本发明涉及一种得自变铅青链霉菌（Streptomyces lividans）的高比活性木聚糖酶，尤其是这些酶在木质纤维材料方面的应用。 植物细胞壁的内聚现象首先是由于其主要成分的存在;结晶聚合物、纤维素和三维大分子、木质素一起构成一种木质纤维材料。该木质纤维材料嵌在果胶和各种性质的半纤维多糖的基质中。
通常认为这些不同的聚合物之间存在的各种关系是由不同化学性质的键确定的。例如，木质素块是通过半纤维素链结合的。半纤维素（木质纤维材料的另一主要成分）大多由4-0-甲基葡糖醛酸木聚糖组成，它包括D-木糖的β-1，4-连接聚合物，本文称作木聚糖。通常，硬木纸浆的木聚糖含量较软木纸浆高。该木聚糖可通过内-木聚糖酶、β-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶（指EC3.2.1.8）酶催化水解成木糖。
以前已证实木质纤维材料中所含的木聚糖可通过使用内-木聚糖酶而部分或全部分解，这为生产纸浆的物理和/或化学方法均能提供有吸引力的选择方案，它能改善纸浆性质，例如，改善漂白率或提高白度。用木聚糖酶改善纸浆性能，尤其是提高白度，称为“生物漂白”。
现已表明用木聚糖酶处理纸浆，尤其是化学纸浆具有生物漂白作用，它能提高经处理纸浆的白度和粘度，同时能减少后续漂白步骤中氯和其它漂白剂的消耗。因此，与不用内-木聚糖酶处理的普通纸浆漂白工艺相比，已证明用木聚糖酶处理能改善纸浆性能，并能减少漂白过程的环境影响。
而且，也已证明通过半纤维素裂解而致使木质素释放对于防止某些纸浆性能如粘度降低是有特效的，其原因是由于纤维素酶，通常最好是基本上游离纤维素酶木聚糖酶混合物而使纤维素水解。
各种生产木聚糖酶的方法在生物漂白工业中是公知的。然而，优选的方法是使用如链霉菌（Streptomyces）属的重组微生物，它能进行培养以用于生产游离纤维素酶、内-木聚糖酶。
尽管生物漂白具有许多优点，但目前未能在工业上实施，因为酶处理的成本很高。通常，这种高处理成本是由于目前所能得到的内-木聚糖酶地活性低造成的。
酶是生物反应中能起催化剂作用的蛋白质。说明酶催化活性的一种简单方法是用以IU/mg表示的其比活性，即每单位酶用量所生成的产品量。术语IU（国际单位）指在确定PH和温度条件下，每分钟催化转化1质量单位底物酶的量。
至今，文献中描述的木聚糖酶具有的比活性范围为已纯化酶的8-3500IU/mg。在此活性范围内，达到所要效果需用的酶量，其价格是相当高的。
意想不到的是，现在我们已发现并纯化得到一种内-木聚糖酶，它得自链霉菌（Streptomyces）属。更确切地说，它得自变铅青链霉菌种，该菌种具有比以前已知的内-木聚糖酶高得多的比活性。
尤其是，本发明的内-木聚糖酶能使用于生物漂白过程的木聚糖酶用量大大减少。
因此，最好能提供一种内-木聚糖酶，其比活性高于以前公知的内-木聚糖酶。而且，还希望能提供一种链霉菌属重组微生物，它能进行培养以生产游离纤维素酶、高活性内-木聚糖酶。还进一步希望提供一种用高比活性内-木聚糖酶处理木质纤维材料，尤其是化学纸浆的方法。
因此，本发明提供的一种高活性内-木聚糖酶自然由链霉菌属菌株得到，或由将杂交质粒引入链霉菌属的寄主微生物突变菌株而产生的重组微生物而得到，所述杂交质粒是通过将一种新木聚糖酶基因（以xln C表示）插入载体质粒而构建的，这种新木聚糖酶基因得自链霉菌属含木聚糖酶基因的微生物。
最好该载体质粒从链霉菌属的微生物中得到。用于本发明的优选链霉菌种是变铅青链霉菌。
高活性内-木聚糖酶的定义为：根据BioRadTM的蛋白质测定方法，比活性大于已纯化蛋白质（5000IU/mg）的一种木聚糖酶。较好的是内-木聚糖酶的比活性大于20000，更好的是大于30000IU/mg，最好的是大于40000IU/mg。
虽然测得的木聚糖酶比活性会随所用特定测试方法而变化，但应该注意，如下所述，生物漂白所需的木聚糖酶用量低于以前的用量。
最好，该内-木聚糖酶是基本上游离的纤维素酶。术语“基本上游离的纤维素酶”意思是指那些体系，当酶与纤维素纸浆相接触时，其所含纤维素酶的量不足以使纤维素中存在的糖苷键发生不适宜的水解。
该内-木聚糖酶也最好是从寄主微生物中得到的，其中寄主微生物突变菌株的特征是具有负纤维素酶活性。负纤维素酶，当用于本文时其定义为能产生游离纤维素酶木聚糖酶的菌株，它基本上不含胞外纤维素酶。
另外，优选的内-木聚糖酶是从寄主微生物中得到的，其中寄主微生物突变菌株的特征是具有负木聚糖酶活性。与寄主微生物有关的负木聚糖酶活性定义为一种菌株，它在引入杂交质粒前能产生基本上不含木聚糖酶的酶。
最好内-木聚糖酶是从寄主微生物中得到，其中寄主微生物特征是既具有负纤维素酶又有负木聚糖酶活性。
第二方面，本发明提供的一种重组微生物含有载带xln C基因的杂交质粒，该基因编码以产生高活性木聚糖酶C酶，其中所述质粒能诱导高活性内-木聚糖酶在该质粒已引入的寄主微生物内胞外产生。
最好，重组微生物含有的杂交质粒能诱导游离纤维素酶、高活性内-木聚糖酶，不含胞外纤维素酶的胞外产生。
此外，重组微生物由寄主微生物得到，其中所述寄主微生物是一种链霉菌属的突变菌株，最好从变铅青链霉菌种得到。
本发明还提供一种得自寄主微生物的重组微生物，其中寄主微生物特征是具有负纤维素酶和/或负木聚糖酶活性。
因此，寄主微生物最好是变铅青链霉菌种的突变菌株，其中所述寄主微生物特征是具有负纤维素酶活性。更优选的是，寄主微生物是链霉菌属的一种双突变菌株，其中所述寄主微生物特征是具有负木聚糖酶活性。
最好该寄主微生物是变铅青链霉菌种的双突变菌株，该菌株特征是它也具有负木聚糖酶活性。
更优选的是寄主微生物是变铅青链霉菌10-164的双突变菌株，且寄主微生物特征是负纤维素酶和负木聚糖酶活性。
应该注意，与本发明有关的上述寄主微生物突变菌株（其特征为具有负木聚糖酶和/或负纤维素酶活性）包括也可能具有其它负酶活性的那些突变菌株。
第三方面，本发明提供一种杂交质粒，它是通过将木聚糖酶C（xln C）基因插入载体质粒而构建的。优选方案是所述基因和所述载体质粒或二者均由链霉菌属的微生物获得。更优选的是木聚糖酶C（xln C）或载体质粒或二者均由变铅青链霉菌种微生物获得。最优选的是木聚糖酶C（xln C）基因由变铅青链霉菌1326菌株获得和/或载体是得自变铅青链霉菌3131菌株的PIJ702。
第四方面，本发明提供一种木聚糖酶基因，表示为xln C，该基因编码的DNA顺序基本上包括表1所列的顺序。
第五方面，本发明提供一种如上定义的重组微生物的生产方法，它包括将与本发明有关的如上定义的杂交质粒引入如上定义的寄主微生物中。
用原生质体融合或电-融合方法，优选用转导或更优选用转化方法，将杂交质粒引入寄主微生物中。
认为木聚糖酶C（xln C）基因在其引入如上定义的寄主微生物时已被克隆，由此提供的重组微生物特征是至少其高活性内-木聚糖酶具有负纤维素酶活性。xln C基因在重组微生物中的表达导致游离纤维素酶、高活性内-木聚糖酶的产生。
借助于分子克隆和先进的发酵技术，使这种新酶在游离纤维素酶变铅青链霉菌寄主中的形成得以改善，而且发现产生的酶对纸浆处理是有用的。
表1：木聚糖酶C DNA顺序
在含适于酶表达碳源的合适菌种生长培养基存在条件下，内-木聚糖酶胞外分泌进入重组微生物的培养基。最好该木聚糖酶是内-木聚糖酶，也称为木聚糖酶或β-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶，用EC3.2.1.8表示，其特征是基本上游离纤维素酶，并具有高比活性。
由木聚糖键水解引起木聚糖的酶降解是局部的，因此不会从纸浆中激烈释放木糖和木二糖。
按本发明，用游离纤维素酶的高活性内-木聚糖酶处理木质纤维材料（最好是化学纸浆）结果能改进去木质作用（用已处理纸浆卡伯数值减少说明）、白度和粘度。而且，上述处理可提供更为松弛的纤维，结果使后续处理，如溶胀、打浆、排水、或纸浆的化学漂白操作得以改进，所用能源和药品均减少。
由于本发明木聚糖酶的活性高，它特别适用于纸浆的生物漂白。因此，本发明的第六方面是提供一种处理纸浆（最好是具有可水解木聚糖酶β-1，4-D-木糖苷键的化学纸浆）的方法，该方法包括将所述纸浆与上述高活性内-木聚糖酶相接触，以使所述键水解。最好，该键的水解能导致所述纸浆生物漂白。
生物漂白所需内-木聚糖酶的用量明显低于现有技术方法所需木聚糖酶的量。本发明内-木聚糖酶用量优选为每克纸浆（以烘干纸浆的重量计）少于0.1mg木聚糖酶（w/w）。更优选的内-木聚糖酶用量少于0.01mg/g纸浆，最优选的内-木聚糖酶用量少于0.005mg/g纸浆。
本发明方法也可用于处理含水的北方或南方硬木纸浆料，采用两种不同的游离纤维素酶木聚糖酶。
尽管最好使用牛皮纸浆，但也能用其它经化学浸煮的纸浆。处理前该纸浆也能先用氧处理。未漂白的牛皮纸浆可一步或分多步进行处理，并且可结合使用低活性酶处理步骤。例如，第一步用得自变铅青链霉菌的低比活性内-木聚糖酶，第二步例如用本发明得自变铅青链霉菌的高活性木聚糖酶，如〔PIAF20〕，如下所述。
处理过程中酶的浓度范围通常约为0.01-500IU/g已处理纸浆，优选为1-500IU/g，这取决于所要生物漂白和/或去木质化程度，进行处理的温度约为20-80℃，优选为50℃。两种上清液最好都不含纤维素酶活性，因此能用于纸浆中所含木聚糖的特殊浸蚀。
在用内-木聚糖酶处理过程中，纸浆稠度优选约为0.1%-30%（以纸浆的烘干重量计）。该稠度最好约为2%-12%。该混合物可用各种混合装置以不同的速度进行搅拌。然后按所要成品纸类型，用不同方法处理纸浆。
在本发明的一个优选实施例中，由变铅青链霉菌66产生的胞外高活性内-木聚糖酶（本文称作木聚糖酶C）用阴离子交换色谱进行纯化，用上述Morosoli等人，Biochem.J.，239，587，1986的DNA方法测定它在得自桦木或燕麦属斯佩尔特小麦的木聚糖中的活性。编码生成木聚糖酶C的基因也能用多复制载体PIJ702通过负木聚糖酶和负纤维素酶突变体的功能互补进行克隆。新克隆，一旦在发酵罐内生长，就会产生胞外木聚糖酶C，但未检测到纤维素酶。按BioRadTM的蛋白质测定方法，测得新酶的活性为45450IU/mg已纯化蛋白质。该酶活性的极大提高超过至今报导的所有其它木聚糖酶。
这种新酶可用于漂白实验中，并能与称作木聚糖酶A的低比活性内-木聚糖酶类酶相比较，如Morosoli等人的Biochem.J.，239，587，1989所述，木聚糖酶A也可用变铅青链霉菌66表示，它具有的活性为733IU/mg已纯化酶，在现有技术中，这是典型的酶。
意想不到的是，木聚糖酶C与低比活性酶相比，能使纸浆的木质素含量降至更低值，即其用量为0.0019mg酶/g已处理纸浆，与之相比，低比活性内-木聚糖酶（木聚糖酶A）的用量为0.12mg酶/g已处理纸浆。这样，木聚糖酶C酶与木聚糖酶A（两者均得自变铅青链霉菌）相比效率提高61倍。
高活性内-木聚糖酶的纯化方法及其特征如下。将变铅青链霉菌66菌株保持在用过7天的琼脂斜面培养物中，它含有改性的酵母一提取麦芽-提取介质，其中葡萄糖用0.4%的麦芽糖取代。由这种斜面培养制备的孢子悬浮液可用作接种物以用于胰蛋白酶大豆肉汤（Trypticase Soy Broth）中的营养培养（TSB）（Difco Laboratories，Detroit，MI）。在34℃，在旋转振荡器中以240转/分的速率使该瓶状培养物保温24-30小时。
在含有100ml M-13培养基的500ml锥形烧瓶中，如Bertrand等人（Biotechnol，Bioeng.，33，791，1989）所述，用1%得自燕麦属斯佩尔特小麦的木聚糖作主要碳源可进行酶的生产。接种物规格为5%的营养TSB培养物，培育时间定为72小时。在转速为11000g的Beckman J2-21离心机中离心发酵肉汤，从上清液中回收粗酶。用三倍体积的冷乙醇从该上清液中沉淀木聚糖酶C。沉降过夜后，以11000g转速通过离心回收沉淀。
回收沉积的粗酶，用丙酮充分洗涤，在真空下干燥过夜。用这种方法得到的干燥粉末可在4℃下贮存数月不会失去活性。为纯化木聚糖酶C，将制得的30克粗酶慢慢搅拌10分钟，使其溶于PH为7.4的500ml 50mM磷酸钠缓冲液中，再以11000g转速离心以除去残余的未溶解物。
该溶液于冰上冷却，用45%硫酸铵沉淀可得到木聚糖酶C部分。使该沉淀再溶于磷酸钠缓冲液中，在玻璃管中以蒸馏水为对照进行透析，同时切下6000-8000Da，于100℃下，用1mMEDTA和2%碳酸氢钠处理10分钟。该酶溶液通过冷冻干燥而浓缩，再溶于PH为8.5的20mM Tris-HCl缓冲液中，经AcroTM0.2μm可自由使用的过滤装置（Gelman Sciences，inc.，Ann Arbor MI）进行过滤。使滤液直接吸附在阴离子交换DEAE蛋白质Pak 5 Pw半-制备H.P.L.C柱（Waters-Millipore Inc.，st.Laurent，Que）上，该柱用相同的Tris-HCl缓冲液平衡。用呈线性梯度的1M NaCl进行淋洗，用280nm的U.V记录器进行监测。收集各馏份，用Remazol亮兰测定酶的活性（Kluepfel，RBB法，在Enzymology，Vol，160，P180，1988中的各方法）。收集活性馏份，在4℃对照水透析65小时。将该含水溶液冷冻干燥后回收纯酶。为检验同质性，使酶通过用PH6.0的0.1M乙酸铵平衡过的两种Superose 6TM凝胶柱。胞外高活性木聚糖酶C的表观Mr为22000道尔顿，PI超过10.5。该蛋白质明显未糖基化。
用得自桦木（Sigma chem.Co.，St.Louis，MO）的溶于50mM柠檬酸钠缓冲液的木聚糖测定酶的活性，用二硝基水杨酸（DNS）法测定还原糖。
所有酶活性均用国际单位（IU）表示，1单位定义为1分钟内释放1μmol还原糖（用木糖表示）的酶量。
含高活性内-木聚糖酶C的变铅青链霉菌（PIAF20）是通过用变铅青链霉菌10-164、负木聚糖酶和负纤维素酶突变体（用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍使野生型菌株1326突变而得到）中功能互补的多复制载体PIJ702克隆变铅青链霉菌66（菌株1326）的xln C基因而得到的。通过在含木聚糖的陪氏平板上形成透明区可检测含木聚糖C的克隆变铅青链霉菌（PIAF20）。用Kendall和Cullum的碱法（Gene;29，315，1984）纯化质粒DNA，用Thompson等人的微量分析方法（Mol.Gen.Genet.;195，39，1982）分析杂交质粒。克隆后得到的重组质粒含有长度为7.5kb的大DNA插入物。亚克隆和编序实验使该基因更精确地固定在Pst1-BamH1片段上。
现在仅通过实施例来说明杂交质粒的构建及用高活性木聚糖酶处理木质纤维材料的方法，参见下面实施例。
实施例1
按下列程序制备生产A木聚糖酶的克隆。
按Hopwood等人的方法（Genetic Manipulation of Streptomyces，A laboratory manual.，The John Innes Foundation，Norwich，UK1985）从变铅青链霉菌66（菌株1326）中提取染色体DNA。用Tris-硼酸盐-EDTA缓冲液进行限制性片段的琼脂糖凝胶电泳（Maniatis等人.，Molecular cloning，A Laboratory Manual，Cold spring Harbor，New York，1982），Soutnern印迹和杂交条件如Hopwood等人所述（1985）。然后用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍使变铅青链霉菌菌株1326突变（Delic等人.，Mutation Res.;9，167（1970），选出双突变体β-1，4-D-葡聚糖的负葡聚糖水解酶（内纤维素酶）和负木聚糖酶。在含1%羧甲基纤维素作主要碳源的固体基本培养基中选择该双突变体。
按Teather和Wood的Congo Red染色法完成内纤维素酶活性的检验（Appl Environ Microbiol.;43，777 1982）。用同样方法（只是羧甲基纤维素用1%燕麦属斯佩尔特小麦木聚糖代替）可检测负-木聚糖酶突变体。已发现Congo Red染色也能用于检测木聚糖酶活性。在两种情况下，认为不存在脱色区就表示没有酶产生。
已发现双突变体（称为变铅青链霉菌10-164）是很稳定的，看来能得到最高转化效率。因此选它作寄主微生物用以发育的表达体系。双突变体变铅青链霉菌10-164的原生质体化（Protoplasting）和转化是按Chater等人所述方法进行的（Curr.Topics Microbiol Immunol.，97，69，1982）。
选择产生A木聚糖酶的克隆，并称为变铅青链霉菌（PIAF20）。其限制性图谱和Southern印迹以及DNA杂交均表明它不同于以前报道的木聚糖酶A和木聚糖酶B基因（分别参见Mondou等人，Gene：49，323，1986和Vats-Mehta等人，Gene;86，119，1990）。对于木聚糖酶B的情况，有关野生型变铅青链霉菌菌株1326的早期研究未揭示其上清液中存在木聚糖酶C。
它在该菌株中的生物合成仅用Western印迹即可证实，只要使用抗-（木聚糖酶C）抗体，该抗体在含有酶的兔中产生，该酶是从克隆变铅青链霉菌〔PIAF20〕的培养滤液分离的。
实施例2
xln C基因是在质粒PIAF20中的2.3Pst1片段上被克隆的。标准DNA重组技术和克隆成M13噬菌体如Hopwood等人（1985）和/或Maniatis等人（1982）所述。将感兴趣的片段亚克隆成M13mp18或M13mp19噬菌体。
Nt顺序测定是按Sanger等人的链一终止二脱氧法进行的（Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A;74，5463，1977），使用由Dale等人的方法所得到的插入物的缺失片段（Plasmid;13，31，1985）。用即时合成的低聚核苷酸作引物，用7-deaza-dGTP减弱谱带压缩。采用国际生物技术公司（New Haven，Connecticut，U.S.A）的Pustell顺序分析程序进行DNA顺序的计算机分析。
如上所述，木聚糖酶C DNA顺序如表1所示。
实施例3
用两种重组变铅青链霉菌克隆的上清液处理牛皮硬木纸浆样品，该上清液分别含有由xln C基因产生的高活性内-木聚糖酶和由xln A基因产生的低活性内-木聚糖酶（两种基因均得自变铅青链霉菌和两种B-1，4-D-木聚糖的木聚糖水解酶EC3.2.1.8）。
处理条件如下：
起始卡伯数：13.5
酶用量：木聚糖酶A为0.116mg/g纸浆
木聚糖酶C为0.0019mg/g纸浆
将处理过的样品和对照样品（各为5gO.D）悬浮在PH为6.0的83.3ml4.5mM柠檬酸/16mM磷酸盐缓冲液中，并于50℃下，在转速为300转/分的旋转振动器中保温2小时。当木聚糖酶处理完成时，用蒸馏水洗涤纸浆样品。用标准TAPPI检测法测定表示去木质作用的卡伯数。结果与未处理纸浆的卡伯数一起列于表2中。用只经缓冲液处理的纸浆样品作对照。
表2：在牛皮纸浆处理中木聚糖酶A和C的比较
处理 卡伯值
原始纸浆 13.5
缓冲液空白对照 12.3
12.4
木聚糖酶A 10.3
10.3
木聚糖酶C 9.6
9.8
由此证明用量（IU/g纸浆）相同的两种酶，对于木质素含量（以测得的卡伯值计）降低的作用大致相同。然而，所需木聚糖酶C的重量明显低于所需木聚糖酶A的量
实施例4
硬木牛皮纸浆先用85IU/g的木聚糖酶A进行处理，然后用DcEoDED程序漂白。酶处理条件为：稠度6%，温度50℃，处理时间2小时，PH5.5-6.0，作为对照，将相同纸浆的未处理物用相同程序进行漂白以达到相同的白度。漂白和生物漂白工序所用条件列于表3中。
表3：漂白条件
非酶处理条件 Dc*Eo D E D
进料(按纸浆%计) 2.4 0.4 1.2 0.6 0.4
稠度(以W/W%计) 3.5 10 10 0.6 10
温度(℃) 50 65 80 65 80
时间(分) 20 60 75 60 75
酶处理
条件 Dc*Eo D E D
进料(按纸浆%计) 1.3 0.4 1.2 0.6 0.4
稠度(以W/W%计) 3.5 10 10 0.6 10
温度(℃) 50 65 80 65 80
时间(分) 20 60 75 60 75
＊ 用-70%ClO2;30%Cl2代替
氯进料从0.86降至0.36，二氧化氯进料从2.36降至1.01。
近来的研究已连系到伴随化学品进料，尤其是氯，所生成的Aox（可吸收的有机卤化物）的量。Aox是工业上测定漂白工厂废水中氯化有机物含量认可的标准度量。这类化合物与环境毒性有关，并且认为废水中所含Aox的浓度与漂白工艺中所用氯化漂白化合物的量直接有关。目前，全球共同目标在于制定最大允许限度以降低现有浓度。因此，降低Aox的方法是合乎需要的。
可按Reeve，D.W.和Earl.P.I.提出的下列方程式（Proc.Tappi Environ Conf，Atlanta，P.385，1989）计算生成的Aox量：
Aox＝0.1（Cl2+0.526＊ClO2）kg Cl/te纸浆
因此，对于酶处理的纸浆继之以程序DcEoDED（其中Dc是用30%氯代替的二氧化氯步骤，E是碱提取步骤）而言，Aox用量为0.89kg Cl/te纸浆，而对非酶处理纸浆而言，Aox用量为2.10kg Cl/te。所以，使用木聚糖酶会导致Aox用量降低2倍以上。
实施例3清楚说明，本发明可用于降低漂白剂的总消耗量及其后的Aox浓度。
包含质粒PIJ702的变铅青链霉菌3131寄存在美国典型培养物收集中心，登记号为ATCC35287。变铅青链霉菌1326和双突变体菌株变铅青链霉菌10-164寄存于国家工业和海生细菌收集有限公司，Aberdeen，UK，1990，2.8，登记号分别为NCIMB40257和NCIMB40258。
上面已描述了本发明的具体实施例，应该明白，本领域技术人员可提出各种变更，但所有这些变更将落在所附权利要求的范围内。