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1、(10)申请公布号 CN 103038692 A (43)申请公布日 2013.04.10 C N 1 0 3 0 3 8 6 9 2 A *CN103038692A* (21)申请号 201180031152.2 (22)申请日 2011.06.17 10305676.8 2010.06.24 EP G02B 21/24(2006.01) (71)申请人皇家飞利浦电子股份有限公司 地址荷兰艾恩德霍芬 (72)发明人 B胡什肯 (74)专利代理机构永新专利商标代理有限公司 72002 代理人王英 刘炳胜 (54) 发明名称 基于差分测量的自动聚焦 (57) 摘要 本发明涉及数字病理学领域，并且。
2、具体而言 涉及全载片扫描器。倾斜的自动聚焦图像传感器 将所述载片的斜截面成像。为了聚焦，比较由倾斜 的传感器得到的多个顺序交叠图像。可以从由这 种差分测量得到的极误差信号确定组织层的轴向 位置。 (30)优先权数据 (85)PCT申请进入国家阶段日 2012.12.24 (86)PCT申请的申请数据 PCT/IB2011/052641 2011.06.17 (87)PCT申请的公布数据 WO2011/161594 EN 2011.12.29 (51)Int.Cl. 权利要求书2页 说明书9页 附图7页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 2 页 说明书 9 。
3、页 附图 7 页 1/2页 2 1.一种用于显微镜系统的自动聚焦成像系统，所述自动聚焦成像系统包括： 图像传感器装置（24，26），其用于采集感兴趣对象（4）的初级图像数据以及所述感兴 趣对象（4）的斜切面的第一自动聚焦图像数据和第二自动聚焦图像数据； 其中，所述图像传感器装置包括倾斜的图像传感器（26），所述倾斜的图像传感器（26） 被配置为采集所述第一自动聚焦图像数据，并且，在随后的时间采集所述第二自动聚焦图 像数据； 计算单元（800），其用于基于与所述第一自动聚焦图像数据相关的第一数据和与所述 第二自动聚焦图像数据相关的第二数据的比较，生成所述显微镜系统的焦点位置的极性误 差信号。 2。
4、.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统， 其中，所述图像传感器装置包括： 初级图像传感器（24），其用于采集所述感兴趣对象（4）的所述初级图像数据；以及 倾斜的自动聚焦图像传感器（26），其用于采集所述感兴趣对象（4）的斜切面的所述第 一自动聚焦图像数据，并且在随后的时间采集所述感兴趣对象（4）的所述第二自动聚焦图 像数据。 3.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统，其中，所述比较包括： 在所述第一数据中将第一对比度确定为所述自动聚焦图像传感器上的x位置的函数， 以及在所述第二数据中将第二对比度确定为所述自动聚焦图像传感器上的x位置的函数； 比较第一对比度函数和第二对比度函数。 4.如权利要求1所。
5、述的自动聚焦成像系统， 其中，在所述感兴趣对象（4）从采集所述第一自动聚焦图像数据的第一位置平移至第 二位置后，采集所述第二自动聚焦图像数据。 5.如权利要求3所述的自动聚焦成像系统， 其中，针对比较所述第一对比度函数和所述第二对比度函数，所述计算单元（800）适于 针对所述感兴趣对象（4）的平移校正所述第二对比度函数，并且适于之后使两个对比度函 数、或所述两个对比度函数的经滤波的或经变换的版本彼此相减，得到S曲线。 6.如权利要求5所述的自动聚焦成像系统， 其中，针对生成所述极性误差信号，所述计算单元（800）适于确定所述S曲线的零交 点。 7.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统，还适于在确。
6、定最佳焦点位置后，执行所述 焦点位置的反馈或前馈控制。 8.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统， 其中，所述自动聚焦图像传感器（26）关于透镜的光轴（31）倾斜，所述透镜将从所述感 兴趣对象（4）辐射的辐射聚焦至所述自动聚焦图像传感器（26）上。 9.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统， 其中，所述初级图像传感器（24）为线传感器；并且 其中，所述自动聚焦图像传感器（24）为二维传感器。 10.如权利要求1所述的自动聚焦成像系统， 其中，所述初级图像传感器（24）和所述倾斜的自动聚焦传感器（26）的功能由一个物 权 利 要 求 书CN 103038692 A 2/2页 3 理图像传感器提供，所。
7、述物理图像传感器关于所述光轴倾斜。 11.一种显微镜系统（802），其包括如权利要求1所述的自动聚焦成像系统（500）。 12.一种用于显微镜系统（802）的自动聚焦成像的方法，所述方法包括如下步骤： 通过图像传感器装置采集感兴趣对象（4）的初级图像数据； 通过所述图像传感器装置的倾斜的自动聚焦图像传感器（26）采集所述感兴趣对象 （4）的斜切面的第一自动聚焦图像数据，以及在稍后的时间采集所述感兴趣对象（4）的斜切 面的第二自动聚焦图像数据； 基于与所述第一自动聚焦图像数据相关的第一数据和与所述第二自动聚焦图像数据 相关的第二数据的比较，生成所述显微镜系统的焦点位置的极性误差信号。 13.如权。
8、利要求12所述的方法，其中，所述比较包括： 在所述第一数据中将第一对比度确定为所述自动聚焦图像传感器上的x位置的函数， 以及在所述第二数据中将第二对比度确定为所述自动聚焦图像传感器上的x位置的函数； 比较第一对比度函数和第二对比度函数。 14.如权利要求13所述的方法，其中，比较所述第一对比度函数和所述第二对比度函 数的步骤包括： 通过使两个对比度函数、或所述两个对比度函数的经滤波的或经变换的版本彼此相 减，确定S曲线； 通过确定所述S曲线的零交点生成所述极性误差信号。 15.一种用于显微镜系统的自动聚焦成像的程序单元，所述程序单元当被所述显微镜 系统（802）的处理器（800）运行时，令所述。
9、处理器执行如下步骤： 通过初级图像传感器装置采集感兴趣对象（4）的初级图像数据； 通过所述图像传感器装置的倾斜的自动聚焦图像传感器（26）采集所述感兴趣对象 （4）的斜切面的第一自动聚焦图像数据，以及在稍后的时间采集所述感兴趣对象（4）的斜切 面的第二自动聚焦图像数据； 基于与所述第一自动聚焦图像数据相关的第一数据和与所述第二自动聚焦图像数据 相关的第二数据的比较，生成所述显微镜的焦点位置的极性误差信号。 权 利 要 求 书CN 103038692 A 1/9页 4 基于差分测量的自动聚焦 技术领域 0001 本发明涉及数字病理学领域和快速显微扫描的其他领域。具体而言，本发明涉及 一种用于显微。
10、镜的自动聚焦成像系统、一种包括自动聚焦成像系统的显微镜、一种用于显 微镜的自动聚焦成像的方法、一种计算机可读介质以及一种程序单元。 背景技术 0002 在数字病理学中，并且特别是在全载片扫描的情况下，将样品切片并成像以用于 分析的目的以及教学的目的。可以使用线传感器扫描整个组织载片。这些载片扫描器可以 执行连续的机械扫描，因而减少了接合问题，并且允许使用所谓的时间延迟积分（TDI）线传 感器以适应低亮度的光照，例如在WO 01/84209A2中所公开的。 0003 在实际扫描之前，可以在载片上的多个位置处确定最佳焦点位置。这产生了“焦点 图”。当组织层的轴向位置遍及载片可能存在几个微米的变化时。
11、，可以使用这种程序，如图1 中所描绘（为避免任何疑惑，在此应该指出，术语轴向在本文中指代沿图2中示出的轴7的 方向）。 0004 组织层的变化因而可能大于显微镜物镜的焦点的深度。在扫描期间，物镜的焦点 位置被设置在这样的轨迹上：该轨迹插入到所选测量位置上的测量的最佳焦点设置之间。 然而，这一程序可能既易于产生误差又耗费时间，因此限制了该系统的吞吐量。 0005 在已知的自动聚焦成像系统中，可能不能确定焦点误差的正负（高于或低于焦 点），即，焦点误差信号可能不是极性的。这可能不利于需要持续更新最优焦点设置的连续 自动聚焦系统。 0006 WO 2005/010495A2描述了一种系统和一种方法，。
12、其用于生成显微镜载片的数字图 像，所述显微镜包括主相机和关于光轴倾斜的聚焦相机。 发明内容 0007 期望能有一种改进的自动聚焦功能的扫描显微镜。 0008 根据本发明的第一方面，提供一种用于显微镜系统的自动聚焦成像系统，所述自 动聚焦成像系统包括图像传感器装置，所述图像传感器装置用于采集感兴趣对象的初级 图像数据以及感兴趣对象的斜切面的第一自动聚焦图像数据和第二自动聚焦图像数据，其 中，所述图像传感器装置包括倾斜的图像传感器，所述倾斜的图像传感器适于采集第一自 动聚焦图像数据，并且，在稍后的时间采集第二自动聚焦图像数据。所述系统还包括计算单 元，所述计算单元用于基于与第一自动聚焦图像数据相关。
13、的第一数据和与第二自动聚焦图 像数据相关的第二数据的比较，生成所述显微镜系统的焦点位置的极性误差信号。 0009 根据示范性实施例，所述图像传感器装置包括：初级图像传感器，其用于采集感兴 趣对象的初级图像数据；以及倾斜的自动聚焦图像传感器，其用于采集第一自动聚焦图像 数据，并且在稍后的时间采集感兴趣对象的斜切面的第二自动聚焦图像数据。 0010 换言之，所述自动聚焦成像系统包括初级图像传感器和自动聚焦图像传感器，所 说 明 书CN 103038692 A 2/9页 5 述自动聚焦图像传感器（或所述初级图像传感器和所述自动聚焦图像传感器两者）被布置 为不与透镜的光轴（在下文也称为“辐射的光轴”或。
14、“初级图像传感器的光轴”）垂直，而是关 于所述光轴倾斜，所述透镜将从感兴趣对象行进至所述自动聚焦图像传感器的辐射聚焦到 自动聚焦图像传感器上。这种倾斜的自动聚焦图像传感器采集一序列自动聚焦图像数据， 每个自动聚焦图像在另一时间并且因而在感兴趣对象（其在成像过程中移动）的另一位置 处采集。 0011 另一实施例为所述初级图像传感器和所述自动聚焦图像传感器的功能实际组合 为单个物理传感器，所述物理传感器关于上述光轴倾斜。这种传感器必须是某种形式的2D 图像传感器，在所述传感器上使用全部像素或像素的子集来生成所述自动聚焦图像数据， 而使用另一潜在交叠的集合来生成所述初级图像数据。像素的这两个集合可以。
15、是同时捕获 的不同物理像素，或者是顺序捕获的部分相同像素。或者是两者的组合。关于这样的将成 像和自动聚焦功能相组合的传感器如何实现和使用的更多细节，读者可以参 考欧洲专利 申请N09306350，在本文通过引用将其并入。 0012 然后执行与第一自动聚焦图像数据相关的第一数据和与第二自动聚焦图像数据 相关的第二数据的比较。这种第一和第二数据可以分别是：原始采集的第一自动聚焦图像 数据和第二自动聚焦图像数据；或者是这种图像数据的变换，或者是从第一自动聚焦图像 数据和第二自动聚焦图像数据导出的度量。 0013 根据示范性实施例，所述比较包括在第一数据中确定第一对比度函数以及在第二 数据中确定第二对。
16、比度函数。第一对比度函数和第二对比度函数两者均为在所述自动聚焦 图像传感器上的x位置的函数。之后，将所述第一对比度函数与所述第二对比度函数比较。 0014 根据另一示范性实施例，所述计算单元适于针对感兴趣对象的平移校正所述第二 对比度函数并且适于使两个对比度函数（或者两个对比度函数的经滤波或经变换的版本） 彼此相减，因而得到S曲线。 0015 换言之，根据这一实施例，所述第一对比度函数与所述第二对比度函数的比较包 括从与所述第二对比度函数相关的第二数据中减去与所述第一对比度函数相关的第一数 据，其中，在执行相减之前，已经针对平移校正了所述第一对比度函数或者所述第二对比度 函数中的一个。 001。
17、6 根据另一示范性实施例，所述计算单元确定所述S曲线的零交点，用于生成所述 极性误差信号。 0017 由于所述S曲线包括比所述第一自动聚焦图像数据和第二自动聚焦图像数据更 少的高频细节，因而所述S曲线零交点的确定可以高精度地执行，因而使得能够高精度地 确定所述极性误差信号。 0018 根据另一示范性实施例，所述自动聚焦成像系统适于执行所述焦点位置的反馈或 前馈控制，用于最佳焦点位置的确定。 0019 根据本发明的第二方面，提供一种显微镜，其包括以上和以下描述的自动聚焦成 像系统。 0020 根据本发明的示范性实施例，所述显微镜适配为用于数字病理学的载片扫描器。 0021 根据本发明的另一方面，。
18、提供一种用于显微镜系统的自动聚焦成像的方法，其中， 通过初级图像传感器装置采集感兴趣对象的初级图像数据。 此外，通过所述图像传感器装 说 明 书CN 103038692 A 3/9页 6 置的倾斜的自动聚焦图像传感器采集感兴趣对象的斜切面的第一自动聚焦图像数据，并且 在稍后的时间采集感兴趣对象的斜切面的第二自动聚焦图像数据。之后，基于与所述第一 自动聚焦图像数据相关的第一数据和与所述第二自动聚焦图像数据相关的第二数据的比 较，生成所述显微镜系统的焦点位置的极性误差信号。 0022 根据本发明的另一方面，提供一种计算机可读介质，在所述计算机可读介质中存 储了用于显微镜系统的自动聚焦成像的计算机程。
19、序，所述计算机程序当被显微镜系统的处 理器运行时，令所述处理器执行以上和/或以下描述的方法步骤。 0023 此外，根据本发明的另一实施例，提供一种用于显微镜系统的自动聚焦成像的程 序单元，当所述程序单元被显微镜系统的处理器运行时，令所述处理器执行上文和/或下 文描述的方法步骤。 0024 计算机可读介质可以是软盘、硬盘、CD、DVD、USB（通用串行总线）存储设备、RAM （随机存取存储器）、ROM（只读存储器）和EPROM（可擦除可编程只读存储器）。计算机可读 介质也可以是数据通信网络，例如互联网，其允许下载程序代码。 0025 可以将以下视为本发明的示范性实施例的主旨：提供一种用于快速载片。
20、扫描的连 续自动聚焦的系统，所述系统基于关于光轴倾斜的附加的图像传感器。这种自动聚焦图像 传感器对所述载片斜截面成像。为了聚焦，执行由倾斜的自动聚焦图像传感器获取的多个 顺序交叠图像的比较。可以由通过这种差分测量得到的极性误差信号确定组织层的轴向位 置。 附图说明 0026 图1示出了组织载片组件的横截面。 0027 图2示出了组织载片组件的斜截面。 0028 图3示出了深度范围与自动聚焦图像传感器的倾斜角度之间的关系。 0029 图4A和4B示出了由自动聚焦传感器生成的两个顺序图像。 0030 图4C和4D示出了由计算单元生成的相应的对比度曲线。 0031 图5示出了根据本发明的示范性实施例。
21、的具有自动聚焦成像系统的显微镜。 0032 图6示出了根据本发明的另一示范性实施例的具有自动聚焦成像系统的显微镜。 0033 图7示出了根据本发明的另一示范性实施例的具有自动聚焦成像系统的显微镜。 0034 图8示出了根据本发明的示范性实施例的显微镜系统。 0035 图9示出了根据本发明的示范性的实施例的方法的流程图。 0036 附图标记列表 0037 1显微镜载片 0038 2盖片 0039 3封固剂 0040 4组织层 0041 5斜截面 0042 6扫描方向 0043 7轴向方向 0044 14激光二极管 说 明 书CN 103038692 A 4/9页 7 0045 15两个交叉的光栅。
22、 0046 16视场光阑 0047 17准直透镜 0048 18用于阻挡第0级光线的光阑 0049 20物镜 0050 21后孔径 0051 22分色器 0052 23管透镜 0053 24第一初级图像传感器 0054 25管透镜 0055 26自动聚焦图像传感器 0056 28分光镜 0057 29四分之一波片 0058 31光轴 0059 32第二初级图像传感器 0060 33第三初级图像传感器 0061 301自动聚焦传感器倾斜角 0062 302z-范围 0063 303曲线 0064 401图像上的x位置 0065 402信号值 0066 403低水平算法的结果 0067 404低水。
23、平算法的结果 0068 405S曲线 0069 406零交点 0070 500自动聚焦成像系统 0071 800处理器 0072 801用户接口 0073 802显微镜系统 0074 901方法步骤 0075 902方法步骤 0076 903方法步骤 0077 904 方法步骤 具体实施方式 0078 附图中的图示为示意性的。在不同附图中，为相似或相同的元件提供同样的附图 标记。在下文中，关联到符号的字符单引号（）将意味着考虑图像空间（例如，传感器参考）， 而没有字符单引号的符号将意味着考虑对象空间（通常是样品参考）。例如，当在本说明书 中使用角度Beta单引号（）时，将指示在图像空间中的旋转。
24、，以及如将要更加具体地描 述地，将指示物理传感器的旋转。另外，角度Beta（没有单引号的）将指示对象空间中的 说 明 书CN 103038692 A 5/9页 8 旋转，以及如将要更加具体地描述地，由自动聚焦传感器成像的样品的斜截面的旋转。 0079 图1示出了组织载片组件的示意性横截面，所述组织载片组件包括厚 度通常 为1mm的显微镜载片1，厚度通常为0.17mm的盖片2，用于固定和密封组织层4的封固剂 （mounting medium）3。所述组织层厚度通常为大约5m，封固层包括所述组织层并且厚度 通常为10-15m。在盖片附着于所述载片之前，所述封固剂可以以液态形式应用到载有组 织层的所。
25、述载片，随后所述封固剂固化，因而机械地固定所述组织层并且将其从外界环境 密封出来以提供稳定性而防止变质。所述组织层的轴向位置可以遍及所述载片在几个m 内变化。 0080 为在扫描过程中提供最佳分辨率，可能需要连续地调节焦点，因为所述组织层的 轴向位置是变化的。 0081 使用“焦点图”方法的一种替代是使用连续的自动聚焦系统，即，一种附加的系统， 其在用于采集数字图像的实际扫描中连续地测量最佳焦点位置并且调整物镜的轴向位置。 所述自动聚焦系统可以基于优化所获得的图像中的对比度。可以使用多种度量来优化对比 度。然而，焦点误差的符号（高于或低于焦点）不能以这种方式确定，即，焦点误差信号不是 极性的。。
26、这对于需要持续更新最佳焦点设置的连续自动聚焦系统是不利的。 0082 所述自动聚焦系统可以使用在处于或接近对象平面的参考表面处反射的线，如在 光盘中那样。然而，当应用于组织载片时，这种方法的缺点可能是：相关界面（显微镜载片与 组织层之间，以及组织层与盖片之间）可能具有低的反射率，以致由邻近组织层引起的散射 使反射信号失真，因而牺牲了鲁棒性。 0083 一种良好的代替是使用附加的传感器，所述附加的传感器关于光轴倾斜。这种自 动聚焦图像传感器对对象的斜切面成像，如图2中所图示。这一切面可以根据所述组织层 的轴向位置或相对于物镜聚焦平面，在某个点切过所述组织层。通过这种方式，所述组织层 在传感器上的。
27、位置为散焦量的度量。更多的细节读者可以参考欧洲专利申请09306350，在 此通过引用将其并入。 0084 如从图2中可以看出地，倾斜的自动聚焦图像传感器对所述组织载片组件的斜截 面5成像。倾斜在扫描方向6（即，方向x）上。传感器具有N x 个像素并且在扫描方向以每 个像素x以及在轴向方向7以每个像素z对对象采样。 0085 例如，所述自动成像系统使用在可见光谱外的波长运行从而不损坏所述组织层的 可见光成像。例如，所述自动聚焦系统使用可见光谱的红外区一侧的波长运行，因为紫外线 辐射可能损害组织并且可能需要比红外线辐射更复杂和/或更贵的光学部件。 0086 可以以多种方式提供附加的自动聚焦成像。。
28、一种可能是使用所谓的暗场照明。以 此方式，用包含一组传播方向的光束照射样品。 0087 所述自动聚焦系统的深度范围z 总 必须是足够大的以适于其他参数合适的设 置。所述自动聚焦图像传感器在扫描方向上具有N x 个像素，像素尺寸为b。传感器倾斜 的角度，使得由下面公式给出横向和轴向的采样： 0088 x=bcos 0089 z=bsin 0090 对象（组织载片）处的横向和轴向采样由以下公式给出： 0091 x=x/M 说 明 书CN 103038692 A 6/9页 9 0092 z=nz/M 2 0093 其中，M为放大率，并且n为对象的折射率。对象处的轴向采样现在遵循： 0094 0095。
29、 由于有N x 个像素，故总的深度范围为： 0096 0097 为了实现散焦敏感的高频信息的生成，对象处的横向采样x应该足够小。发现 最大散焦敏感度位于截止空间频率的一半处，所以x优选地处于0.5-1.0m的范围内， 即大约x=0.75m。采用像素尺寸为b=10m的VGA传感器（N x =640且N y =480像素），并 且使用折射率n=1.5，深度范围与传感器倾斜角度之间的关系如图3所示（见曲线303）。 0098 在图3中，水平轴301描绘了在0度到35度之间的所述自动聚焦传感器倾斜角， 并且垂直轴302描绘了在0微米到50微米之间的z范围。 0099 深度范围大致随每度倾斜角增加1m。。
30、深度范围优选地可以为大约20 m，因此 大约20度的适中的倾斜角是足够的。在那种情况中，轴向采样z大约为42nm，这是足够 小的而使得能够以亚m的精度找到组织层的轴向位置。 0100 看起来，为得到具有足够信噪比的散焦误差信号，并不需要全部的N y 行像素。原则 上，N y =1可以是足够的。然而，使用多行改进了信号的鲁棒性。如果所述传感器为CMOS传 感器，可以使用加窗（只读出受限制的数量的行），这对于计算负担和/或自动聚焦信号的测 量频率可以具有积极的影响。此外，窗的横向位置可以在每次扫描中调整，从而适应组织的 平均横向位置。例如，如果扫描区域包含组织区域的边缘，线传感器的一端对组织成像而。
31、另 一端不会。通过选择组织所处的场的一侧的窗口，仍可以获得良好的误差信号。替代地，可 以组合一个或多个线传感器，从而提供所述自动聚焦信号的一个或多个测量结果。 0101 为了检测散焦量，可以使用对在所述自动聚焦传感器上的图像中的清晰细节的量 进行量化的图像分析算法。可以使用两阶段算法：第一阶段算法检测由所述自动聚焦传感 器产生的在图像上的在给定时间的对比度的量。随后第二阶段算法，比较来自两个顺序图 像（不必是相邻帧的，一帧能够与几帧之前的帧比较）的第一阶段算法的结果，所述两个顺 序图像由所述自动聚焦传感器在显微镜下的对象正在被平移时获得。 0102 所述第一阶段低水平算法产生曲线，该曲线指示作。
32、为所述自动聚焦传感器上的x 位置的函数的在那一传感器上的图像中的细节的量。由于所述自动聚焦传感器关于x方 向倾斜，即相对于组织载片组件的前表面倾斜，因此对象中生成所述自动聚焦传感器图像 的深度也随所述传感器上的x位置而变化。因此，由所述第一阶段算法生成的对比度曲线 为在样品上的x位置的函数，也是样品的深度（z位置）的函数。这在图4A到4D中示出。 可以使用多种用于生成这样依赖细节的曲线的方法，其中，在此示出的方法是基于索贝尔 （sobel）边缘检测的。本发明并不专用于在所述第一阶段算法中使用的细节检测方法，其应 该适用于任何已知的方法。 0103 图4A和4B示出了由所述自动聚焦传感器在扫描（。
33、即样品沿x方向6的平移，见图 2）期间生成的顺序图像。在图4A和4B中的水平轴401描绘了在图像上的x位置，并且垂 说 明 书CN 103038692 A 7/9页 10 直轴402描绘了信号值，例如对比度。 0104 曲线403、404为低水平算法的结果，一条曲线针对一个图像。与曲线404对应的 图像相对于与曲线403对应的图像平移了大约60像素。曲线403、404清晰地示出了低水 平算法的结果既依赖对象关于所述自动聚焦传感器的x位置（高频细节，其在性质上是相 同的，但是左边图像相比于右边图像被平移），也依赖于对象关于所述自动聚焦传感器的z 位置（低频包络线，或多或少高斯的，大约在450处达。
34、到峰值）。 0105 所述第二阶段高水平算法，在校正样品的平移后，使来自所述第一阶段算法的两 个顺序结果（之后叫做聚焦曲线）彼此相减。这在图4C和4D中示出。将两顺序聚焦曲线相 减给出了图4D中示出的所谓的S曲线405，所述聚焦曲线如由所述第一阶段算法生成并且 在图4C中示出。所述S曲线的零交点406（在垂直线位置处）为样品的焦内位置。 0106 明显地，在所述聚焦曲线上呈现的高频细节不再呈现在所述S曲线中，所述高频 细节是图像的信息内容的结果。所述S曲线为稳定的信号，其不依赖于在显微镜中正在被 成像的对象的（局部）形态。可以针对由所述自动聚焦图像传感器生成的每帧生成S曲线， 并且最新S曲线的。
35、零交点指示了在时间T的理想焦点位置，时间T恰好处于所比较的两帧 的采集之间。 0107 换言之，这种两阶段方法明显地抑制了在所述聚焦曲线上呈现的高频噪声。因此， 可以在显微镜扫描动作期间提供高带宽极性焦点误差检测。 0108 所述自动聚焦信号的最大带宽由所述传感器的帧率确定。可以容易地获得现成的 提供200Hz的帧率的传感器。对于典型的快速扫描显微镜，在10mm/s，这意味着每50微米 一次聚焦测量。 0109 允许实时确定组织处于焦内的z位置的实施例，是高速图像传感器与FPGA处理器 的组合，或者是高速图像传感器与专用图像处理ASIC的组合。 0110 一旦确定了最佳焦点位置z 最佳 ，就可。
36、以实现反馈聚焦策略或者前馈聚焦策略。在 反馈的情况下，最佳焦点位置z 最佳 的检测理想地发生在恰好完成成像的位置和时间。基于 误差信号（期望焦点位置z 最佳 减去成像物镜实际焦点位置z 物镜 ），调整成像光学器件的焦点 位置z 物镜 。获取焦点位置z 最佳 的采样率会决定这样的反馈系统的最终带宽。通常可以获得 比采样率低10的因数的带宽。 0111 在所述自动聚焦传感器上成像的载片的倾斜的横截面在一条直线上与 物镜的焦 点平面相交。可能地，在所有上述实施例中，该直线在正向扫描方向上从由（TDI或非TDI） 线传感器成像的线偏移x的距离，从而x/v，（其中v为扫描速度）大于从所述自动聚焦 图像计。
37、算焦点误差信号所需的时间。这在前馈方案中有利地使用，在前馈方案中焦点位置z 最佳 的检测理想地发生在成像之前（及时）。另外，偏移x应该足够小使得所述自动聚焦图 像适配于物镜的视野内。前馈系统能够无限地快，然而，最大扫描速度受这样的事实限制： 焦点位置的确定必须在样品的特定区域的焦点位置测量被执行的时间与该相同区域被成 像的时间之间消逝的时间量内完成。另一限制因素为成像光学器件的焦点位置可被调整的 速度。 0112 作为非限制性的范例，图5显示了显微镜系统的部分，并且特别是光路的成像分 支。用于epi模式暗场照明的实施例在图6中示出。 0113 通过载片1和盖片2的光由物镜20以后孔径21捕获，。
38、其中，阻挡未散射的光。分 说 明 书CN 103038692 A 10 8/9页 11 色器22将由管透镜23成像至图像传感器装置上的白光分裂，所述图像传感器装置可以包 括第一初级图像传感器24、第二初级图像传感器32以及第三初级图像传感器33，其可适配 为线传感器的形式，以生成数字组织图像。红外光由第二管透镜25成像于自动聚焦图像传 感器26上，所述自动聚焦图像传感器26相对于从感兴趣对象到自动聚焦图像传感器26的 辐射的光轴31倾斜。在本公开的上下文中，“关于所述初级图像传感器的光轴倾斜”意味着 来自感兴趣对象撞击所述自动聚焦图像传感器的辐射并不垂直地撞击所述自动聚焦传感 器。然而，从感兴。
39、趣对象行进至所述初级图像传感器的辐射可以垂直地撞击到所述初级图 像传感器上，虽然并不需要这样。由组织散射的射线能够通过孔径21并且被成像至自动聚 焦图像传感器26上。 0114 图6示出了显微镜系统的用于epi模式暗场照明的光学布局，所述显微镜系统带 有具有激光二极管14的自动聚焦成像系统500，照明与成像分支集成。两个交叉的光栅15 布置在激光二极管14后以用于生成衍射级，例如第0衍射级S 0 ，第a+1级S +1 以及第a-1 级S -1 。而且，视场光阑16靠近光栅15布置以用于限制暗场照明束的宽度，并且准直透镜 17将来自激光二极管14的光线准直。 0115 提供偏振分光器28在光束穿。
40、过准直透镜17后将光束分裂。此外，所 述显微镜包 括四分之一波片29。元件28和元件29都负责将源于激光的光线引导至物镜，并且负责将 源于组织的散射光直射到所述自动聚焦图像传感器。 0116 图7示出了显微镜500的用于多光斑照明的光学布局，照明与成像分支集成。透 镜17将入射到光斑生成器上的光束准直以生成光斑的阵列30。通过使整个组件倾斜，光斑 阵列能够倾斜使得所得到的入射光斑阵列和载片也发生倾斜。光斑生成器29生成低NA光 束的阵列，所述低NA光束的阵列能够在不引入明显色差（aberration）的情况下穿过分光 器27。 0117 在图7的实施例中，使用光斑阵列照射由所述自动聚焦图像传感。
41、器成像的斜切面 5。当光斑聚焦的区域的吸收和折射率随扫描而变化时，聚焦在组织上的光斑可以经历时间 相关的散射。通过检查成像在所述自动聚焦图像传感器上的光斑的时间相关性，可以定位 组织层的轴向位置。也就是，靠近焦点，可以看到高分辨率信息，远离焦点，这是模糊的。结 果是，当组织层与聚焦平面一致时，相对较小的时间尺度上的信号变化可能是最大的。 0118 图8示出了显微镜系统802，其包括具有自动聚焦成像系统500的显微镜，所述自 动聚焦成像系统500连接至处理器或处理元件800，所述处理器或处理元件800连接至用户 接口801，例如计算机。 0119 图9示出了根据示范性的实施例的方法的流程图。在步。
42、骤901中，用初级图像传 感器装置采集感兴趣对象的初级图像数据。与此同时或之前，在步骤902中，第一自动聚焦 图像数据由倾斜的自动聚焦图像传感器采集。之后，在感兴趣对象平移后，在步骤903中， 感兴趣对象的斜切面的第二自动聚焦图像数据由倾斜的自动聚焦图像传感器采集（在该时 间，另一初级图像数据也能够由所述初级图像传感器采集（步骤904）。然后，在步骤905 中，基于对第一自动聚焦图像数据与第二自动聚焦图像数据的比较，生成所述显微镜的焦 点位置的极性误差信号。 0120 所描述的自动聚焦系统应用于数字病理学和其他快速显微扫描领域中。 0121 尽管所有实施例目前涉及两个独立的图像传感器，即，初级。
43、图像传感器和自动聚 说 明 书CN 103038692 A 11 9/9页 12 焦图像传感器，但是应该注意，如之前提到的，在额外的实施 例中，这两种传感器能够被一 个图像传感器替代，所述一个图像传感器提供了如两个独立的传感器相同的功能。这种组 合的传感器可以适配为一些类型的2D图像传感器，并且必须相对于光轴倾斜。如可以从欧 洲专利申请N09306350理解地，使用组合的传感器的全部像素或像素的子集来生成所述 自动聚焦图像数据，而使用另一潜在地交叠的集合来生成所述初级图像数据。像素的这两 个集合可以是同时捕获的不同的物理像素，或顺序捕获的部分相同像素，或两者的组合。作 为本实施例的实现方式的非。
44、限制性的范例，人们可以使用2D图像传感器，其中使用所有像 素生成所述自动聚焦图像数据，并且使用垂直于扫描方向的像素的单个行构成虚拟线传感 器，所述虚拟线传感器用于生成所述初级图像数据。 0122 尽管已经在附图和之前的描述中详细地说明和描述了本发明，但是这样的说明和 描述应被理解为是说明性的或示范性的，而并不是限制性的；本发明不局限于所公开的实 施例。实践所主张的本发明的本领域技术人员通过研究附图、公开以及所附权利要求将会 理解并实现所公开的实施例的其他变型。在权利要求中，词语“包括”不排除其他元件和步 骤，并且不定冠词“一”不排除多个。互不相同的从属权利要求中记载特定措施这一仅有事 实不表明。
45、不能有利地使用这些方法的组合。权利要求中的任何附图标记不应解释为限制范 围。 说 明 书CN 103038692 A 12 1/7页 13 图1 图2 说 明 书 附 图CN 103038692 A 13 2/7页 14 图3 图4A 说 明 书 附 图CN 103038692 A 14 3/7页 15 图4B 图4C 图4D 说 明 书 附 图CN 103038692 A 15 4/7页 16 图5 说 明 书 附 图CN 103038692 A 16 5/7页 17 图6 说 明 书 附 图CN 103038692 A 17 6/7页 18 图7 图8 说 明 书 附 图CN 103038692 A 18 7/7页 19 图9 说 明 书 附 图CN 103038692 A 19 。