有关血管生成疾病的治疗组合 本发明涉及治疗有关主动血管生成疾病的方法、可用于有关血管生成疾病治疗的组合物和该组合物在药物制备中的用途，该药物用于有关主动血管生成疾病的治疗。在本发明的一个方面中，该方法涉及将一氧化氮抑制剂结合诱发血管损伤的化合物对哺乳动物给药。
通过血管生成作用形成新的脉管系统是若干疾病的关键病理特征(J Folkman《新英格兰医学杂志》(New England Journal ofMedicine)333，1757-1763，1995)。例如，实体瘤为了生长必须发展它自己的血液供给，这是氧和养分赖以供应的关键；如果这种血液供给被机械地切断，肿瘤将坏死。新血管形成也是牛皮癣中的皮肤损伤、类风湿性关节炎患者关节中的侵袭性血管翳和动脉粥样硬化斑的临床特征。视网膜的新血管形成是黄斑变性和糖尿病性视网膜病地病理。在所有这些疾病中，通过破坏新形成的血管内皮而逆转新血管形成预期具有有益的治疗作用。
某些化合物已经显示对新形成的实体瘤内皮具有血管损伤活性。这些试剂例如包括combretastatin A4磷酸酯(Dark等《癌症研究》(Cancer Research)57，1829-1834，1997)、combretastatin类似物(例如Ohsumi等在《医药化学杂志》(J Med Chem)41，3022-32，1998中所述的那些)、黄酮乙酸(例如5，6-二甲基呫吨酮乙酸(Zwi《病理学》(Pathology)26，161-9，1994))、秋水仙碱(Baguley等《欧洲癌症杂志》(Eur J Cancer)27，482-7，1991)。不过，有些肿瘤对这些试剂具有抗药性。
对血管损伤剂具有相对抗药性的肿瘤的一个特征是它们产生大量一氧化氮的能力。一氧化氮在肿瘤生长中的作用是不清楚的，已有报道说既有肿瘤刺激作用，也有肿瘤抑制作用(Chinje和Stratford《生物化学测定》(Essays Biochem.)32，61-72，1997)。有人提出5，6-二甲基呫吨酮乙酸的抗肿瘤作用在部分程度上是由一氧化氮的产生所介导的(Thompsen等《癌症化疗药理学》(Cancer Chemother Pharmacol.)31，151-5，1992)。
我们已经发现，通过与一氧化氮在哺乳动物系统内的形成或作用抑制剂治疗结合，能够提高血管损伤剂的功效。
确切地说，通过与一氧化氮合成酶抑制剂结合，能够提高血管损伤剂的功效，这种酶从精氨酸中产生一氧化氮。确切地说，通过用一氧化氮合成酶抑制剂治疗，提高血管损伤剂对抗相对耐受其作用的肿瘤的功效。
因此在本发明的一个方面，我们提供患有有关主动血管生成的疾病的哺乳动物治疗方法，该方法包括治疗量或亚治疗量的血管损伤剂以及足以增加血管损伤剂作用的量的一氧化氮合成酶抑制剂的联合给药。该方法可用于癌症(尤其是实体瘤)、牛皮癣、糖尿病性肾病、黄斑变性、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎等疾病的治疗。
血管损伤剂和一氧化氮合成酶抑制剂既可以一起给药，也可以单独给药。该方法既可以用作单一疗法，也可以与其他治疗结合。关于实体瘤的治疗，本发明化合物既可以与放射疗法结合给药，也可以与其他抗肿瘤物质结合给药，例如选自有丝分裂抑制剂，例如长春花碱、紫杉醇和docetaxel；烷化剂，例如顺铂、卡铂和环磷酰胺；抗代谢物，例如5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷和羟基脲；嵌入剂，例如阿霉素和博莱霉素；酶，例如门冬酰胺酶；拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷、托泊替康和伊立替康；胸苷酸合成酶抑制剂，例如raltitrexed；生物反应改性剂，例如干扰素；抗体，例如edrecolomab；和抗激素，例如他莫昔芬。这样的联合治疗可以涉及各治疗组分的同时或先后用药。
血管损伤剂和一氧化氮合成酶抑制剂既可以通过相同的途径、也可以通过不同的途径给药。这样的给药途径包括经口、颊、鼻、局部、直肠和肠胃外给药。该方法的每种组分、即血管损伤剂和一氧化氮合成酶抑制剂可以独立地以适合于预期给药途径的剂型给药，这样的剂型可以利用常规赋形剂、按常规方式加以制备。例如关于口服给药，药物组合物可以采取片剂或胶囊剂的形式。关于鼻给药或通过吸入给药，化合物可以适宜地分散为粉末或者分散在溶液中。局部给药可以是软膏剂或霜剂，直肠给药可以是栓剂。关于肠胃外注射(包括静脉内、皮下、肌内、血管内或输注)，组合物例如可以采取无菌的溶液、悬液或乳剂的形式。每种组分的优选给药途径将取决于所治疗的疾病。关于实体瘤，各组分可以有利地一起或单独分散为静脉内输液。
血管损伤剂是诱发新生成的、而不是既定的脉管系统选择性损伤的化合物。很多这样的化合物是已知的，可以认为本发明普遍适用于这样的试剂。 这样的试剂包括微管蛋白结合剂，例如combretastatin及其药物前体、colchinol及其药物前体和(Z)-2-甲氧基-5-[2-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯胺及其药物前体；TNF-α诱导剂，例如呫吨酮乙酸，例如二甲基呫吨酮乙酸；和定向于脉管系统的抗体。
可以采用各种抑制一氧化氮在哺乳动物系统内的形成或作用的化合物。具体来说，一氧化氮合成酶抑制剂是那些抑制任意形式一氧化氮合成酶的化合物。这样的试剂包括精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸与瓜氨酸的衍生物、S-烷基硫脲和氨基胍类。若一氧化氮合成酶抑制剂是精氨酸的衍生物，它例如可以是NG-取代的L-精氨酸，选自NG-硝基-L-精氨酸及其烷基酯、NG-甲基-L-精氨酸和NG-氨基-L-精氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是鸟氨酸的衍生物，它例如可以是L-N6-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是赖氨酸的衍生物，它例如可以是L-N6-(1-亚氨基乙基)赖氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是瓜氨酸的衍生物，它例如可以是L-硫代瓜氨酸、L-高硫代瓜氨酸或S-烷基硫代瓜氨酸，例如S-甲基-L-硫代瓜氨酸。
本发明在进一步的实施方式中提供用于有关主动血管生成的疾病治疗的组合物。本发明的组合物包含血管损伤剂与一氧化氮合成酶抑制剂的组合，其中血管损伤剂和一氧化氮合成酶抑制剂都是如上文所定义的。
因此，组合物例如可以含有combretastatin衍生物、秋水仙碱衍生物、colchinol衍生物、呫吨酮乙酸衍生物或定向血管的抗体与一氧化氮合成酶抑制剂的组合，后者例如精氨酸衍生物、鸟氨酸衍生物、赖氨酸衍生物、瓜氨酸衍生物、S-烷基硫脲或氨基胍。
可以存在于组合物中的血管损伤剂的特例包括combretastatinA4及其药物前体(例如combretastatin A4磷酸酯)、(Z)-2-甲氧基-5-[2-(3，4，5-三甲氧基苯基)乙烯基]苯胺及其药物前体、N-乙酰colchinol及其药物前体(例如N-乙酰colchinol-O-磷酸酯)和5，6-二甲基呫吨酮乙酸。
可以存在于组合物中的一氧化氮合成酶抑制剂的特例包括精氨酸、鸟氨酸、赖氨酸与瓜氨酸的衍生物、S-烷基硫脲类、氨基胍类和氨基吡啶类。若一氧化氮合成酶抑制剂是精氨酸的衍生物，它例如可以是NG-取代的L-精氨酸，选自NG-硝基-L-精氨酸及其烷基酯、NG-甲基-L-精氨酸和NG-氨基-L-精氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是鸟氨酸的衍生物，它例如可以是L-N6-(1-亚氨基乙基)鸟氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是赖氨酸的衍生物，它例如可以是L-N6-(1-亚氨基乙基)赖氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是瓜氨酸的衍生物，它例如可以是L-硫代瓜氨酸、L-高硫代瓜氨酸或S-烷基硫代瓜氨酸，例如S-甲基-L-硫代瓜氨酸。若一氧化氮合成酶抑制剂是氨基吡啶，它例如可以是2-氨基-4-甲基吡啶。
组合物可用于治疗有关主动血管生成的疾病，例如实体瘤、牛皮癣、糖尿病性肾病、黄斑变性、动脉粥样硬化和类风湿性关节炎。
每种组分的相对比例将根据各血管损伤剂或一氧化氮合成酶抑制剂的特性和所治疗的疾病加以确定。
组合物可以包括药学上可接受的赋形剂，根据预期给药途径和标准药学实践进行选择。组合物可以采取适合于经口、颊、鼻、局部、直肠或肠胃外给药的剂型，可以利用常规赋形剂、按常规方式加以制备。例如关于口服给药，药物组合物可以采取片剂或胶囊剂的形式。关于鼻给药或通过吸入给药，化合物可以适宜地分散为粉末或者分散在溶液中。局部给药可以是软膏剂或霜剂，直肠给药可以是栓剂。关于肠胃外注射(包括静脉内、皮下、肌内、血管内或输注)，组合物例如可以采取无菌的溶液、悬液或乳剂的形式。
特定疾病的预防或治疗所需本发明化合物的剂量将因各组分的特性、给药途径、剂型和疾病的严重性以及化合物是单独给药还是与另一种药物结合给药而异。因此，精确剂量将由主治医师决定，将取决于组合物中特定的血管损伤剂和NO合成酶抑制剂。不过，所面对的血管损伤剂的剂量例如在10-1000mg/m2体表面积的范围内，优选为20-200mg/m2，一氧化氮抑制剂的剂量例如1-1000mg/m2，优选为5-500mg/m2。血管损伤剂例如作为无菌注射溶液的单位剂型例如通常含有40-400mg活性成分。一氧化氮合成酶抑制剂例如作为无菌注射溶液的单位剂型例如通常含有10-1000mg活性成分。含有血管损伤剂和一氧化氮合成酶抑制剂例如作为无菌注射溶液的单位剂型例如通常含有40-400mg血管损伤剂和10-1000mg一氧化氮合成酶抑制剂。
本发明组合物既可以作为单一疗法给药，也可以与其他治疗结合给药。关于实体瘤的治疗，本发明化合物既可以与放射疗法结合给药，也可以与其他抗肿瘤物质结合给药，例如选自有丝分裂抑制剂，例如长春花碱、紫杉醇和docetaxel；烷化剂，例如顺铂、卡铂和环磷酰胺；抗代谢物，例如5氟尿嘧啶、阿糖胞苷和羟基脲；嵌入剂，例如阿霉素和博莱霉素；酶，例如门冬酰胺酶；拓扑异构酶抑制剂，例如依托泊苷、托泊替康和伊立替康；胸苷酸合成酶抑制剂，例如raltitrexed；生物反应改性剂，例如干扰素；抗体，例如edrecolomab；和抗激素，例如他莫昔芬。这样的联合治疗可以涉及各治疗组分的同时或先后用药。
在本发明进一步的实施方式中，我们提供本发明组合物在药物制备中的用途，该药物用于有关主动血管生成的疾病的治疗。
现在将通过下列实施例对发明进行阐述，其中将生物测定用于阐述发明：
坏死的诱发
将携带CaNT或SaS肿瘤的小鼠用供试化合物处理，24小时后切除肿瘤，固定在福尔马林中，包埋在石蜡中，制作切片，用苏木精和曙红染色。基于坏死面积对切片评分如下：％坏死得分％坏死得分0-10151-60611-20261-70721-30371-80831-40481-90941-50591-10010
对照肿瘤的平均得分是2.0(CaNT)和1.0(SaS)。
实施例1
本测定中，可以比较给定剂量单独给药的血管损伤剂或一氧化氮合成酶抑制剂的作用与两种试剂的组合的作用。 表1：combretastatin A4磷酸酯(CA4P)与L-NG-硝基精氨酸(L-NNA)共同给药对SaS肿瘤的作用增强治疗坏死得分±SEM(n)无1.0±0(10)CA4P，500mg/kg1.7±0.7(3)L-NNA，10mg/kg2.0±1(3)CA4P，500mg/kg+L-NNA，10mg/kg9.0±0(3)
实施例2
表2：combretastatin A4磷酸酯(CA4P)与2-氨基-4-甲基吡啶(AMP)共同给药对SaS肿瘤的作用增强治疗坏死得分±SEM(n)无1.0±0(10)CA4P，500mg/kg1.7±0.7(3)AMP，10mg/kg1.0(2)CA4P，500mg/kg+AMP，10mg/kg4.5(2)
实施例3
用荧光染料测量的对抗肿瘤脉管系统的活性
下列实验进一步证明化合物破坏肿瘤脉管系统的能力。
按照Smith等人的方法，利用荧光染料Hoechst33342测量携带CaNT肿瘤的小鼠中的肿瘤功能性血管体积(《英国癌症杂志》(Brit J Cancer)57，247-253，1988)。将荧光染料溶解在盐水中，浓度为6.25mg/ml，腹膜内药物处理后24小时按10mg/kg进行静脉内注射。一分钟后，杀死动物，切除肿瘤，冷冻；在3种不同的水平下切成10μm切片，利用装配有表荧光(epifluorescence)的0lympus显微镜在UV照明下观察。通过荧光轮廓鉴别出血管，利用基于Chalkley所述的点评分系统量化血管体积(《国家癌症研究院杂志》(J Natl Cancer Inst)4，47-53，1943)。所有估计结果都是在计数在3种不同水平下切制的切片的最少100个视野的基础上作出的。
表3：combretastat in A4磷酸酯(CA4P)与L-NG-硝基精氨酸(L-NNA)共同给药对CaNT肿瘤的作用增强治疗血管体积％±SEM(n)无2.35CA4P，25mg/kg1.03±0.14(4)L-NNA，10mg/kg2.45±0.04(3)CA4P，25mg/kg+L-NNA，10mg/kg0.63±0.25(3)