本发明涉及农业上使用的一种生理活性剂。 本发明的第一个目的是提供一种农业上使用的、刺激或促进植物根部生长作用的高效生理活性剂。
本发明的再一个目的是提供一种农业上使用的、促进土壤中根瘤菌属豆科细菌和链霉菌属放线菌生长的高效生理活性剂。
本发明的另一个目的是提供一种农业上使用的、控制土壤中病原菌半知菌和假单胞菌属细菌优势的高效生理活性剂，它们引起病害。
本发明的还有一个最重要的目的是提供一种农业上使用的、促进根物根生长，有助于平衡土壤中微生物菌丛并长时期保证正常土壤环境的生理活性剂。
为了保证农产品高产率，生长中的作物有效地吸取主要营养并将它们自己保持在健康状态直至收获结束是必要的。为此最重要的是将土壤环境保持在最适的条件。
农业控制的发展导致大量使用各种农药和无机肥料。
过量使用农药引起对作物的化学损害，且扰乱土壤中的微生理菌丛，因此必然带来一些新的问题，如多种的植物疾病危害和几种类型的疾病同时出现。
另一方面，由于使用大量无机肥料，促进了土壤矿化作用。由于降低了田间抗病性和土壤肥力，常常出现地土壤中微生物数目减少所引起的病害和其它一些问题导致作物减少产量。
另外，由于土壤和植物中残留的农药引起的环境污染和由于对环境动物（包括对人类）的化学伤害，农药的使用已经是社会主要关注的问题。
为了避免这些问题，保证植物正常生长和农产品的高产率，必须对植物整个生长环境给予考虑，尤其是作物的根和相关的生物体群落。
既然在土壤根际环境中，生物相互作用的机理是清楚的，就要重视生长的植物和与其密切相关的生物体种群之间的相互作。
正常的根际环境指的是广泛的根系，其中微生物在数量上或种类上均很多。
创造这样一种根际，要求其中的植物的根生长正常，并且周围的微生理菌丛，对植物生长有用的微生物，相对说来其量较大。（例如，放线菌类和根瘤菌属的豆科细菌），而同时直接参与疾病危害的微生物（例如，假单胞菌属的细菌和镰刀菌的病原菌半知菌和其它属的细菌）以相对较小的量存在。这样一种很好地平衡了根际条件实现了农产品的高产率，同时阻止了病害出现。
因而，根际环境的重要的必要条件是（1）促进根（植物）的生长;（2）增殖对生长的植物（土壤）有用的根瘤菌属的豆科细菌和链霉菌属的放线菌类;和（3）阻止引起病害出现的假单胞菌属和病原菌半知菌细菌的生长优势。
涉及上面三个要求的每一个问题详述如下。
（1）植物根部生长的促进作用
植物生长激素、九二0、细胞激动素和brassinolide是已知的植物生长调节剂。然而这些化合物存在下面的问题：（ⅰ）费用高，（ⅱ）制造困难和（ⅲ）根据施用时间和植物类型，其功效显著地不同。（2）有用微生物的增殖作用
众所周知，根瘤菌属的豆科细菌（下文缩写为豆科细菌）侵袭豆科的根部生成根瘤菌（共生现象），因此提供了植物生长激素和氮源，同时已知，生成的根瘤量和体积越大，则作物的产量越高。
一般地认为豆科细菌和豆科之间的共生现象建立在细菌和根毛细胞间的某些判别机理的基础上。例如“细胞分子生物学（Molecular Biology of the cell“（Bruce Alberts等著，由Kyoiku-sha 1985年11月15日出版）提出豆科的根毛辨别豆科细菌细胞壁表面的某些糖化物物，由此诱发它们之间的一种特定结合，建立了共生现象。这本书也描述：豆科细菌一旦与根毛共生便失掉大多数的细胞壁，形成巨大的有枝的棒状物，称为假菌体。
在此发现的基础上，为了作物有较高产率，在施肥和使用生长调节剂时通常在土壤中散布豆科细菌。然而确切地说，豆科细菌在土壤中数量的增加不总是引起在植物根部增加细菌的数目，它几乎没有获得予期的效果。链霉菌属的放线菌约包括800个种（所有放线菌最多者），并且在土壤中占全部放线菌90%以上。已知在土壤中这种微生物在防治病害机理上发挥了重要的作用。为了利用这些有用的微生物，已经做了种种的尝试（例如，直接施用到土壤中），但是由于在土壤中的低集群率，至今没有得到有价值的效果。
在一定环境下，如果可用一种促进链霉菌属放线菌有效集群作用的物质，则在农业减少病害上具有很大的价值。
（3）控制有害的细菌
当在出现作物病害时，病原菌半知菌和假单孢菌的菌株支配微生物的菌丛，表明了这些细菌主要引起危害。
已用各种农药防治这些细菌并且试图培育抗病的品种以减轻这样的危害，但这些方法至今没有取得有价值的效果。
如上所述，作物生长环境包含种种重要的因素。考虑到所有上述这些问题，有关农业上使用的生理活性物质的深入研究使我们发现：通过使用特定的N-酰基内酰胺和2-哌啶酮的生理活性剂能够解决上面指出的诸问题，这样的生理活性剂在促进植物根生长和控制病害上是非常有效的。
现已发现，这种活性剂与豆科细菌或链霉菌属结合使用对于这些有用微生物在土壤中的集群作用具有很高的功效。本发明的完成是基于这些发现的。
简要地说，本发明涉及一种农业上使用的生理活性剂，作为有效成份，活性剂是一种通式如下的N-酰基内酰胺化合物和2-哌啶酮的混合物
（其中n是1或2）。本发明也涉及一种农业上使用的包括N-酰基内酰胺化合物、2-哌啶酮和豆科细菌的生理活性剂。本发明还涉及一种农业上使用的包括N-酰基内酰胺化合物、2-哌啶酮和链霉菌属放线菌生理活性剂。
通式表示的本发明N-酰基内酰胺化合物
（其中n是1或2）可由例如通过日本专利公开№ 246105（1986）披露的，如（1）内酰胺与一种酸酐反应，和（2）内酰胺与一种酰卤反应制备。
N-酰基内酰胺和2-哌啶酮可以粉末状形式混合在一起，或者在一种适宜的溶剂里溶解这两种化合物，混合得到的两种溶液、并且从混合溶液中蒸出溶剂，得到完全的混合物。
使用的溶剂类型没有特定的限制，为此目的，能够溶解两种化合物的任意溶剂都能使用。但是一般地使用甲醇、乙醇、丙酮和乙酸乙酯。当为了制造N-酰基内酰胺采取催化还原时，在反应器内可予先加2-哌啶酮。
2-哌啶酮与N-酰基内酰胺化合物混合的最好摩尔比是0.1到10。如果摩尔比小于0.1，使用2-哌啶酮不能有予期的效果，当两者混合比例超过10时则得不到较高的效果，并且在成本价格上不利。
在均一性上，最好以溶液的形式应用本发明的生理活性剂，但也可以与一种适宜的载体以混合物形式使用，如滑石、环糊精、糊精、蛭石、硅藻土和硅粉。
活性剂的适宜量可以随植物类型、土壤环境和予期的目的变化。一般地说来，土壤施用，约1L/m2量的0.1到10mg/L浓度的水溶液。对于叶面施用为1到10吨/10英亩量使用0.01到0.1mg/L浓度的水溶液。
本发明的生长活性剂最好在菌期施用（例如，种植前的盆裁阶段时，或在种植后两周内），但也可在任何时间施用。
另外，播种前的土壤可以予先施用本发明的生理活性剂，或者生理活性剂在水裁法中可加到水槽中，加到使用的营养物或肥料中。
一种N-酰基内酰胺化合物、2-哌啶酮和根瘤菌属的豆科细菌的生理活性剂详述如下。
作为在本发明中使用的根瘤菌属豆科细菌可以例举出的有大豆根瘤细菌、豌豆根瘤细菌和三叶草根瘤细菌。
此种豆科细菌与N-酰基内酰胺化合物和2-哌啶酮结合使用在豆科的培养中特别有效。
用通常方法培养的任何豆科细菌可用于本发明的目的。
以培养液的形式可以施用这些豆科细菌，如离心分离后的颗粒，或如同上面指出的与适宜载体（如滑石）的混合物。
如果在每株植物根部周围施用，含有一种豆科细菌的本发明生理活性剂最有效。
适宜的使用量随植物类型、土壤环境和其它因素改变。当以溶液形式使用时，最好是以1L/m2的量施用106细胞/ml浓度的溶液。
2-哌啶酮对N-酰基内酰胺化合物的混合比最好是上面指出的范围。
活性剂最好用到幼苗上。
N-酰基内酰胺化合物、2-哌啶酮和链霉菌属的放线菌生理活性剂如下所述。
用与N-酰基内酰胺化合物和2-哌啶酮结合的链霉菌属的放线菌的本发明的生理活性剂，在促进土壤中放线菌的集群上特别有效。
作为在本发明中使用的链霉菌属的放线菌，在此可例举橄榄色链霉菌、暗色产色链霉菌和浅灰链霉菌。
通常方法培养的链霉菌属放线菌可用于本发明的目的。
使用的形式和适宜的量与含有上面描述豆科细菌的活性剂相同。
可以采用土壤施用和叶面施用，并且在施用时间上没有特别的限定。
本发明的生理活性剂表明了下述突出的效果：（1）促进了植物根的生长;（2）在土壤中繁殖根瘤菌属的豆科细菌和链霉菌属的放线菌，这两种细菌是植物生长有用的微生物;和（3）抑制在土壤中假单孢菌属和病原真菌半知菌的细菌，这些细菌是产生病害的微生物。
因此，使用本发明的生理活性剂保证了作物的正常生长，特别是导致豆科的高产率。
此外，含有豆科细菌或链霉菌属的放线菌有利于土壤中上述有用微生物的集群（用常规的方法不能期望得到这个结果），结果显著地增加了作物产量（用豆科细菌），并且防止和减缓了植物疾病（用链霉菌属的放线菌）。
通过本发明的生理活性剂得到的这样突出的效果原因不完全清楚楚。但是可以假定N-酰基内酰胺化合物和2-哌啶酮使土壤中的这些有用微生物活化，因此促进了这些微生物的集群。
这些效果是对土壤微生物有利的作用的结果并且是对彼此紧密有关的植物根的生长的有利作用的结果。在这方面，本发明的生理活性剂不同于一般的植物生长调节剂和农药。
此外，本发明的活性剂在保证安全上也是优良的，没有环境污染问题，并且对植物和动物没有有害的影响。为了证明这点，进行了试验以测量在本发明的有效剂中组分的生理化学性质。N-酰基内酰胺化合物水解表明：35℃时半寿期在pH9.0时是30分钟，pH7.0时是8小时，并且在pH4.0是18小时。同时表明水解物是2-哌啶酮和对-羟基苯基丙酸（一种已知的酪氨酸代谢物，在人血和尿中发现该物）。2-哌啶酮经水解生成5-氨基戊酸（肠肝菌经代谢作用产生的一种氨基酸）是已知。
以下诸实施例阐明本发明但不是限制本发明，其中（1）除非另有所指，否则%表示重量%;（2）本发明生理活性剂的摩尔比是2-哌啶酮对N-酰基内酰胺化合物之比;（3）使用的N-酰基内酰胺化合物如下面在表1中所示，缩写为№1和№2;（4）当仅用作对比例时，1号化合物、2号化合物和2-哌啶酮的量与本发明的活性剂相同。
表1化合物号N－酰基内酰胺化合物11－［2－（4－羟基苯基）乙酰基］－2－哌啶酮21－［2－（3－羟基苯基）丙酰基］－2－哌啶酮
本发明中使用的所有微生物都是已知微生物，它们可以在下面列举的贮存中心得到。
ATCC：美国菌种收藏中心，罗克维尔，美国
IFO：发酵研究所，大阪，日本
NCTC：国立标准菌种收藏所，伦敦，英国
NCIB：国立工业细菌收藏所，阿拉丁，英格兰
BUCSAV：捷克斯洛伐克科学院生物研究所，布拉格，捷克斯洛伐克社会主义共和国
CBS：真菌中心收藏所，巴尔温市，荷兰
RIA：苏联抗生素研究所，英斯科，苏联
下面诸实施例中表明的每种微生物将给出它的贮存号。
实施例1
本发明的生理活性剂（摩尔比：1）溶解在乙酸乙酯里，得到示于表2的一定浓度的溶液。
每种试验溶液（2ml）加到放在Petri培养皿上的一片滤纸上（70mmφ）。减压下蒸出溶剂，加2ml无菌水，播种芜菁种子（25粒）并且保持在25°的黑暗中。
为了对照，重复上述步骤，只是仅用乙酸乙酯。
48小时后测量长出的根的长度，由与对照数据的差别计算根生长率。计算结果总结在表2中。
（注）由上面等式计算根生长率
根生长率（%）＝
(（实验区平均测定值）-（对照区平均测定值）)/(（对照范围平均量度）) ×100
№1活性剂：№1化合物+2-哌啶酮
№2活性剂：№2化合物+2-哌啶酮
实施例2
在一个Petri培养皿中，放有2%琼脂培养基，裁种25颗发芽的稻种（“日本裸稻”）每颗的芽鞘向上，在25℃黑暗中生长两天，同时适当地人工降雨喷水。
用一个微型注射器，在生长幼苗的初始时间加表3所示浓度的50%的丙酮（1μl）试验溶液，并继续培养。
为了对照，重复上述的同样步骤，只是仅使用50%的丙酮。
表3中总结了获得的实验结果。
实施例3
将本发明的生理活性剂（摩尔比：1）分别溶解在锥形瓶内的乙酸乙酯中，在减压下蒸除溶剂，得到试验烧瓶。
将表4中的每种菌株接种到含2%芽提取物的50ml液体培养基中，在25℃静态培养4天。收集展开的菌丝体并分散在无菌水中，得到微生物试验溶液。
将表5中所示组成的培养基（每个50ml）分散在上面制备的试验烘瓶中（容量100ml，每个含5mg试样），每个烧瓶在一个超声波槽内处理以充分分散试样。接种上述得到的1ml微生物试液并在25℃继续静态培养10天。然后测量干燥的微生物细胞重量，并且计算微生物细胞重量改变率。为了对照，重复如同上面的同样步骤，只是仅使用乙酸乙酯。
实验结果小结于表6中。
表4
由表6所示结果，明显看出本发明的生理活性剂可显著地控制真菌的繁殖。
实施例4
在丙酮里溶解本发明的生理活性剂（摩尔比：0.2）浓度至10mg/l。将试验抗生素用的小片（8mmφ）浸泡在上述溶液中。蒸发除掉溶剂，得到试验片。
含有2%麦芽提取物的琼脂培养基放在一个Petri培养皿中，除去表面的水，把上面制备的试验片放在培养基上。以如同实施例3的同样方式接种由表4（4）号菌株制备的0.05ml微生物溶液。
于25℃连续静态培养10天，从第4天起测量表面的微生物生长面积，而后计算生长面积比率。
为了对照，重复上面的同样步骤，只是使用丙酮。
结果小结于表7中。
表7
由下面的等式计算微生物生长面积比率：
微生物生长面积比率＝ (试验区的生长面积（cm2))/(对照区的生长范围（cm2))
从表7表明的结果中显然可以看出本发明的生理活性剂不是杀菌剂;在最初阶段真菌进行繁殖，于第五天达到最大值，而后出现了逐渐衰变现象。
实施例5
在30℃使用表9中所示组成的斜面培养基培养在表8列举的每一种菌株。在斜面的表面上证实有生长细胞后，马上作为主培养在4℃下贮藏，以供试验。
在100ml的锥形瓶内放入本发明生理活性剂（摩尔比：0.5）的乙酸乙酯溶液（1000mg/l）0.5ml，蒸除溶剂，加50ml肉汤液体培养基。
上面制备的一接种圈的主培养物接种到10ml肉汤液体培养基里并将其分散均匀。把0.5ml的该分散液接种到锥形瓶里。
为了对照，重复如上所述的同样步骤，只是单独使用乙酸乙酯。
在30℃连续培养48小时，通过Petroff-Housser计数器计算生长细胞的数目。结果小结于表10。
表8
表9
注：＊马铃薯去皮（100g），切成约1cm方形体积，在500ml自来水中煮沸30分钟，冷却并除去固体物质。
＊＊肝切片（50g），在150ml自来水里中煮沸30分钟，冷却并除去固体物质。
从表10中很明显地看出，本发明的生理活性剂控制细菌繁殖是有效的。
实施例6
将本发明的生理活性剂（摩尔比：0.1、1和10）分别加到表12所示组成的琼脂培养基中，直到浓度是0.1mg/l。将一接种圈的表11所示的微生物悬浮在10ml的无菌水中，将0.1ml制得的悬浮液接种到上述的琼脂培养基中，在25℃连续平板培养。
在第七天计算生长细胞总数观察它们的形状。
结果小结于表13中。
表11
表12
＊土壤提取物：在12℃用500ml水提取土壤（1kg）30分钟，混合物放置过夜，滤液稀至1000ml。
从表13中可以看到，使用本发明的活性剂可以促进豆科细菌的繁殖，其因数为1.5-3，并且能使细胞增大成根瘤菌状。
实施例7
用土壤和堆肥（1∶1）的混合物装填Wagner盆（1/5000公亩）。施用化肥使N-P2O5-K2O三者比例是0.5-0.5-0.5/盆。
于每个这样制备的盆中，在三处播种5粒Glicine max Merr（总共15粒）。
10天后，对生长的秧苗间苗，使每处留下均匀高度的三棵苗。
播种后14天，把表14所示的20ml试验样品乙醇溶液均匀地施于三棵苗的根周围。按正常方法喷水和防治病虫害，让植物生长。
播种后74天，测量根瘤的数量和重量，结果示于表15。
表14
＊豆科细菌（Ⅱ）：于25℃将菌株（Ⅱ）培养10天后得到的实例6中的细胞悬浮在无菌水中，使其吸收率为0.3（660nm）。
表15
从表15中很明显地看出，使用本发明的生理活性剂，根瘤菌重量和数量数两者都有增加。
实施例8
本实施例说明使用本发明的生理活性剂显著地促进链霉菌属放线菌的繁殖。
将一接种圈的表16所列菌株接种到表17所示组成的斜面培养基上，且在30℃培养。
然后把得到的生长细胞接种到表17中所示组成的液体培养基上，在30℃连续振荡培养72小时，得到一种主培养物。
分别用无菌水稀释本发明生理活性剂的乙醇溶液（摩尔比：0.5），得到10-1、1.0和10mg/l浓度的溶液，把上述制得的每种溶液2ml）放在Petri培养皿里。
向Petri培养皿中加18ml表17所示组成的琼脂培养基，其中已接种了0.1ml主培养物。在30℃连续平板培养。
为对照，重复如上的同样步骤，仅使用同样体积的乙醇。
在第七天计算扩展的菌落数目，所得的结果小结于表18中。
使用本发明的1号生理活性剂，用表19所示的菌株进行类似试验。扩展的菌落数量与使用本发明没有活性的试验剂比较，约多1.5到2.2倍。
表16
表18
表19
实施例9
用水稀释本发明1号生理活性剂的乙醇溶液（摩尔比：1.5）得到浓度为10mg/l的试验溶液。
另外，用表12中所示组成的液体培养基，将在田间收集到的一种野生类型的链霉菌属菌株振荡培养4天。
对一升这种培养基溶液，加100ml上面制备的试验溶液。
然后将一份含有微生物细胞的这种活性剂与十份硅藻土混合，得到田间试验用的微生物样品。
这种微生物试样用到50棵黄瓜（Cucumis sativus），的地上受害部分。黄瓜已在田间生长50天并且使其遭受灰绿葡萄孢侵害。
为了对照，仅施用硅藻土到另一处50株黄瓜的受害部分。
观察病害的进展直至收获季节，在最后阶段计算能收获的植物数目。
结果示于表20。
表20
实施例10
用水稀释实施例9中制备的试验溶液，得到0.2g/l浓度的溶液。将这种稀释液施于播种后在地里已经生长了10天的100株蕃茄（Lycopersicon eculentum Mill）（以1l/m2的量土壤施用）。
施用后在第60天调查病害状况。结果示于表21中。判断有无地土受害部分，茎叶矮化程度和结实情况测定植物发病率。
另外，从试验和对照区采集土壤样品，按下面描述的步骤测量在根际处原生微生物的分布。
从30cm深处和离开每株蕃茄根30cm处取土样（50g到100g）放进灭菌袋，采集的样品在袋里充分混合。将2g这种混合物放入50ml的螺旋管（Spiry tube）。
然后加无菌水（10到15ml），在一射水混合器中振荡混合物一分钟，并且使其放置一分钟。用倾泄法除去上层清液。重复这个操作，用总量为100ml的无菌水洗涤土壤。重复上述的操作十次。
用总量200ml的无菌水再一次重复上述步骤。放几张无菌滤纸到获得的洗涤过的土壤里以吸收多余的水份，得到微生物分析用的样品土。
将样品土在20个Petri培养皿中铺展开，把琼脂培养基10ml倒入20个培养皿中的10个（培养基含2%琼脂和2%麦芽提取物）。把表12中所示组成的琼脂培养基10ml倒入剩下的10个培养皿中。在25℃连续平板培养14天。
分离在后10培养皿里扩展的菌落，经革兰氏杂色，在显微镜下观察，计算含有的细菌和酵母。除细菌和酵母外的菌落接种到ISP培养基里，属于链霉菌属的种由形态特征和细胞壁组成鉴定，并测定它们的分布率（可见频率）。
在前十个培养皿中，切断菌丝并培育长成分生孢子。用形态观察鉴定其属，测定分布率（可见频率）。
结果示于表22。
表21
表22
实施例11
进行了盆试验以检查本发明的生理活性剂对大豆作物的作用。
大豆的栽培条件和活性剂的施用表示如下。
（大豆的裁培）
厩肥（基肥）：N-P2O5-K2O＝1.5-1.5-1.5（g/盆）
播种时间：1986年7月
收获时间：1986年11月
（活性剂的施用）
（1）活性剂类型：1号生理活性剂（摩尔比：1）
（2）应用的浓度和量：1mg/l;1l/m2
（3）施用时间：播种后15天
（4）盆裁条件：三行， 1/2000 公亩/盆;每盆4株作物。
在表23中表明了收获的结果。
表23
实施例12
在Kasai域（Hyogo Prefecture，Japan）进行田间试验以检查本发明的生理活性剂对马铃薯的（Solansm tuberosam L.）的作用。
马铃薯的裁培条件和活性剂的施用如下所示：
（马铃薯的裁培）
厩肥（基肥）：N-P2O5-K2O＝11-14-16（Kg/10公亩）
播种时间：1987年8月
收获时间：1987年12月（活性剂的施用）
（1）活性剂类型：2号生理活性剂（摩尔比：1）
（2）施用浓度和量：1mg/l;1l/m2
（3）施用时间：播种后20天
（4）试验植物：30株马铃薯
在表24和25中总结了收获马铃薯的质量和产量。根据观察其病害（马铃薯疮痂病和白痂病）的严重情况评价质量。
表24
实施例13
在Himeji域（Hgogo Prefcture，Japan）进行田间试验以检查本发明的生理活性剂对青豆（Glicine max Merr.）的作用。
裁培条件和活性剂的施用如下所示：
（裁培）
厩肥（基肥）：N-P2O5-K2O＝6.4-5.6-5.6（70-80kg/10英亩）
播种时间：1987年4月
收获时间：1987年7月
（活性剂的施用）
（1）活性剂的类型：2号生理活性剂（摩尔比：1）
（2）施用浓度和量：1mg/l;1l/m2
（3）施用时间：播种后17天
（4）试验植物：30株青豆
测量豆的产量并且计算每株平均数。在结果示于表26。
另外，通过如实施例10中描述的微生物分析方法测量在根际处原生微生物的分布以检查本发明的生理活性剂对土壤中的微生物的作用。根据“伯捷氏的测定细菌学手册（第8版）”（Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology，8 th edition）、“鉴定放线菌类方法论（日本放线菌研究协会出版）”（Methodology for Identifying Actinomycetes）和“真菌图册，S·Udagawa和K·Tsubaki著”（PictorialBook of Fungi Written by S.Udagawa和K.Tsubaki）鉴定每种微生物的属。结果示于表27。
表26
表27
表27（续）
注：真菌总数＊：包括未鉴定的真菌。
真菌分布率（%）＊＊：对细胞总数的比率。
链霉菌属分布率（%）＊＊＊：同实施例14
在Himeji和Tatsuno城（Hyogo Prefecture，Japan）的三处田间试验本发明的生理活性剂在预防栽培马铃薯（Lycopersicon eculentum Mill）病害上的效果。
对在7月份种植的马铃薯秧苗，在种植后10天，在同样的条件下施用按实施例13的方法制备的活性剂，并检查处理过的马铃薯对疾病的耐性。在每一块田中，进行等面积的试验和对照。约试验1500株植物（平均）。
种植后60天，检查每一棵马铃薯，观察细菌萎病铲刀萎蔫病或细菌软腐病的受害面积，如超过30%可认为是受害植物，然后计算其发病率（以植物总数为基础）。结果小结于表28。
表28