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1、(10)申请公布号 CN 104017766 A (43)申请公布日 2014.09.03 C N 1 0 4 0 1 7 7 6 6 A (21)申请号 201410271443.4 (22)申请日 2014.06.17 CGMCC No9286 2014.06.09 C12N 1/21(2006.01) C12N 15/74(2006.01) C22B 3/18(2006.01) C12R 1/01(2006.01) (71)申请人山东大学 地址 250061 山东省济南市历城区山大南路 27号 (72)发明人刘相梅 文晴 林建群 (74)专利代理机构济南圣达知识产权代理有限 公司 372。
2、21 代理人李健康 (54) 发明名称 一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及 其应用 (57) 摘要 本发明公开了一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫 硫杆菌抗铜基因工程菌，该菌株于2014年06月 09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，其保藏编号为：CGMCC No.9286。本 发明所述的工程菌是通过将嗜酸性氧化亚铁硫杆 菌的copB Af 基因整合到嗜酸性氧化硫硫杆菌的基 因组上获得。本发明还公开了所述工程菌在生物 浸矿中的应用。实验证实，本发明的嗜酸性氧化硫 硫杆菌抗铜基因工程菌较野生型嗜酸性氧化硫硫 杆菌具有更高的抗铜特性，且遗传稳定，预示在铜 矿的生物浸出领域具有很大的。
3、应用价值。 (83)生物保藏信息 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图1页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书1页 说明书8页 序列表6页 附图1页 (10)申请公布号 CN 104017766 A CN 104017766 A 1/1页 2 1.一株稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于：所述菌株命 名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af ，该菌株已于2014年 06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC 。
4、No.9286。 2.权利要求1所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤 是： (1)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270基因组 上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copB Af ，构建到嗜酸性氧化硫硫杆菌 整合型质粒pZK19-IngUH-IngDH上获得重组质粒pZK19-copB Af ，利用转化方法将该重组质 粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1pir中； (2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒pZK19。
5、-copB Af 的 大肠杆菌E.coli S17-1pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有copB Af 基因的整合 型质粒pZK19-copB Af 转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接合菌液稀释后涂布 到含150g/mL卡那霉素的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上，30培养10天长出单菌落；将 1.0L12mg/mL的无菌X-gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛选获得的copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证确认； (3)以copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作。
6、为受体菌，含pMSD1-PTSceI质 粒的E.coli SM10作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒pMSD1-PTSceI转入copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释后涂布到含12mg/mL X-gal溶 液和150g/mL链霉素的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上，30培养10天获得发生第二次同 源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选获得A.thiooxidans copB Af 基因整 合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans) copB Af 。。
7、 3.权利要求1所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中 的应用。 权 利 要 求 书CN 104017766 A 1/8页 3 一株嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌及其应用 技术领域 0001 本发明涉及一株嗜酸性氧化硫硫杆菌及其应用，尤其涉及一株能够稳定遗传的嗜 酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其在生物浸矿中的应用。 背景技术 0002 嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans，A.thiooxidans)在生 物浸矿、重金属污染治理和生物脱硫等领域具有十分重要的作用，但是在生物浸出和重金 属污染治理过程中，尤其是在铜矿的生物浸出过程中。
8、，铜离子浓度往往很高，一般为30 90mM，有些浸矿环境中甚至高达300mM，而A.thiooxidans的铜离子最小抑制浓度(MIC)通 常低于上述环境中的铜离子浓度，例如，本实验保藏的A.thiooxidans ATCC19377的铜离子 MIC约为25mM远低于浸矿环境中的铜离子浓度，因此限制了其应用范围。 0003 目前，在嗜酸性硫杆菌属(Acidithiobacillus sp.)中，科研工作者仅通过导入重 组质粒的形式来提高或增加该属菌的某些生物特性；但是以质粒形式构建的基因工程菌稳 定性差，在无抗生素压力下，工程菌中的质粒容易丢失，从而使得工程菌中某种生物特性降 低甚至丧失，因此。
9、，为了提高工程菌中质粒的稳定性，必须在其生存的环境中添加抗生素； 嗜酸性硫杆菌主要应用于生物浸矿、重金属污染治理等领域，向上述环境中添加抗生素一 方面会对环境造成危害，另一方面价格不菲的抗生素无疑会增加工业成本，不利于该种基 因工程菌的大规模应用。如果将某些具有特殊生物活性的基因通过遗传操作的方法整合到 嗜酸性硫杆菌的染色体上将会克服上述弊端。经对国内外文献的检索，目前还没有任何有 关通过基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性硫杆菌基因工程菌的报道，尤其是通过 基因整合的方法构建能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌高铜抗性基因工程菌的报道，基 于此，构建能够稳定遗传的A.thiooxidans高抗。
10、铜基因工程菌是当下亟待解决的问题。 发明内容 0004 针对现有技术中对嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜能力遗传改良方法的空白，本发明的 目的是提供一株能够稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜工程菌及其应用。 0005 本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌，其特征在于：所述 菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af ，该菌株已于 2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为 CGMCC No.9286。 0006 本发明所述稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建方法，步骤 是：。
11、 0007 (1)从嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)ATCC23270基 因组上PCR扩增含有启动子的铜离子外排P型ATPase基因copB Af ，构建到嗜酸性氧化硫硫 杆菌整合型质粒pZK19-IngUH-IngDH上获得重组质粒pZK19-copB Af ，利用转化方法将该重 组质粒转化入大肠杆菌(Escherichia coli)S17-1pir中； 说 明 书CN 104017766 A 2/8页 4 0008 (2)以野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株作为受体菌，含重组质粒 pZK19-copB Af 的大肠。
12、杆菌E.coli S17-1pir作为供体菌，通过接合转移的方法将含有 copB Af 基因的整合型质粒pZK19-copB Af 转入嗜酸性氧化硫硫杆菌菌株ATCC19377中；将接 合菌液稀释后涂布到含150g/mL卡那霉素的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上，30培养10天 长出单菌落；将1.0L12mg/mL的无菌X-gal溶液滴加单菌落上，生成的蓝色单菌落即是筛 选获得的copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，通过PCR和琼脂糖凝胶电泳验证 确认； 0009 (3)以copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，含。
13、 pMSD1-PTSceI质粒的E.coli SM10作为供体菌，通过接合转移的方法将诱导质粒 pMSD1-PTSceI转入copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株中；将接合菌液稀释 后涂布到含12mg/mL X-gal溶液和150g/mL链霉素的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上， 30培养10天获得发生第二次同源重组的白色单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR筛选 获得A.thiooxidans copB Af 基因整合的基因工程菌，该菌株命名为嗜酸性氧化硫硫杆菌 (Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 。 0010。
14、 本发明所述的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌在生物浸矿中的 应用。 0011 其中：嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌铜离子MIC的测定方法是：将嗜酸性 氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株在Starkey-S 0 液体培养基中， 30，180rpm摇瓶培养至对数后期(约57天)，按照菌浓为10 6 10 7 个/mL的接种量 将A.thiooxidans copB Af 接种到100mL含0100mM CuSO 4 的Starkey-S 0 液体培养基中， 30，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取1mL菌悬液。
15、用于测定OD 600 ，并绘制 A.thiooxidans copB Af 在不同铜离子浓度培养下的生长曲线，确定A.thiooxidans copB Af 菌 株的铜离子MIC。 0012 由A.thiooxidans copB Af 菌株的在不同铜离子浓度下的生长曲线可以看出该菌的 铜离子MIC大于80mM，并且浸矿环境中的铜离子浓度通常为30-90mM，提示，该菌株的高铜 抗性将有利于其在生物浸出中的应用。 0013 其中：所述嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌用于生物浸矿的方法是： 0014 (1)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB 。
16、Af 在铜矿粉中的 驯化：将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株在Starkey-S 0 液体培养基中，30，180rpm摇瓶培养至对数后期(约57天)，按照菌浓为10 6 10 7 个/mL的接种量将A.thiooxidans copB Af 接种到200mL含2(W/V)黄铜矿矿粉粒径 0.20mm)和1(W/V)硫粉的Starkey-S 0 液体培养基中，30，180rpm摇瓶培养至菌浓 达到1.06.010 8 个/mL；将在2(W/V)黄铜矿矿粉下生长的A.thiooxidans copB Af 接种到200mL含4(W。
17、/V)黄铜矿矿粉和1(W/V)硫粉的Starkey-S 0 液体培养基中， 30，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.06.010 8 个/mL；将在4(W/V)黄铜矿矿粉下 生长的A.thiooxidans copB A.f 接种到200mL含5(W/V)黄铜矿矿粉和1(W/V)硫粉的 Starkey-S 0 液体培养基中，30，180rpm摇瓶培养至菌浓达到1.06.010 8 个/mL。 0015 (2)嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 生物浸矿：将 上述步骤(1)中获得的适应5(W/V)铜矿粉的A.thiooxidans co。
18、pB Af 以10 7 10 8 个/mL 说 明 书CN 104017766 A 3/8页 5 接种至200mL含4g/LFe 2+ ，30mM CuSO 4 和5(W/V)黄铜矿矿粉的Starkey-S 0 液体培养 基中，30，180rpm摇瓶培养，另外，用含4g/LFe 2+ ，30mM CuSO 4 和5(W/V)黄铜矿矿粉的 Starkey-S 0 液体培养基作为空白对照；在A.thiooxidans copB Af 的生物浸矿期间，每隔5 10天取样，用原子吸收色谱测定上清液中的铜离子含量(g/L)。 0016 本发明通过基因工程手段，将嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiob。
19、acillus ferrooxidans)ATCC23270中一个具有高排铜能力的P型铜外排ATPase的基因(copB Af )整 合到嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ATCC19377的基因组上，获得 了整合copB Af 基因的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af ，该基 因工程菌在铜离子浓度为80mM下的生长状况与野生型A.thiooxidans ATCC19377在20mM 的生长状况类似，因此，本发明的嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidan。
20、s) copB Af 在铜抗性方面比野生型嗜酸性酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)ATCC19377提高了60mM。浸矿环境中的铜离子浓度通常在3090mM，而野 生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的铜离子MIC只有25mM，因此，在铜离子浓度高于 25mM的浸矿环境中，野生型A.thiooxidans ATCC193777菌株的生长将严重受到抑制；但是 本发明所构建的A.thiooxidans copB Af 菌株的铜离子MIC大于80mM，因此，在铜离子浓度为 3090mM的浸矿环境中，本发明的A.thiooxidansco。
21、pB Af 菌株的生长不会或很少受到抑制。 这将扩大嗜酸性氧化硫硫杆菌在高铜含量金属硫化矿生物浸出中的应用范围，并且国外研 究表明高抗铜菌株的生物浸出效率高于低抗铜菌株(Das,A.,Modak,J.,and Natarajan,K. A.,Antonie van Leeuwenhoek.,1998,Vol.73,No.3,21522)，因此，本发明所构建的嗜酸 性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株应具有更高的浸矿效率，预 示本申请所构建的稳定遗传的嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌A.thiooxidans copB Af 具有巨大的。
22、应用价值。 附图说明 0017 本发明所述嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株 已于2014年06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏 号为CGMCC No.9286。 0018 图1.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株PCR验 证图。 0019 其中：L，Tans2K PlusII DNA Marker,从上到下大小依次为8.0kb、5.0kb、3.0kb、 2.0kb、1.0kb、0.75kb、0.5kb、0.25kb、0.10k。
23、b；W，野生型A.thiooxidans菌株基因组DNA为 模板；S，copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株基因组DNA为模板；M，嗜酸性氧化硫 硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株基因组DNA为模板。所用引物对列于 琼脂糖凝胶电泳图上方，依次为：IngoutF/IngoutR、InginF/InginR、copB-F/copB-R、Km-F/ Km-R。 0020 图2.嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株在不同 铜离子浓度下的生长曲线。 0021 其中。
24、：培养所用铜离子浓度分别为：0mM、10mM、20mM、30mM、40mM、50mM、60mM、 70mM、80mM。 说 明 书CN 104017766 A 4/8页 6 具体实施方式 0022 一般性说明： 0023 本发明所用嗜酸性氧化硫硫杆菌标准菌株A.thiooxidans ATCC19377和嗜酸性 氧化亚铁硫杆菌标准菌株A.ferrooxidans ATCC23270购自ATCC(美国典型微生物菌种 保藏中心)；所述大肠杆菌菌株JM109购自TaKaRa公司；所述大肠杆菌菌株S17-1pir 和SM10购自济南鑫兴生物科技有限公司。所述质粒pZK19和pMSD1-PTsceI来源。
25、见Qing Wen,Xiangmei Liu,Huiyan Wang,Jianqun Lin:A versatile and efficient markerless gene disruption system for Acidithiobacillus thiooxidans:application for characterizing a copper tolerance related multicopper oxidase gene.Environmental Microbiology,DOI:10.1111/1462-2920.12494。所述pUC19质粒和X-gal购自上海生工。
26、生 物工程技术有限公司。Tans2K PlusII Marker购自北京全式金生物技术有限公司。所用质 粒提取试剂盒Plasmid Mini Kit I、琼脂糖凝胶回收试剂盒GelExtraction Kit和细菌基因 组提取试剂盒Bacterial DNA Kit均购自Omega生物技术有限公司。所用PrimerSTAR HS DNA Polymerase DNA聚合酶和rTaq DNA Polymerase购自TAKARA公司，TranFast Taq DNA Polymerase购自北京全式金生物技术有限公司。所用限制性核酸内切酶和T4DNA连接酶购 自TAKARA公司。 0024 所用。
27、Starkey-Na 2 S 2 O 3 无机盐溶液配方为：6.0g/L KH 2 PO 2 ，6.0g/L(NH 4 ) 2 SO 4 ，1.0g/ LMgSO 4 7H 2 O，0.5g/L CaCl 2 2H 2 O，浓硫酸调节至pH4.8，121高压灭菌20min。 0025 所用Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体培养基配方为：A液：0.6g KH 2 PO 2 ，0.6g(NH 4 ) 2 SO 4 ， 1.0gMgSO 4 7H 2 O，0.05g CaCl 2 2H 2 O，蒸馏水100mL，浓硫酸调节至pH4.8，121灭菌 20min；B液：2g琼脂粉，蒸馏水10。
28、0mL，121灭菌20min；C液：2.0g Na 2 S 2 O 3 ，0.006g FeSO 4 7H 2 O溶解至10mL蒸馏水中，过滤除菌；A液和B液高压灭菌后冷却至80混合，再加入C液 混合，制备固体平板。 0026 所用Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体接合培养基配方为：在上述Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体培养 基配方A液中加入0.05酵母粉。 0027 所用Starkey-S 0 液体培养基配方为：3.0g/L KH 2 PO 2 ，2.0g/L(NH 4 ) 2 SO 4 ，0.5g/L MgSO 4 7H 2 O，0.01g/L FeSO 4 7H。
29、 2 O，0.25g/L CaCl 2 2H 2 O，浓硫酸调节至pH2.5，121高 压灭菌20min；硫粉放入试剂瓶中密闭，煮沸3h灭菌，接种后按10g/L加入培养基中。 0028 实施例1：抗铜基因copB Af 整合质粒pZK19-copB Af 的构建及鉴定 0029 1.构建用于A.thiooxidans ATCC19377基因整合的质粒骨架pZK19-IngUH-IngDH 0030 在A.thiooxidans ATCC19377的基因组上选取转录方向相反的两个基因的间隔区 域作为外源基因插入的位点；设计引物扩增插入位点上、下游约1.0kb的片段作为同源重 组的同源臂： 003。
30、1 IngUHF：5-CTGTCGACGGG GATAGATGACATTC-3 0032 IngUHR：5-GTAAGCTTGCCTGATCAGCTCACGGT-3 0033 IngDHF：5-TTATGGATCCGGCTTCAGGCATCGCCGT-3 0034 IngDHR：5-GGCGCTCTAGACTCTTAATGGTCCTATTCCGAG-3 0035 在引物IngUHF的5端加入SalI酶切位点，在引物IngUHR的5端加入HindIII 说 明 书CN 104017766 A 5/8页 7 酶切位点，在引物IngDHF的5端加入BamHI酶切位点,在引物IngDHR的5端加入Xb。
31、a I 酶切位点。引物对IngUHF/IngUHR和IngDHF/IngDHR，分别以A.thiooxidans ATCC19377基 因组DNA为模板，通过PCR扩增获得用于基因整合的上、下游同源臂片段。 0036 PCR反应体系(25L)组成如下：5PrimerSTAR Buffer(Mg 2+ plus)5L；dNTP Mixture(各2.5mM)2L；引物IngUHF/IngUHR或IngDHF/IngDHR(10M)各0.25L； A.thiooxidans ATCC19377基因组DNA模板0.25L；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/ L)0.。
32、25L；水18L。 0037 PCR反应条件：98预变性3min，98变性10s，58退火10s，72延伸1min，30 个循环后72延伸5min，4保存。PCR扩增产物大小：IngUHF/IngUHR引物对为997bp， IngDHF/IngDHR引物对为985bp。 0038 将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化后，IngUHF/IngUHR引物对的扩增产物 用Sal I和HindIII酶切，同时将质粒pZK19用相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后 用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态细胞，获得重组质粒pZK19-IngUH。然后将 IngD。
33、HF/IngDHR引物对的扩增产物用BamH I和Xba I酶切，同时将重组质粒pZK19-IngUH用 相同的内切酶酶切，将酶切产物过柱纯化后用T4DNA连接酶连接，转化E.coli JM109感受态 细胞，获得重组质粒pZK19-IngUH-IngDH，该重组质粒用于后续A.thiooxidans ATCC19377 中基因整合的质粒骨架。 0039 2.构建用于copB Af 基因整合的重组质粒pZK19-copB Af 0040 设计引物扩增嗜酸性氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans) ATCC23270基因组上基因编号为AFE_2021的基因，。
34、该基因功能注释为： copper-translocating P-type ATPase： 0041 2021-F：5CTAAGCTTGTACTCCGGGGTGTCGAAATC3 0042 2021-R：5CTAAGCTTCAGCCCCTCCACAAAAGCCTTC3 0043 在2021-F引物和2021-R引物的5端均引入HindIII酶切位点，引物对 2021-F/2021-R以A.ferrooxidans ATCC23270基因组DNA为模板，通过PCR获得copB Af 基 因片段。 0044 PCR反应体系(25L)组成如下：5PrimerSTAR Buffer(Mg 2+ plu。
35、s)5L； dNTP Mixture(各2.5mM)2L；引物IngUHF/IngUHR或IngDHF/IngDHR(10M)各 0.25L；A.ferrooxidans ATCC23270基因组DNA模板0.25L；PrimerSTAR HS DNA Polymerase(2.5U/L)0.25L；水18L。 0045 PCR反应条件：98预变性3min，98变性10s，58退火10s，72延伸3min，30 个循环后72延伸5min，4保存。PCR扩增产物大小为3.03kb。 0046 将以上PCR产物用Gel Extraction Kit纯化，经HindIII酶切后，连入同样经 Hind。
36、III酶切的A.thiooxidans ATCC19377基因整合质粒骨架pZK19-IngUH-IngDH中，获 得携带copB Af 基因的整合型重组质粒pZK19-copB Af 。然后将该质粒转化可进行接合转移的 E.coli S17-1pir中。 0047 实施例2：嗜酸性氧化硫硫杆菌抗铜基因工程菌的构建及鉴定 0048 1.构建copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株 0049 分别收集对数中期的大肠杆S17-1pir(pZK19-copB Af )作为供体菌和对数后期 说 明 书CN 104017766 A 6/8页 8 的嗜酸性氧化硫硫杆菌ATCC1937。
37、7作为受体菌，并按照供体菌：受体菌为1:1.5的比例 混匀,涂在放置于Starkey-Na 2 S 2 O 3 接合培养基平板的0.22um滤膜上，30培养7天；用 Starkey-Na 2 S 2 O 3 无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并涂布到含有150g/mL卡那霉素 的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上，30培养12天；然后将1.0L的12mg/mL的无菌X-gal 溶液滴加到上述单菌落上，30放置30min后挑取蓝色菌落进行PCR扩增和琼脂糖凝胶电 泳检测验证，从而获得copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株，所用引物如下： 0050 Ing。
38、inF：5-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3 0051 InginR：5-CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3 0052 copB-F：5-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3 0053 copB-R：5-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3 0054 Km-F：5-GAACAAGATGGATTGCACGCAG-3 0055 Km-R：5-GAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAG-3 0056 (1)引物对InginF/InginR的PCR反应体系(25L)组成如下:10TransFast Taq Buffer2.5L；dNTP Mixtu。
39、re(各2.5mM)2L；引物对InginF/InginR(10M)各0.25L； 菌液模板1L；TansFast Taq DNA Polymerase(2.5U/L)0.25L；水19L。 0057 引物对InginF/InginR的PCR反应条件：94预变性3min，94变性5s，58退火 15s，72延伸1min，33个循环后72延伸5min，4保存。 0058 引物对InginF/InginR扩增产物大小：野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株为 0.35kb，copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为3.3kb和0.35kb，见图1。 0059。
40、 (2)引物对copB-F/copB-R的PCR反应体系(25L)组成如下：10PCR Buffer(Mg 2+ plus)2.5L；dNTP Mixture(各2.5mM)2L；引物对copB-F/copB-R(10M)各 0.25L；菌液模板1L；rTaq DNA Polymerase(5U/L)0.125L；水19L。 0060 引物对copB-F/copB-R的PCR反应条件：94预变性3min，94变性30s，58退 火30s，72延伸90s，33个循环后72延伸5min，4保存。 0061 引物对copB-F/copB-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidans ATCC19。
41、377菌株为 0kb；copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为1.46kb，见图1。 0062 (3)引物对Km-F/Km-R的反应体系(25L)组成如下：10PCR Buffer(Mg 2+ plus)2.5L；dNTP Mixture(各2.5mM)2L；引物对Km-F/Km-R(10M)各 0.25L；菌液模板1L；rTaq DNA Polymerase(5U/L)0.125L；水19L。 0063 引物对Km-F/Km-R的PCR反应条件：94预变性3min，94变性30s，58退火 30s，72延伸40s，33个循环后72延伸5min，4保存。 0064 引物。
42、对Km-F/Km-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株为0kb； copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株为0.78kb，见图1。 0065 将获得的copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株接种于20mL Starkey-S 0 液体培养基中，30条件下，静置培养3天，然后180rpm摇瓶培养6天。 0066 2.构建嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 基因工程 菌 0067 分别收集对数中期的大肠杆SM10(pMSD1-PTSceI)作为供体菌和对数后期。
43、的 copB Af 基因整合的A.thiooxidans单交换菌株作为受体菌，按照供体菌：受体菌为1:1.5 说 明 书CN 104017766 A 7/8页 9 的比例混匀供受体菌，涂在放置于Starkey-Na 2 S 2 O 3 接合培养基平板的0.22m滤膜上， 30培养4872h，用Starkey-Na 2 S 2 O 3 无机盐溶液将滤膜上的菌体洗脱下来，并经无机盐 溶液梯度稀释后涂布到含有12mg/mL X-gal溶液和150g/mL链霉素的Starkey-Na 2 S 2 O 3 固体平板上，30培养12天长出蓝、白分明的单菌落；挑取白色菌落进行菌落PCR，筛选 获得嗜酸性氧化。
44、硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 基因工程菌(所述 A.thiooxidans copB Af 基因组上copB Af 基因及其部分上下游序列如SEQ ID No.15所示)，所 用引物如下： 0068 InginF：5-GCTGGAAAGACACCTTGCTG-3 0069 InginR：5-CTACAGTTTCGGGGTGTGGAC-3 0070 copB-F：5-CGGATACCGTGGATCAAAACAC-3 0071 copB-R：5-GTCTGCTGCAAATCGCCAGTG-3 0072 IngoutF：5-CCCTTCATTT。
45、CCGTTCATCTG-3 0073 IngoutR：5-ACGGATTTCCTGAAGAACCC-3 0074 (1)引物对InginF/InginR的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤1。 0075 引物对InginF/InginR扩增产物大小：野生型A.thiooxidans ATCC19377为 0.35kb；A.thiooxidans copB Af 基因工程菌为3.3kb，见图1。 0076 (2)引物对copB-F/copB-R的PCR反应体系和PCR反应条件见实施例2的步骤1。 0077 引物对copB-F/copB-R扩增产物大小：野生型A.thiooxidans。
46、 ATCC19377为0kb； A.thiooxidans copB Af 基因工程菌为1.46kb，见图1。 0078 (3)引物对IngoutF/IngoutR的PCR反应体系(25uL)组成如下:10TransFast Taq Buffer2.5L；dNTP Mixture(各2.5mM)2L；引物对InginF/InginR(10M)各 0.25L；菌液模板1L；TansFast Taq DNA Polymerase(2.5U/L)0.25L；水19L。 0079 引物对IngoutF/IngoutR的PCR反应条件：94预变性3min，94变性5s，58退 火15s，72延伸3min。
47、30s，33个循环后72延伸5min，4保存。 0080 引物对IngoutF/IngoutR扩增产物大小：野生型A.thiooxidans ATCC19377菌株 为3.9kb；A.thiooxidans copB Af 基因工程菌菌株为6.8kb，见图1。 0081 将获得的A.thiooxidans copB Af 基因工程菌单菌落接种于20mL Starkey-S 0 液体 培养基中，30条件下，静置培养3天，然后180rpm摇瓶培养6天。该菌株已于2014年 06月09日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC No.9286。 0082 实施例3：。
48、A.thiooxidans copB Af (CGMCC No.9286)基因工程菌在生物浸矿中的应 用 0083 1.A.thiooxidans copB Af (CGMCC No.9286)在含铜培养基中的生长测定 0084 将嗜酸性氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans)copB Af 菌株在 Starkey-S 0 液体培养基中，30，180rpm摇瓶培养至对数后期(约57天)，按照菌浓为 10 6 10 7 个/mL的接种量将A.thiooxidans copB A.f 接种到100mL含0100mM CuSO 4 的 Starkey-S 0 液体培养基中，30，180rpm摇瓶培养；培养期间2或3天从每瓶菌中取1mL 菌悬液用于测定OD 600 ，并绘制A.thiooxidans copB Af 在不同铜离子浓度培养下的生长曲线 (见图2)，确定A.thiooxidanscopB Af 菌株的铜离子MIC。由A.thiooxidans copB Af 菌株的 说 明 书CN 104017766 A 8/8页 10 在不同铜离子浓度下的生长曲线可。