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1、(10)申请公布号 CN 102818795 A (43)申请公布日 2012.12.12 C N 1 0 2 8 1 8 7 9 5 A *CN102818795A* (21)申请号 201210255748.7 (22)申请日 2012.07.23 G01N 21/64(2006.01) G02B 21/06(2006.01) G02B 21/36(2006.01) (71)申请人苏州生物医学工程技术研究所 地址 215163 江苏省苏州市高新区科技城科 灵路88号 (72)发明人张运海 张欣 黄维 昌剑 薛晓君 (54) 发明名称 生物荧光显微检测仪器 (57) 摘要 本发明提供的生物荧。
2、光显微检测仪器包括激 发光照明单元、激发光和荧光隔离单元、激光扫描 单元、显微成像单元、荧光探测单元及控制单元。 激发光照明单元的第一扩束镜及第二扩束镜之间 且位于第一扩束镜的焦点处设有照明针孔，荧光 探测单元的成像镜头和光电倍增管之间且位于成 像镜头的焦点处设有成像探测针孔，有效提高了 该仪器的横向分辨率；同时，在显微成像单元的 显微物镜入瞳的位置设置环形光束整形组件，提 高了该生物荧光显微检测仪器的轴向分辨率。 (51)Int.Cl. 权利要求书1页 说明书4页 附图2页 (19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 权利要求书 1 页 说明书 4 页 附图 2 页 1/1页。
3、 2 1.一种生物荧光显微检测仪器，其特征在于，包括激发光照明单元、激发光和荧光隔离 单元、激光扫描单元、显微成像单元、荧光探测单元及控制单元； 所述激发光照明单元包括激光光源、第一扩束镜、第二扩束镜；第一扩束镜、第二扩束 镜之间设有照明针孔，且所述照明针孔位于所述第一扩束镜的焦点处；所述激发光和荧光 隔离单元包括激发光滤色片、二色镜、荧光滤色片；所述激光扫描单元包括可绕X轴做往返 旋转运动的X扫描振镜组件、可绕Y轴做往返旋转运动的Y扫描振镜组件；所述显微成像单 元包括扫描透镜、筒镜、环形光束整形组件、显微物镜，所述环形光束整形组件包括设于所 述显微物镜的入瞳位置的环形滤光片，所述环形滤光片具。
4、有将激光截止的内环区域和透射 激光的环带区域，该内环区域和环带区域均可透射荧光；所述内环区域的半径不小于刚好 能发生全内反射时所述显微物镜入瞳位置的临界半径；所述显微物镜的入瞳位置与所述X 扫描振镜组件的反射面和Y扫描振镜组件的反射面沿光轴线的中间位置相共轭；所述荧光 探测单元包括成像镜头、光电倍增管，该成像镜头与所述光电倍增管之间设有成像探测针 孔，所述成像探测针孔位于所述成像镜头的焦点处；待观察对象与所述照明针孔和成像探 测针孔处于共轭位置上；所述光电倍增管可探测荧光，并将所述荧光转换成电信号； 所述第一扩束镜、照明针孔、第二扩束镜、激发光滤色片、二色镜、激光扫描单元、扫描 透镜、筒镜、环。
5、形滤光片及显微物镜依次沿始于所述激光光源的光轴线设置，且所述显微物 镜、环形滤光片、筒镜、扫描透镜、激光扫描单元、二色镜、荧光滤色片、成像镜头、成像探测 针孔及光电倍增管依次沿始于由待观察对象激发的荧光光轴线设置； 所述控制单元与激光扫描单元、光电倍增管均电性连接，用于同步采集所述电信号与 所述激光扫描单元的位置坐标并进行关联，以生成待观察对象区域图像。 2.根据权利要求1所述的生物荧光显微检测仪器，其特征在于，所述环带区域的宽度 可调节。 3.根据权利要求1所述的生物荧光显微检测仪器，其特征在于，所述显微物镜为无穷 远消像差型大数值孔径的浸油物镜。 4.根据权利要求1所述的生物荧光显微检测仪。
6、器，其特征在于，所述控制单元还与所 述激光光源电性连接，用于控制激光的波长和功率。 权 利 要 求 书CN 102818795 A 1/4页 3 生物荧光显微检测仪器 技术领域 0001 本发明涉及显微检测仪器设计及制造领域，尤其是涉及一种生物荧光显微检测仪 器。 背景技术 0002 全内反射显微成像技术和共聚焦显微成像技术各有优缺点：全内反射显微成像具 有很高的轴向分辨率，但其横向分辨率较低；共聚焦显微成像具有很高的横向分辨率，但其 轴向分辨率较差。如何在一台显微镜中同时利用全内反射显微成像高的轴向分辨率和共聚 焦显微成像高的横向分辨率尤为重要。 0003 发明专利申请CN201080024。
7、155.9中提出了将全内反射荧光图像和共焦图像简单 且正确地重合的图像处理装置、程序和显微镜，该发明中包含了两套显微镜，一套是全内反 射显微镜，另一套是共聚焦显微镜，但两套显微镜是分开工作的，通过光路切换的方法先获 得一套显微镜的图像，再获得另一套显微镜的图像，最后计算机再利用两套图像中的基准 点将两套图像进行了重合。该方法虽然生成了全内反射荧光图像和共焦图像的重合图像， 由于两种显微镜是先后工作的，在物理上并不能同时得到三维高分辨率图像；另外该发明 要先后操作两个显微镜拍摄图像，并要对图像进行重合，显微镜结构比较复杂，控制系统的 构成也比较复杂。 发明内容 0004 本发明的目的是：提供一种。
8、集成全内反射显微成像技术和共聚焦显微成像技术的 生物荧光显微检测仪器，该生物荧光显微检测仪器在横向及轴向上具有很高的分辨率。 0005 本发明的技术方案是：生物荧光显微检测仪器包括激发光照明单元、激发光和荧 光隔离单元、激光扫描单元、显微成像单元、荧光探测单元及控制单元；所述激发光照明单 元包括激光光源、第一扩束镜及第二扩束镜；所述第一扩束镜及第二扩束镜之间设有照明 针孔，且所述照明针孔位于所述第一扩束镜的焦点处；所述激发光和荧光隔离单元包括激 发光滤色片、二色镜及荧光滤色片；所述激光扫描单元包括可绕X轴做往返旋转运动的X 扫描振镜组件及可绕Y轴做往返旋转运动的Y扫描振镜组件；所述显微成像单元。
9、包括扫描 透镜、筒镜、环形光束整形组件及显微物镜，所述环形光束整形组件包括设于所述显微物镜 入瞳位置的环形滤光片，所述环形滤光片具有将激光截止的内环区域和透射激光的环带区 域，且所述内环区域和环带区域均可透射荧光；所述内环区域的半径不小于刚好能发生全 内反射时所述显微物镜入瞳位置的临界半径；所述显微物镜的入瞳位置与所述X扫描振镜 组件的反射面和Y扫描振镜组件的反射面沿光轴线的中间位置相共轭；所述荧光探测单元 包括成像镜头及光电倍增管，所述成像镜头与所述光电倍增管之间设有成像探测针孔，所 述成像探测针孔位于所述成像镜头的焦点处；待观察对象与所述照明针孔和成像探测针孔 处于共轭位置上；所述光电倍增。
10、管可探测荧光，并将所述荧光转换成电信号； 0006 所述第一扩束镜、照明针孔、第二扩束镜、激发光滤色片、二色镜、激光扫描单元、 说 明 书CN 102818795 A 2/4页 4 扫描透镜、筒镜、环形滤光片及显微物镜依次沿始于所述激光光源的光轴线设置；且所述显 微物镜、环形滤光片、筒镜、扫描透镜、激光扫描单元、二色镜、荧光滤色片、成像镜头、成像 探测针孔及光电倍增管依次沿始于由待观察对象激发的荧光光轴线设置； 0007 所述控制单元，与所述激光扫描单元和所述光电倍增管均电性连接，用于同步采 集所述电信号与所述激光扫描单元的位置坐标并进行关联，以生成待观察对象区域图像。 0008 下面对上述技。
11、术方案进一步解释： 0009 所述环带区域的宽度可调节。 0010 所述显微物镜为无穷远消像差型大数值孔径的浸油物镜。 0011 所述控制单元还与所述激光光源电性连接，用于控制激光的波长和功率。 0012 本发明的优点是： 0013 1.本发明提供的生物荧光显微检测仪器在第一扩束镜及第二扩束镜之间且位于 第一扩束镜的焦点处设有照明针孔，在成像镜头和光电倍增管之间且位于成像镜头的焦点 处设有成像探测针孔，有效提高了该仪器的横向分辨率；同时，在位于显微物镜入瞳的位置 设置环形光束整形组件，提高了该生物荧光显微检测仪器在轴向的分辨率。 0014 2.本发明提供的生物荧光显微检测仪器由于入射激光光束经。
12、显微成像单元聚焦 在区域面积约为艾利斑大小的点状区域内，即只有一个面积很小厚度很薄区域内的荧光物 质能够被激发，而其它区域内的荧光物质不会被激发，即从源头上消除了杂散光的来源，因 而具有很高的成像信噪比。 附图说明 0015 图1为本发明实施例提供的生物荧光显微检测仪器结构示意图。 0016 图2为本发明实施例提供的环形滤光片的结构示意图。 0017 图3为本发明实施例提供的环形光束通过显微物镜的光路传播示意图。 0018 图4为本发明实施例提供的激光扫描单元的结构示意图。 0019 其中：激发光照明单元110、激光光源111、第一扩束镜112、第二扩束镜113、照明 针孔114、激发光和荧光。
13、隔离单元120、激发光滤色片121、二色镜122、荧光滤色片123、激光 扫描单元130、X扫描振镜组件131、Y扫描振镜组件132、显微成像单元140、扫描透镜141、 筒镜142、环形光束整形组件143、显微物镜144、环形滤光片1432、荧光探测单元150、成像 镜头151、光电倍增管152、成像探测针孔153、控制单元160。 具体实施方式 0020 请参考图1至图4。图1中标有单向箭头的光路为激光传播光路；标有双向箭头 的光路表示为荧光传播光路。 0021 实施例：生物荧光显微检测仪器100包括激发光照明单元110、激发光和荧光隔离 单元120、激光扫描单元130、显微成像单元140。
14、、荧光探测单元150及控制单元160。 0022 激发光照明单元110包括激光光源111、第一扩束镜112、第二扩束镜113。在第一 扩束镜112和第二扩束镜113之间且位于第一扩束镜112的焦点处设有照明针孔114。 0023 激发光和荧光隔离单元120包括激发光滤色片121、二色镜122、荧光滤色片123。 激发光滤色121片用于接收激光，滤除激光中偏离中心波长的光束，并透射激光中中心波 说 明 书CN 102818795 A 3/4页 5 长处的光束。二色镜122接收并反射经激发光滤色片121透射的激光，并透射荧光。荧光 滤色片123接收并透射经二色镜122透射的荧光，并截止激光。 00。
15、24 激光扫描单元130包括X扫描振镜组件131、Y扫描振镜组件132。X扫描振镜组 件131可绕X轴做往返旋转运动。Y扫描振镜组件132可绕Y轴做往返旋转运动，随着X扫 描振镜组件131、Y扫描振镜组件132的旋转运动，入射激光束反射后的角度也将随之改变。 0025 显微成像单元140包括扫描透镜141、筒镜142、环形光束整形组件143、显微物镜 144。环形光束整形组件143包括环形滤光片1432。该环形滤光片1432设置于显微物镜 144的入瞳位置，具有将激光截止的内环区域A和透射激光的环带区域B。内环区域A和环 带区域B均可透射荧光。显微物镜144的入瞳位置与X扫描振镜组件131的反。
16、射面和Y扫 描振镜组件132的反射面沿光轴线的中间位置相共轭，即X扫描振镜组件和Y扫描振镜组 件置于零视场角位置时图4中过M点垂直光轴的位置与显微物镜144入瞳位置共轭。 0026 荧光探测单元150包括成像镜头151、光电倍增管152。在成像镜头151与光电倍 增管152之间且位于成像镜头151的焦点处设有成像探测针孔153。待观察对象与照明针 孔114和成像探测针孔153处于共轭位置上。光电倍增管152可探测荧光，并将荧光转换 成电信号。 0027 其中，第一扩束镜112、照明针孔114、第二扩束镜113、激发光滤色片121、二色镜 122、激光扫描单元130、扫描透镜141、筒镜142、。
17、环形滤光片1432、显微物镜144依次沿始 于激光光源111的光轴线设置；显微物镜144、环形滤光片1432、筒镜142、扫描透镜141、激 光扫描单元130、二色镜122、荧光滤色片123、成像镜头151、成像探测针孔153、光电倍增管 152依次沿始于待观察对象激发的荧光光轴线设置。 0028 激光光源111发射的准直激光依次经第一扩束镜112、照明针孔114、第二扩束镜 113扩束后形成平行的激光束；该平行激光束依次经激发光滤色片121、二色镜122、激光扫 描单元130、扫描透镜141、筒镜142后经环形光束整形组件143整形为环形光束，该环形光 束经显微物镜144聚集于待观察对象处，。
18、并激发待观察对象产生荧光；该荧光光束依次经 显微物镜144、环形滤光片1432、筒镜142、扫描透镜141、激光扫描单元130、二色镜122、荧 光滤色片123、成像镜头151后聚焦于成像探测针孔153处，光电倍增管152探测该荧光束 并将其转换成电信号。 0029 控制单元160与激光扫描单元130、光电倍增管152电性连接，控制单元160将光 电倍增管152输出的微弱电信号进行放大，并对放大后的电信号进行实时采样，同时控制X 扫描振镜组件131、Y扫描振镜组件132沿X、Y轴往返旋转，使得经显微物镜144形成的聚 焦激光点在X、Y方向能够移动。控制单元160将采集到电信号和激光扫描单元13。
19、0X、Y方 向的位置坐标关联起来，生成了一个区域中荧光物质的图像。控制单元160还电性连接于 激光光源111，用于控制入射激光波长和功率。 0030 在该生物荧光显微检测仪器100中，显微物镜144为无穷远消像差型大数值孔径 的浸油物镜，由于环形光束的内环半径(图2中A区域的半径)不小于显微物镜144刚好 能发生全内反射时入瞳位置处光束的临界半径，且盖玻片200和油300的折射率大致相同， 这样进入显微物镜144的环形光束在盖玻片200和待观察对象所在的组织溶液400的交界 处发生全反射，不能透过盖玻片200进行传播，但会在盖玻片200和组织溶液400的交界处 形成隐失场(图3中C区)，隐失波。
20、能够激发界面附近的荧光分子，产生荧光。调整环形滤 说 明 书CN 102818795 A 4/4页 6 光片1432环带区域B的宽度可以改变穿出盖玻片200的隐失场的分布深度，从而可以改变 荧光物质在Z轴方向的激发深度，可以实现Z轴方向不同分辨率的调节。隐失波的频率与 入射光频率相同，其强度(单位面积和单位时间的能量)随离开界面的垂直距离呈指数衰 减： 0031 I(z)I(0)e -z/d 0032 可以看出，透射电磁场的振幅随进入样品的深度z减小得非常快，这种电磁场只 存在于界面附近一薄层内。d是理论渗透深度，等于从界面处到隐失波强度衰减到界面处数 值1/e的距离，d可表示为： 0033 。
21、d( 0 /4)(n 1 2 sin 2 -n 2 2 ) -1/2 0034 d与入射角()、波长 0 以及组织溶液400折射率(n 2 )和盖玻片200的折射率 (n 1 )有关。d随入射角增大而减小，大小与入射光波长为同一数量级或更小。由于隐失场 的独特特性，使荧光激发的区域非常靠近分界面(约100nm)。这样不会激发距分界面更远 区域的荧光，从而可实现背景噪声极小的荧光成像，使得生物荧光显微检测仪器100在轴 向具有很高的分辨率。 0035 在该生物荧光显微检测仪器100中，通过照明针孔114及成像探测针孔153的联 合使用，实现点对点的照明和点对点的成像。当不考虑噪声的情况下，光学上。
22、常用点扩散 函数描述系统成像分辨率，对于激光扫描共焦系统来说，系统最终的点扩散函数由下式描 述： 0036 PSF tot (x，y，z)PSF ill (x，y，z)PSF det (x，y，z) 0037 其中PSF ill 对应照明激光点在物方的点扩散函数，PSF det 对应成像探测光路的点扩 散函数。由于照明针孔114的作用，入射激光光束通过各单元后在盖玻片200与待观察对 象交界处形成一个很小的点状照明区域(照明方点扩散函数)，成像探测针孔153的使用对 成像探测方点扩散函数进一步整形，使得整个生物荧光显微检测仪器100的成像点扩散函 数由照明方点扩散函数和探测方点扩散函数的乘积组。
23、成，由于乘积后的成像点扩散函数强 度分布范围变窄，因而系统具有很高的横向分辨率。 0038 在该生物荧光显微检测仪器100中由于入射激光光束经显微成像单元140聚焦在 区域面积约为艾利斑大小的点状区域内，即只有一个面积很小厚度很薄区域内的荧光物质 能够被激发，而其它区域内的荧光物质不会被激发，即从源头上消除了杂散光的来源，因而 系统具有很高的成像信噪比。 0039 当然本发明的生物荧光显微检测仪器还可具有多种变换及改型，并不局限于上述 实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说 显而易见的变换或替代以及改型。 说 明 书CN 102818795 A 1/2页 7 图1 图2 说 明 书 附 图CN 102818795 A 2/2页 8 图3 图4 说 明 书 附 图CN 102818795 A 。