℃温育30分钟，以除去内源性腺苷。参见Bradford，M.M.Anal.Biochem.72，240-254(1976)，其相关部分由此以全文引入本文作参考。如Jarvis等所述，测量[3H]DPCPX、[3H]NPC17731或[3H]CGS-21680的结合。参见Jarvis，M.F.等，Pharmacol.Exptl.Ther.251，888-893(1989)，其相关部分以全文引入本文作参考。将相似量的靶向缓激肽受体的寡核苷酸5′-GGTGATGTTGAGCATTTCGGC-3′(SEQ ID NO：14)给予另一组动物。该研究的结果示于表6，并在下面的实施例20中进行讨论。实施例13：肺功能测量(伸缩率cDYN和阻力)
经肌肉内给予氯胺酮盐酸盐(35mg/kg)和乙酰丙嗪马来酸盐(1.5mg/kg)的1.5mL混合物，使4个月大的已免疫的兔麻醉和松弛。在诱发麻醉后，将变态反应兔以舒服的仰姿放置在软性模塑动物板上。将药膏施加到眼部以防止干燥，将它们合拢。然后，如上Zavala和Rhodes所述，将4.0mm的中等-低封套的Murphy 1气管内导管(Mallinckrodt，Glen Falls，NY)插入动物。参见Zavala和Rhodes，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.144：509-512(1973)，其相关部分以全文引入本文作参考。将连有厚壁乳胶球的OD 2.4mm的聚乙烯导管(BectonDickinson，Clay Adams，Parsippany NJ)插入到食道中，并在整个实验过程中和嘴部维持相同的距离(大约16cm)。将气管内导管与启动的Fleisch呼吸速度描记器(尺寸00；DEM Medical，Richmond，VA)相连，利用由Gould载波放大器(11-4113型，Gould Electronics，Cleveland，OH)驱动的Validyne压差传感器(DP-45-16-1927型，ValidyneEngineering，Northridge，CA)测量气流量(v)。将食道球连接到压差传感器的一侧，并将气管内导管的流出口连接到另一侧，以获得肺与肺内腔之间的压差(Ptp)。综合气流量，得到连续的定时涨落的体积，并在等容和零气流点测量总肺阻力(Rt)和动态伸缩率(Cdyn)。用8通道Gould2000W高频记录仪记录气流量、体积和压力，利用总体积和零气流点的Ptp差别计算Cdyn，将Ptp和涨落中期的肺体积V的比值算作Rt。如上Giles等所述，用Buxco自动肺部力学呼吸分析仪(6型，BuxcoElectronics，Sharon，CT)自动进行这些计算。参见Giles等，Arch.Int.Pharmacodyn.Ther.194：213-232(1971)，其描述这些计算的相关部分以全文引入本文作参考。向兔给予寡核苷酸II的结果在下面的实施例26中给出并进行讨论。实施例14：测量支气管超常反应(BHR)
利用气雾剂向各变态反应兔给予组胺，以确定其超常反应的基线。利用DeVilbiss雾化器(DeVilbiss，Somerset，PA)产生盐水或组胺的气雾剂30秒，然后在各使用剂量下维持2分钟。超声雾化器产生气雾剂液滴，其中80％的直径＜5微米。以递增的浓度给予组胺气雾剂(0.156至80mg/ml)，在给予各剂量后测量肺功能。然后，通过计算将Cdyn从基线降低50％所需的组胺浓度(mg/ml)(PC50组胺)，确定BHR。实施例15：反义寡核苷酸I的心血管作用
利用热稀释原理，使用CardiomaxJ测量心脏输出和其他心血管参数，其中对静脉注射已知体积的冷盐水后流出心脏的血液的温度变化进行监测。经右颈静脉插管，将冷盐水一次快速注射到右心房中，利用温敏微型探测器经颈动脉插管记录主动脉弓中混合的注射液和血液的相应温度变化。在如上所述用寡核苷酸I(EPI 2010；SEQ ID NO：1)的气雾剂处理变态反应兔12小时后，用0.3ml/kg 80％氯胺酮和20％甲苯噻嗪将动物麻醉。该时间点与先前显示SEQ ID NO：1功效的数据一致，正如Nyce & Metzger(1997，同上)清楚地显示的那样，相关的公开文献以全文引入本文作参考。然后，将一热电偶插入到各兔的左颈动脉中，然后增加到6.5cm并用丝绸绷带固定。然后，进行右颈静脉插管，将一段聚乙烯导管插入并固定。然后，通过在20℃注射无菌盐水，用CardiomaxJ II(Columbus Instruments，Ohio)确定热稀释曲线，以确定热电偶探针位置的正确性。在确定热电偶探针位置的正确性之后，分离出股动脉和静脉。将股静脉用作药物注射的入口，将股动脉用于血压和心率的测量。一旦建立了恒定的基线心血管参数，就进行血压、心率、心脏输出、总外周阻力和心脏收缩性的CardiomaxJ测量。实施例16：寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)作用的持久性
如上面的(f)中所述，最初经气管内导管利用雾化器向8只变态反应兔给予递增批次剂量的腺苷，以0.156mg/ml开始直至伸缩率降低50％(PC50腺苷)，从而建立基线。然后，如上所述向其中的6只兔给予4次5mg剂量的气雾剂化的寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)。向2只兔给予等当量的盐水赋形剂作为对照。在最后处理的前18小时，再次测定PC50腺苷值。在该点之后，每天连续对所有动物进行测量，至多达10天。本研究的结果在下面的实施例25中讨论。实施例17：用反义寡核苷酸V还原腺苷A2b受体数
利用上述吸入室，在2天内向Sprague Dawley大鼠给予2.0mg可吸入的反义寡核苷酸V(SEQ ID NO：10)3次。在最后给药12小时后，切下肺实质组织，并如Nyce & Metzger(1997，同上)所述利用[311]-NECA测定腺苷A2b受体的结合。通过给予等量的盐水，进行对照。利用斯氏成对t检验，结果是在p＜0.05下具有显著性，该结果在下面的实施例28中进行讨论。实施例18：比较寡核苷酸I和相应的磷酸二酯寡核苷酸VI(SEQ IDNO：11)
寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)与腺苷的作用相反，它消除对腺苷的敏感性，所述腺苷至多达20mg腺苷/5.0ml(腺苷溶解度极限)。当以相同方法测定时，寡核苷酸VI(SEQ ID NO：11)即所述寡核苷酸序列的磷酸二酯形式是完全无效的。两种化合物具有相同的序列，不同之处仅为在寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)中存在硫代磷酸残基，它们如上面和Nyce & Metzger(1997，同上)所述作为气雾剂进行传递。在斯氏成对t检验中，在p＜0.001时具有显著性差异。结果在下面的实施例29中进行讨论。针对反义寡核苷酸I-(SEQ ID NO：1)获得的结果实施例19：在先工作的结果
在上面提供了特异性针对腺苷A1受体的反义寡核苷酸I(SEQ IDNO：1)的核苷酸序列和其他数据。在上面还提供了显示寡核苷酸I在下调受体数目和活性中的功效的实验数据。在Nyce，J.W.和Metzger，W.J.，Nature 385：721(1997)中提供了有关反义寡核苷酸I的特性和活性的其他信息，所述文献有关以下结果的部分以全文引入本文作参考。Nyce & Metzger(1997)出版物提供的数据显示反义寡核苷酸I(SEQID NO：1)：
(1)反义寡核苷酸I以剂量依赖方式减少变态反应兔的支气管腺苷平滑肌中的A1受体数，可参见下表6。
(2)反义寡核苷酸I削弱由腺苷诱发的支气管收缩和由变态反应原诱发的支气管收缩。
(3)寡核苷酸I削弱支气管超常反应，如用PC50组胺所测得的，其为评价支气管超常反应的标准测量法。该结果清楚地证明反义寡核苷酸I的抗炎活性，如表4、5和6中所示。
(4)正如所料，由于它被设计用于靶向目标，因此反义寡核苷酸I是对腺苷A1受体完全特异的，且在任何剂量下对紧密相关的腺苷A2受体或相关的缓激肽B2受体没有任何作用。参见下表6。
(5)与寡核苷酸I的上述作用不同，错配对照分子MM2和MM3(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)具有相同的碱基组成和分子量但分别因6和2个错配而不同于反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)。这些错配在仍保留相同碱基组成的情况下具有最小的可能性，它们对任何被靶向的受体(A1、A2或B2)绝对没有影响。
在完全没有有关反义寡核苷酸，例如靶向腺苷A1受体的寡核苷酸I应用的现有技术情况下，这些结果是未预料到的结果。在本专利中公开的结果清楚地赋予并证明应用药物并靶向基因或mRNA的有效方法在预期用途上的功效，所述基因或mRNA与和肺部功能如气道阻塞、支气管收缩、肺炎和变态反应等相关的一个功能或终末点相关联。实施例20：寡核苷酸I显著降低对腺苷的反应
在上面的实施例12中描述了受体结合实验，结果示于下表6中，该表显示了从经A1腺苷受体和B2缓激肽受体反义和错配处理变态反应兔的气道平滑肌中分离的膜中的腺苷A1选择性配体[3H]DPCPX和缓激肽B2选择性配体[3H]NPC 17731的结合特性。
表6：三种反义寡核苷酸的结合特性处理1 A1受体 B2受体
Kd Bmax Kd Bmax腺苷A1 受体20mg 0.36±0.029nM 19±1.52fmoles* 0.39±0.031nM 14.8±0.99fmoles2mg 0.38±0.030nM 32±2.56fmoles* 0.41±0.028nM 15.5±1.08fmoles0.2mg 0.37±0.030nM 49±3.43fmoles 0.34±0.024nM 15.0±1.06fmolesA1MM1(对照)20mg 0.34±0.027nM 52.0±3.64fmoles 0.35±0.024nM 14.0±1.0fmoles2mg 0.37±0.033nM 51.8±3.88fmoles 0.38±0.028nM 14.6±1.02fmolesB2A(缓激肽受体)20mg 0.36±0.028nM 45.0±3.15fmoles 0.38±0.027nM 8.7±0.62fmoles*2mg 0.39±0.035nM 44.3±2.90fmoles 0.34±0.024nM 11.9±0.76fmoles**0.2mg 0.40±0.028nM 47.0±3.76fmoles 0.35±0.028nM 15.1±1.05fmolesB2MM(对照)20mg 0.39±0.031nM 42.0±2.94fmoles 0.41±0.029nM 14.0±0.98fmoles2mg 0.41±0.035nM 40.0±3.20fmoles 0.37±0.030nM 14.8±0.99fmoles0.2mg 0.37±0.029nM 43.0±3.14fmoles 0.36±0.025nM 15.1±1.35fmoles盐水 0.37±0.041 46.0±5.21 0.39±0.047nM 14.2±1.35fmoles对照
1是指在48小时内分4次给予的总寡核苷酸。如方法中所述，进行处理和分析。利用对偏差进行的重复测量分析(ANOVA)和Tukey氏保护t检验，确定显著性。对于所有组，n＝4-6。
*与错配对照-和盐水处理组有显著性差异，p＜0.001；
**与错配对照-和盐水处理组有显著性差异，p＜0.05。实施例21：寡核苷酸I剂量-反应作用
如下表7中所示，在所测的剂量范围内，反义寡核苷酸I(SEQ IDNO：1)被发现以剂量依赖性方式降低给予动物的腺苷的作用。
表7：针对反义寡核苷酸I的剂量-反应作用
总剂量 PC50腺苷
(mg) (mg腺苷)
反义寡核苷酸I
0.2 8.32″7.2
2.0 14.0″7.2
20 19.5″0.34
A1MM2寡核苷酸(对照)
0.2 2.51±0.46
2.0 3.13±0.71
20 3.25±0.34
上述结果用斯氏成对t检验进行研究，并被发现具有统计学差异，p＝0.05
寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)是对抗腺苷A1受体的一种寡核苷酸，它特异性地与腺苷A1受体作用，但不与腺苷A2受体作用。如上面的实施例9和Nyce & Metzger(1997，同上)所述(4次剂量，每次5mg，间隔8-12小时，经气管内导管经雾化器给药)，用反义寡核苷酸I(SEQID NO：1)或错配对照寡核苷酸(SEQ ID NO：12；A1MM2)处理兔，切下支气管平滑肌组织并如Nyce & Metzger(1997，同上)所述确定腺苷A1和腺苷A2受体的数目，进而得到以上结果。实施例22：寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对靶基因产物的特异性
寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对腺苷A1受体是特异性，而其错配对照则没有活性。图1显示从交换实验中得到的结果，所述交换实验述于上面的实施例10和Nyce & Metzger(1997，同上)中。两个错配对照(SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)对PC50腺苷值没有影响。相反，给予反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)则显示出PC50腺苷值增加7倍。结果清楚地说明，当与盐水对照进行比较时，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)降低对外源给药的腺苷的反应(削弱敏感性)。上表6中所示的结果清楚地说明，反义寡核苷酸I的作用是剂量依赖性的(参见表6的第3列)。寡核苷酸I还显示出对腺苷A1受体完全特异(参见表6的前3行)，没有对紧密相关的腺苷A2受体或缓激肽B2受体的任何活性(参见上表6第8-10行)。此外，表6所示的结果说明，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)以剂量依赖性方式降低对腺苷的敏感性，且它是以反义寡核苷酸依赖性方式来发挥此作用的，因为两个错配对照寡核苷酸(A1MM2：SEQID NO：12和A1MM3：SEQ ID NO：13)中无一显示出对PC50腺苷值有任何的影响或减少腺苷A1受体数。实施例23：对由气源性变态反应原诱发的支气管收缩和炎症的影响
在兔模型中，当与错配寡核苷酸进行比较时，寡核苷酸I(SEQ IDNO：1)显示出显著降低由组胺诱导的作用。在变态反应兔中评价反义寡核苷酸I(SEQ ID No：1)和错配寡核苷酸(A1MM2，SEQ ID NO：12和A1MM3，SEQ ID NO：12)对由变态反应原诱发的气道阻塞和支气管超常反应的作用。评价了反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对由变态反应原诱发的气道阻塞的作用。正如从标绘的曲线下的区域计算出的，当与错配的对照进行比较时，反义寡核苷酸I显著抑制由变态反应原诱发的气道阻塞(55％，p＜0.05；重复测量ANOVA和Tukey氏t检验)。错配寡核苷酸A1MM2(对照)对由变态反应原诱发的气道阻塞完全无效。如上确定了反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对由变态反应原诱发的BHR的作用。正如从PC50组胺值计算出的，当与错配的对照进行比较时，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)显著抑制变态反应兔中由变态反应原诱发的BHR(61％，p＜0.05；重复测量ANOVA，Tukey氏t检验)。观察到A1MM错配对照对由变态反应原诱发的BHR完全无效。结果表明，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对于防止由气源性变态反应原诱发的支气管收缩(屋尘螨)是有效的。此外，还发现反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)由尘螨诱发的支气管超常反应的强抑制剂，如其对组胺敏感性的影响所示，所述组胺敏感性表明反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的抗炎活性。结果表明，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO 1)对于防止由气源性变态反应原诱发的支气管收缩(屋尘螨)是有效的。此外，还发现反义寡核苷酸I(SEQ ID NO 1)是由尘螨诱发的支气管超常反应的强抑制剂，如其对组胺敏感性的影响所示，所述组胺敏感性表明反义寡核苷酸I(SEQID NO：1)的抗炎活性。实施例24：低A含量的反义寡核苷酸I没有有害的副作用
寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)显示出没有可能对受体有毒性的副作用。在给予2.0或20mg寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)后，没有观察到动脉血压、心脏输出、心搏量、心率、总外周阻力或心脏收缩性(dPdT)发生变化。此外，对用CardiomaxJ仪器(Columbus Instruments，Ohio)测量的心脏输出(CO)、心搏量(SV)、平均动脉压(MAP)、心率(HR)、总外周阻力(TPR)和收缩性(dPdT)结果进行评价。这些结果证明，寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)对关键的心血管参数没有有害的影响。更具体而言，该寡核苷酸不会引起低血压。此发现特别重要，因为其他硫代磷酸反义寡核苷酸在过去一直显示出在一些模型系统中诱发低血压。此外，腺苷A1受体在心脏内的窦房传导中起着重要的作用。因此，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)减少腺苷A1受体，预期可能导致随受体的下调出现有害的肺外活性。这并非如此。反义寡核苷酸I(SEQ IDNO：1)不产生任何有害的肺内作用，它使本发明反义寡核苷酸的低剂量给药不产生预料之外的、不希望的副作用。这证明，当寡核苷酸I(SEQID NO：1)直接给药到肺时，它不会以有效引起有害作用的量到达心脏。这与传统的腺苷受体拮抗剂如茶碱相反，传统的腺苷受体拮抗剂离开肺并可在肺引起有害的、甚至是威胁生命的作用。实施例25：寡核苷酸I的持久作用
寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)证明了一种持久作用，正如在腺苷攻击前给予寡核苷酸I的情况下获得的PC50和阻力值所证明的。当如上所述以4次等剂量、每次5mg经气管内导管利用雾化器给药时，针对腺苷反义寡核苷酸I的PC50，测量作用的持久性。在给药后第1-8天，该物质作用显著。当反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的作用消失时，向动物给予盐水气雾剂(对照)，再次测量所有动物的PC50腺苷值。经盐水处理的动物显示出基线PC50腺苷值(n＝6)。测量如上所述给予了20mg反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)的6只变态反应兔中作用的持久性(针对阻力)，也如上所述测量针对气道阻力的作用持久性。针对PC50腺苷(p＜0.05)和阻力(p＜0.05)计算出的作用持久性中值均为8.3天。这些结果表明，反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)具有极长的作用持久性，这是完全没有料到的。实施例26：无腺苷反义寡核苷酸II优于反义寡核苷酸I
反义寡核苷酸II靶向腺苷A1受体mRNA的不同区域，发现它具有高度的活性来对抗由腺苷A1介导的作用。实验测量了当如上所述将20mg反义寡核苷酸II或盐水(对照)给予两组变态反应兔时，反义寡核苷酸II(SEQ ID NO：7)给药对伸缩率和阻力值的影响。如上面实施例13中所述给予腺苷或盐水之后，测量伸缩率和阻力值。本发明反义寡核苷酸的作用以统计学显著的方式与对照相区别，对于伸缩率，利用成对t-检验时p＜0.05；对于阻力，p＜0.01。结果表明，靶向腺苷A1受体且不含腺苷的反义寡核苷酸II(SEQ ID NO：7)，在腺苷攻击的情况下有效地维持伸缩率并减小阻力。事实上，无腺苷的反义寡核苷酸II比低腺苷的反义寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)更强。因为它不含腺苷，所以它在降解过程中不释放出腺苷，因此它不促进对腺苷受体的激活。实施例27：反义寡核苷酸III和IV
事实上，在如上所述分别向变态反应兔给予20mg反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和IV(SEQ ID NO：9)的情况下，寡核苷酸III(SEQ IDNO：8)和IV(SEQ ID NO：9)通过其对减少炎症和存在的炎症细胞数的作用，显示出特异性地靶向腺苷A3受体。3小时后，通过计数在其支气管灌洗液中确定炎症细胞数，每次灌洗至少100个活细胞。在暴露于尘螨变态反应原后，评价反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和IV(SEQID NO：9)对支气管灌洗中的粒细胞和总细胞数的影响。结果表明，对于暴露于尘螨变态反应原后的哮喘性肺部，反义寡核苷酸IV(SEQ IDNO：9)和反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)是非常强的抗炎剂。正如本领域所公知的，粒细胞，特别是嗜曙红细胞，是哮喘的初级炎症细胞，并且，给予反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和IV(SEQ ID NO：9)，分别使其数目减少40％和66％。此外，反义寡核苷酸IV(SEQ ID NO：9)和III(SEQ ID NO：8)还分别使支气管灌洗液中的细胞总数减少40％和80％。这也是本发明抗腺苷A3物质抗炎活性的重要指征。已知炎症是支气管超常反应和哮喘中由变态反应原诱发的支气管收缩的原因。靶向腺苷A3受体的反义寡核苷酸III(SEQ ID NO：8)和IV(SEQ ID NO：9)，均代表一类重要的新抗炎药，它们可被设计用于特异性地靶向各种物种的肺部受体。实施例28：反义寡核苷酸V
靶向腺苷A2b腺苷受体mRNA的反义寡核苷酸V(SEQ ID NO：10)，显示出对于对抗由腺苷A2b介导的作用和对于将存在的腺苷A2b受体数减少到少于50％是高度有效的。实施例29：磷酸二酯残基被替换的寡核苷酸I-DS(SEQ ID NO：11)的出乎意料的优越性
分别如上所述将寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)和I-DS(SEQ ID NO：11)给予变态反应兔，然后用腺苷来攻击兔。在对抗腺苷的作用中，磷酸二酯寡核苷酸I-DS(SEQ ID NO：11)的有效性在统计学上显著较差，而寡核苷酸I(SEQ ID NO：1)显示出较高的有效性，并证明PC50腺苷为20mg。实施例30：含单核苷酸的腺苷具有腺苷受体活性
此实施例证明，反义寡核苷酸的体内降解产物例如核糖核苷单磷酸，例如dAMP，作用在腺苷受体上。当腺苷和腺苷单磷酸(dAMP)以至多达10mg/ml的不同剂量分别给予实验动物时，两个化合物在降低％伸缩率方面具有相似的作用，如图1所示。两种情况下的作用均随剂量的增加而加强，而盐水对照则没有任何作用。这些结果表明腺苷核苷以及腺苷自身与腺苷受体相互作用。实施例31：含腺苷核酸的分解产生腺苷受体活性
作为另一测试，将随机选择的硫代磷酸反义寡核苷酸核苷给予兔，以确定它们是否在体内降解并释放出能与腺苷受体相互作用的腺苷核苷。向哮喘兔分别给予盐水(对照)、含腺苷的随机物(κ)和脱腺苷的随机物(C)。所使用的随机物是一不含腺苷的随机物，其由鸟苷、胞苷和胸苷的随机序列组成，和一含腺苷的随机物，其由鸟苷、胞苷和腺苷组成。图2中所示的结果清楚地表明，含腺苷的寡核苷酸在降解时释放腺苷和/或腺苷核苷，腺苷化合物与腺苷受体相互作用，而不含腺苷的寡核苷酸则不。因此，当评价反义剔除实验对于靶确认的作用时，腺苷核苷作为反义寡核苷酸的降解产物释放，将混淆实验结果。该实验表明，在靶确认研究中使用不含腺苷的反义(无A或低A)寡核苷酸的必要性。
以上实施例是为了举例说明本发明，而不是作为其限制。本发明由所附权利要求所限定。